（天津医科大学代谢病医院内分泌研究所 天津 300070）
【摘要】 NADPH氧化酶的非吞噬细胞氧化酶（non- phagocytic cell oxidase，NOX） NOX的蛋白家族广泛分布于体内多种非吞噬细胞，目前研究认为其核心结构蛋白NOX2是β细胞ROS 产生的主要来源。生理状态下NOX产生的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）有控制新陈代谢，调节葡萄糖刺激的胰岛素分泌等重要作用，高糖、高脂等异常状态下导致的ROS堆积则可能抑制胰岛素分泌，并可能通过JNK、PI3K等信号通路诱导胰岛β细胞凋亡，在糖尿病的发生、发展中，发挥重要作用。因此，研究NOX2对β细胞的作用及其机制，可能成为改善机体内氧化应激水平，有效防治糖尿病寻找到新的途径和方法。
【关键词】NOX家族；NOX2；氧化应激；β细胞；糖尿病
【中图分类号】R394 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）09-0385-03
NADPH（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）氧化酶最早是在吞噬细胞中被发现的，它是细胞内一种重要的辅酶，能催化NADPH的电子转移到氧分子产生超氧化物。早期在吞噬细胞内发现了NADPH氧化酶，它是由gp91phox,p22phox，p40phox，p47phox，p67phox以及小分子GTP酶结合蛋白Rac组成的酶复合体[1]。通常情况下，吞噬细胞中的NADPH氧化酶是静止的，当受到细胞外信息：如激素、细胞因子、炎症因子等一系列物质的刺激时，胞浆中的p40phox，p47phox，p67phox和Rac与膜上p22phox富含脯氨酸的部分结合形成酶复合体，从而使gp91phox的构像发生变化，并通过诱导电子的跨膜转动激活该酶，从而发挥生物学作用。后来在非吞噬细胞中发现了在不同种类的细胞中发现了一系列gp91phox的同源物，分别称其为NOX1，NOX2（gp91phox），NOX3，NOX4，NOX5，DUOX1和DUOX2（dual-function oxidase，Duox1 and Duox2），后来被命名为NADPH氧化酶的非吞噬细胞氧化酶（non-phagocytic cell oxidase，NOX）NOX的蛋白家族。NOX家族主要分布在内皮细胞等多种非吞噬细胞中，其主要生物学功能是产生活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），以维持细胞正常的生理活动。异常情况下，身体受到外界多种因素的刺激时，可导致NOX家族蛋白的异常表达或活化，从而细胞内产生大量的ROS，最终参与了许多种疾病比如高血压、动脉粥样硬化、糖尿病、炎症等疾病的发生和进展过程。近年的研究结果发现NOX2是β细胞内ROS产生的主要来源，可能经过多条信号通路导致β细胞凋亡，因此，对NOX2与β细胞的关系进行深入研究对探索糖尿病的发生、发展机制，寻求预治措施有重要的临床意义和社会价值。
1.NOX家族的成员以及活化
目前已知的NOX蛋白家族有七个成员组成，根据它们的结构特点不同，其在活化以及功能上存在差异，根据蛋白分子结构将人为地将它们分为3个组：第1组为NOX1至NOX4，它们由两大结构域组成，C末端伸向细胞浆内，N末端为疏水跨膜区，而其中C末端分别存在NADPH-和FAD-的结合位点；N末端6个高度保守的跨膜结构域，跨膜部分Ⅲ和Ⅴ包含两个组氨酸，形成不对称的亚铁血红素；第2组为NOX5，除了包含NOX1-NOX4的结构域外，在N末端还存在有4个被认为是钙离子（Ca2+）的结合位点的EF手形结构域；第3组是Duox氧化酶，它不仅包含NOX1-NOX5的结构域（与NOX5不同的是有2个EF手结构），而且还在N末端有1个髓过氧化物酶样胞外域，即第7个跨膜区，因此也叫双功能氧化酶[2]（图1）。
图1 所有的NOX家族成员均有6个高度保守的跨膜结构域，跨膜部分Ⅲ和Ⅴ包含两个组氨酸，形成不对称的亚铁血红素。细胞质内的COOH末端包含保守的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和NADPH结合域。NOX酶被认为是单电子转运体，将电子从NADH转运到FAD。
当身体受到外界刺激时，NADPH氧化酶的胞质亚基p47phox发生磷酸化，从而导致其构象发生改变，分子间的紧密结合被打开，其自动抑制区（auto-inhibitory region，AIR）被释放，同时Src同源3结构区（Src homology 3，SH3）和吞噬细胞氧化酶区（phagocytic cell oxidation，PX）暴露出来，接着p67phox利用其C末端的SH3区结合p47phox的PRR （prolinerich region，PRR）区，使得磷酸化的p47phox结合p67phox，p40phox和Rac靠近细胞膜，最后利用N末端暴露的SH3区与伸向细胞质中的p22phox的PRR区相结合，最终实现了胞膜亚基与胞质亚基在细胞膜上的集合与装配，最后在细胞膜上形成活化了的NADPH氧化酶复合体，最终发挥其生物学功能[2]（图2）。
