【摘要】 目的：建立猴支气管上皮细胞的原代培养方法，为进一步研究肺癌的发生机制奠定基础。方法：体视显微镜下分离猴支气管粘膜层，用IV胶原酶消化粘膜层并培养猴原代支气管上皮细胞，采用鼠抗人角蛋白单克隆抗体(CK14)鉴定支气管上皮细胞。结果：IV型胶原酶消化法成功培养猴原代支气管上皮细胞，使用鼠抗人角蛋白单克隆抗体成功鉴定所培养细胞为原代支气管上皮细胞。结论：该方法是进行猴支气管上皮细胞原代培养的可行且有效的方法。
【中图分类号】R734.2 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2017）25-0023-03
A method for the primary culture and identification of primary bronchial epithelial cells from monkey
Zhu Jing,Wu Youru. Department of Respiratory Medicine, Center Hospital of Mianyang, Mianyang 621000,China
【Abstract】Objective To establish a feasible method to culture primary bronchial epithelial cells from monkey,and therefore to provide experiment data for the investigation of the pathogenesis of pulmonary tumor. Method The epithelium carefully dissected away from the underlying tissue through a stereomicroscope was digested by the type IV collagenase. The bronchial epithelial cells are subcultured, frozen and identified by the cytokeratin14 antibody from the mouse. Result The bronchial epithelial cells are subcultured,frozen and identified by the cytokeratin14 antibody from the mouse. Conclusion By the way of the dissection and digestion of the epithelium.we succeed in culturing the monkey bronchial epithelial cells.
肺癌绝大部分（80%～90%）来源于各级支气管上皮，正常支气管上皮细胞的分离和培养也就成了进行癌基因致肿瘤研究的关键。然而，大多数作纤维支气管镜检查人的支气管上皮细胞都存在一些急性或慢性病变，因此，从与人类同源性最好的猴体内分离和培养原代支气管上皮细胞是研究原癌基因致肺癌机理的良好模型。本实验经过反复摸索，成功建立了分离支气管粘膜层，使用IV型胶原酶消化法做支气管上皮细胞（HBEPiC，human bronchial epithelial cell）原代培养的方法，为进一步研究非小细胞肺癌的发生奠定了实验基础。
1.材料与方法
1.1 实验动物
雄性猴子一只，体重5公斤(2500kg)，合格证号0000974。
1.2 材料和试剂
DMEM培养基、0.25%胰酶/EDTA、胎牛血清(FBS)（美国 Gibco公司）；支气管上皮细胞生长培养基(HBEPiC MEDIUM)（美国Sicience Cell公司）；青霉素钠、硫酸链霉素（华北制药股份有限公司）；鼠抗人角蛋白单克隆抗体CK14抗体（abcam公司）；鼠尾胶原（millipore公司）；
1.3 实验方法
1.3.1支气管上皮细胞的分离
（1）深度麻醉猴子后分离出主气管及2～3级支气管，将取下的支气管迅速转入10%双抗浓度的DMEM培养基中，冰上运输至实验室。
（2）置于超净台后，PBS冲洗两次，将其剪成1cm2大小平放于加有培养基及双抗的培养皿中。
（3）在体视显微镜下用尖镊轻轻分离气管粘膜层，将分离出的粘膜层剪碎后用2mg/ml的IV胶原酶37℃孵箱消化1h，粘膜层被消化成絮状后（约1.5h），用0.22?m滤网过滤以除去组织块，含上皮细胞的消化液过滤至15ml的离心管中，室温下离心1000r/min×5min，弃上清，用HBEPiC培养液再洗涤细胞2 次以去除残余的IV型胶原酶。
（4）用HBEPiC培养液配制成细胞悬液，锥虫蓝拒染法检测细胞活力。将细胞接种于预先用鼠尾胶原打底的6cm培养皿中，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。
1.3.2支气管上皮细胞的培养 由于支气管上皮细胞贴壁性不强，将细胞接种于预先打底的培养皿后，第二天仍置于孵箱原位置中。第三天将培养皿从孵箱轻轻拿出来后在显微镜下观察上皮细胞贴壁和生长情况，并换液8ml，此后2～3日换液一次。
1.3.3支气管上皮细胞的传代及冻存
（1）支气管上皮细胞的传代：当细胞生长达到90%融合时传代。传代时，用吸管吸出培养液，PBS洗涤板孔2次,加入0.025%胰酶/EDTA 37℃消化约3～5min，倒置相差显微镜下见大部分细胞变圆脱壁后加入含血清的DMEM培养液终止消化，吸管反复吹打板底使细胞脱壁均匀悬浮，取细胞悬液，1000r/min离心10min，弃上清，用HBEPiC培养基混悬细胞，调整细胞密度传代培养于新的培养皿中。
（2）支气管上皮细胞的冻存：冻存细胞时，将支气管上皮细胞按照上述方法消化离心后用预冷的冻存液1ml混悬收集于1.5ml冻存管，在程序梯度降温仪中缓慢冷冻，最后置于液氮中保存。
1.3.4支气管上皮细胞的鉴定
行支气管上皮细胞角质蛋白CK14免疫荧光染色。主要步骤为：
（1）将细胞接种于预先打底的盖玻片上；
（2）4%多聚甲醛+1%tritonX-100等体积混合，固定打孔15～30min；