图2 受外界环境激活后，Rac1 GDP转换为Rac1 GTP，与p67phox结合成复合体转位到细胞膜。有证据表明，p47phox磷酸化也能触发其转位至细胞膜形成NOX酶复合体。
2.NOX2与β细胞
NOX是线粒体外ROS产生的主要来源。目前的多项研究结果已经表明，氧化应激与心血管疾病、肿瘤和糖尿病等多种疾病密切相关。近年来Ismial Syed等通过对2型糖尿病ZDF鼠及人胰岛的研究显示NOX2是β细胞ROS产生的主要来源，氧化应激是糖尿病及并发症的共同土壤，因此NOX2在β细胞及糖尿病发病中的作用也日益受到重视，成为目前研究的热点。在正常情况下，NOX产生少量的ROS，在维持胰岛正常的生理过程中有十分重要的作用，但如果受到高糖、高脂等因素的影响，NOX被异常激活，NOX将催化其作用底物NADH或NADPH使得ROS的产生明显增加，进而激活解耦联蛋白2并促进其基因表达，最终使ATP生成减少，ATP是胰岛β细胞分泌所必须的，因此导致胰岛β细胞对葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能障碍。过多的ROS还可以抑制胰岛素的转录以及翻译等，同时下调PDX-1（duodenal homeobox-1）、肌腱膜纤维肉瘤癌基因同系物A（v-maf musculoaponeurotic fibrosareoma oncogene homologue A，MafA）等转录因子，使胰岛素的编码基因表达减弱，最终影响胰岛β细胞分泌功能[3]。而抑制NOX2的水平可能通过cAMP/PKA通路减弱ROS堆积导致的胰岛素分泌减少[4]。NOX2是NOX家族的核心成员，近年研究发现基因敲除NOX2使NOX2水平下降后可保护链脲霉素（STZ）导致的β细胞损[5]。Syed I等通过对2型糖尿病ZDF鼠及人胰岛进行的研究显示NOX2是β细胞ROS产生的主要来源[6]，对INS-1 832/13 细胞系的研究显示高糖毒性可导致细胞内NOX2的激活[7]。
既往研究结果表明高糖、高脂及炎症状态下，胰岛β细胞中NOX2被激活后ROS水平上升，线粒体功能异常，细胞色素c释放至细胞质，激活caspase，促使β细胞发生凋亡。此外，PI3K信号通路也参与了此过程，在高糖、高脂条件下，磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）的活性受到抑制，下游的 GSK-3、caspase-9和Bad受到抑制，进而活化caspase-3，导致胰岛β细胞凋亡的发生[8,9]。此外，体外研究发现，IL-1β、IFN-γ等炎症因子可增加β细胞中诱导型一氧化氮合酶的表达，导致NOX被激活，使NO和超氧阴离子生成明显增加，进而导致胰岛β细胞功能障碍和细胞凋亡发生[8]。Huiping Yuan等的研究结果显示NOX2衍生的ROS经JNK、P38MAPK、P53途径介导游离脂肪酸诱发的β细胞凋亡[10]，2012年Juan Jiao等的研究结果也显示，用siRNA干扰NOX2表达后可减少VLDL引起的β细胞功能异常和凋亡[11]。应用特异性的Rac1抑制剂如NSC23766、NOX2抑制剂如夹竹桃素（Apocynin）或DPI、JNK抑制剂SP600125对该信号通路进行抑制可明显减少NOX2的表达并能明显减少β细胞凋亡[12]。此外，近年研究发现应用 Exendin4或Liraglutide可通过抑制NOX2-JNK、PKA、PI3K等信号通路减少TNF-α或氧化应激等诱导的β细胞凋亡[13-16]。
3.问题与展望
近年来NOX与胰岛β功能、细胞凋亡等的密切关系，已经受到越来越多的关注，因此对于NOX尤其是NOX2与β细胞发病机制的研究，成为研究的热点。但是，有关NOX活性的相关调节机制以及其促进ROS产生的机制，以及在β细胞凋亡中的具体作用机制等，目前还有很多未知数。目前临床应用中虽发现部分药物如维生素C、ACEI、GLP-1类似物等有部分抑制NOX2的作用，能减少ROS产生，但均缺乏特异性。而NOX2的特异性抑制剂如夹竹桃素和DPI等，目前仅在实验研究中应用，其临床安全性和有效性有待进一步研究。因此，寻找以NOX2为作用靶点的特异性药物，可能为防治糖尿病找到新的方法和途径。
【参考文献】
[1] Kleniewska P，Piechota A，Skibska B，et al．The NADPH oxidase family and its inhibitors[J].Arch Immunol Ther Exp(Warsz)，2012，60(4):277-294 .
[2] Bedard K，Krause KH．The Nox family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology[J]．Physiol Rev，2007，87(1):245-313.
[3] Morgan D，Rebelato E，Abdulkader F，et al．Association of NADPH oxidase with glucose-induced insulin secretion by pancreatic beta-cells[J]．Endocrinology，2009，150(5):2197-220.
[4] Ning Li,Bin Li,Thierry Brun,et al.NADPH Oxidase NOX2 Defines a New Antagonistic Role for Reactive Oxygen Species and cAMP/PKA in the Regulation of Insulin Secretion,Diabetes,2012;61:2842-2850.
[5] Fu-Li Xiang，Xiangru Lu，et al.NOX2 Deficiency Protects Against Streptozotocin-Inducedβ-Cell Destruction and Development of Diabetes in Mice.Diabetes，2010，59:2603-2611.
[6] Syed I，Kyathanahalli C N，Jayaram B，et al．Increased phagocyte-like NADPH oxidase and ROS generation in type 2 diabetic ZDF rat and human islets:role of Rac1-JNK1/2 signaling pathway in mitochondrial dysregulation in the diabetic islet[J]．Diabetes，2011，60(11):2843-2852.
[7] Mohammed AM，Kowluru A.Activation of apocynin-sensitive NADPH oxidase (NOX2)activity in INS-1 832/13 cells under glucotoxic conditions.Islets.2013，21;5(3).
[8] Subasinghe W，Syed I，Kowluru A．Phagocyte-like NADPH oxidase promotes cytokine-induced mitochondrial dysfunction in pancreatic β-cells:evidence for regulation by Rac1[J]．Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2011，300(1):12-20.
[9] Subasinghe W，Syed I，Kowluru A．Phagocyte-like NADPH oxidase promotes cytokine-induced mitochondrial dysfunction in pancreatic β-cells:evidence for regulation by Rac1[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2011，300(1):12-20.
[10] Huiping Yuan,Xiaoyong Zhang,Xiuqing Huang, et al.NADPH Oxidase 2-Derived Reactive Oxygen Species Mediate FFAs-Induced Dysfunction and Apoptosis of β-Cells via JNK,p38 MAPK and p53 Pathways,PLoS One. 2010;5(12):15726.
[11] Juan Jiao, Lin Dou, Miao Li,et al.NADPH oxidase 2 plays a critical role in dysfunction and apoptosis of pancreatic b-cells induced by very low-density lipoprotein. Mol Cell Biochem ,2012, 370:103-113.
[12] Ismail Syed，Chandrashekara N，et al.Role of Rac1–JNK1/2 Signaling Pathway in Mitochondrial Dysregulation in the Diabetic Islet.Diabetes，2011，60:2843-2852.
[13] Tews D，Lehr S，Hartwig S，et al.Anti-apoptotic action of exendin-4 in INS-1 β cells:comparative protein patternanalysis of isolated mitochondria. Horm Metab Res，2009，41(4):294-301.
[14] Natalicchio A，De Stefano F，Orlando MR，et al. Exendin-4 prevents c-Jun N-terminal protein kinase activation by tumor necrosis factor-α(TNFα)and inhibits TNFα-induced apoptosis in insulin-secreting cells. Endocrinology，2010，151(5):2019-29.
[15] Brubaker P L，Drucker D J．Glucagon-like peptides regulate cell proliferation and apoptosis in the pancreas,gut,and central nervous system[J].Endocrinology，2004，145(6):653-659．
[16] Hui H，Nourparvar A，Zhao X，et al.Glucagon-like peptide-1 inhibits apoptosis of insulin-secreting cells via a cyclic 5'-adenosine monophosphate-dependent protein kinase A-and a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway.Endocrinology，2003，144(4):1444-558.
天津医科大学代谢病医院内分泌研究所，卫生部激素与发育重点实验室，天津市代谢性疾病重点实验室， 300070，13820149079，dingmin-006@163.com。天津市卫生局科技基金，项目编号2015KZ092。
论文作者:丁敏,王鹏华,于德民
论文发表刊物:《医药前沿》2017年3月第9期
论文发表时间:2017/4/5
标签：细胞论文; 氧化酶论文; 胰岛论文; 糖尿病论文; 凋亡论文; 蛋白论文; 家族论文; 《医药前沿》2017年3月第9期论文;