（3）PBS洗三次，每次5min；
（4）3% BSA，0.5%tritonX-100封闭30min室温；
（5）PBS洗三次，每次5min；
（6）一抗（1：200）；（3%BSA，0.1%tritonX-100稀释）4℃ 过夜；
（7）PBS洗三次，每次5min；
（8）二抗（1：800），（3%BSA，0.1%tritonX-100稀释）避光，室温1h；
（9）PBS洗三次，每次5min；
（10）DAPI(1:4000)，1～2min；
（11）PBS洗三次，每次5min；
（12）甘油封片，正置荧光显微镜下观察。
2.结果
2.1 支气管上皮粘膜的分离及消化
将从支气管剥离下来的粘膜置于倒置显微镜下观察，可观察到粘膜的上皮层和固有层结构，此为气管上皮的特征之一，见图1。粘膜用2mg/ml的IV型胶原酶37℃消化1h，原有的上皮层和固有层结构消失，上皮细胞与胶原分离后呈白云絮状，见图2。
图1 支气管的粘膜层
图2 粘膜层被胶原酶消化后
2.2 支气管上皮细胞的生长状态和形态特征
先分离出粘膜层，再用IV型胶原酶消化法培养的原代细胞为单一的气道上皮细胞。原代接种后7～9d细胞增殖加速，约14d后细胞长满，融合细胞形态、大小均一，密集排列呈铺路石样，见图3。原代培养的支气管上皮细胞2～3代生长、分裂能力旺盛，此后逐渐减退，见图4。
图3 原代支气管上皮细胞 （第7天，×10）
图4 第二代支气管上皮细胞 （第7天，×4）
2.3 原代支气管上皮细胞的鉴定
细胞在鼠抗人角蛋白单克隆抗体(CK14)作用后，经FITC(异硫氰酸荧光素)和DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)染色，在激光共聚焦显微镜下可见，所有的细胞浆呈绿色荧光，见图5，细胞核呈蓝色荧光，见图6，胞浆呈绿色荧光而胞核呈蓝色荧光的细胞即为上皮细胞，见图7。
图5 CK14在细胞质中表达 （×60）
图6 DAPI染细胞核 （×60）
图7 免疫荧光效果图 （×60）
3.讨论
分离气管—支气管上皮细胞，常用的方法有酶消化法、机械刷洗法、组织块法。Lordan等[1]成功建立了经纤支镜刷检人支气管上皮细胞原代培养的方法，但大多数作纤维支气管镜检查人的支气管上皮细胞都存在一些急性或慢性病变，且通过无菌细胞刷刷取的细胞数有限，因此机械刷洗法未广泛应用。Dirksen等利用组织块法培养出了兔气管纤毛细胞，但由于在反复剪切和接种过程中对组织块的损伤，并不是每个小块都能长出细胞，导致组织块培养法的失败。
酶消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。酶本实验采用了机械剥离黏膜加酶消化法[2-3]，其优点是作用温和、细胞损伤小、所获细胞纯度高，仅将剥离的粘膜层用IV型胶原酶消化，避免因支气管的粘膜下层和浆膜层被消化而导致过多的成纤维细胞混入。
正常上皮细胞的培养较为困难，往往以成纤维细胞的大量增殖而告终。细胞培养的血清常含有抑制上皮细胞生长但可刺激成纤维细胞生长的TGF-β1等因子[4]。Formanek等[5]研制的上皮细胞无血清培养液具有抑制成纤维细胞增殖和促进上皮细胞生长的优点。在一般培养条件下，支气管上皮细胞的生长期一般为7d，而在无血清完全培养基中，由于有牛血清白蛋白、牛垂体提取物和上皮生长因子的支持，细胞生长旺盛，5d后能传代，直到15d终止培养时仍未见到细胞出现明显衰退性改变。因此，本实验的无血清完全培养系统可以使猴支气管上皮细胞长时间维持在增殖阶段，延缓衰退，增强细胞的生存能力。同时，本实验采用体视显微镜下分离出粘膜层将其消化和采用无血清培养液，为避免成纤维细胞生长提供了双重保障，在培养皿中未见成纤维细胞的生长。
【参考文献】
[1] Lordan JL,Bucchieri F,Richter A,et al.Cooperative effects of Th2 cytokines and allergen on normal and asthmatic bronchial epithelial cells [J].J Imm unol, 2012,169(1):407-414.
[2] Kondo M,Finkbeiner WE,Widdicombe J H 1 Simple technique for culture of highly differentiated cells from dog tracheal epithelium AmJ Phys iol,1991, 261(2 Pt 1) : L106
[3] Rowe RK,Brody SL,Pekosz A1 Differentiated cultures of primary hamster tracheal airway epithelial cells 1 In Vitro Cell Dev Biol Anim,2013d, 40(10):303
[4] Masui T,Wakefield LM,Lechner JF,et al.Type beta transforming growth factor is the primary differentiation-inducing serum factor for normal human bronchial epithelial cells[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 83(8):2438-2432.
[5] Formanek M,MillesiW,Willheim M,et al.Optimized growth medium for primary culture of human oral keratinocytes[J].Int J Maxillof ac Surg,2006,25(2):157-160.
论文作者:朱静,吴友茹（通讯作者）
论文发表刊物:《心理医生》2017年25期
论文发表时间:2017/10/25
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