顾起宏, 朱美玲, 王明丽[1]2007年在《培养的兔角膜缘上皮细胞深低温保存后的生物学活性研究》文中研究指明目的探讨深低温保存角膜缘上皮细胞的可行性和效果。方法将兔角膜缘组织培养出的细胞,分别用两组冷冻保护液冻存,0.5、1、2个月后分批取出。将未冷冻的细胞和不同冻存时间、不同冻存保护液的冷冻复苏后细胞传代培养,采用免疫组化、电镜鉴定培养后细胞的性质。通过倒置显微镜、电镜、MTT比色法来比较传代培养的角膜缘上皮细胞深低温保存前后的形态结构和生物学活性。结果AE1和传代细胞鼠抗兔增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体染色呈阳性反应,AE5单克隆抗体染色偶见阳性反应;冻存后的传代细胞贴壁、生长均滞后,而且电镜检查均有不同程度细胞水肿,再培养7d后形态结构均恢复正常;MTT法检测复苏当天冻存后的细胞比未冻存的细胞增殖活性低,差异显着(P<0.05,但培养5d后无显着差异(P>0.05),甘油组和DMSO组间有显着性差异(P<0.05),不同冻存时间的各冻存组测得值无显着差异(P>0.05)。结论冻存的角膜缘上皮细胞传代培养仍保持上皮细胞特性并含有干细胞;DMSO保护液比甘油液低温保存效果好;角膜缘上皮细胞经阶段降温后深低温保存简单可行,选择适当的冷冻保护剂冻存后的细胞再培养,其细胞活性和结构与原代相似。
顾起宏[2]2004年在《培养的兔角膜缘上皮细胞深低温保存后的生物学活性研究》文中提出目的 通过对培养后的角膜缘上皮细胞进行深低温保存，检测复苏后细胞的结构和功能，来探讨深低温保存角膜缘上皮细胞的可行性和效果。 方法 实验室阶段：(1)角膜缘上皮细胞的培养：将切取的兔角膜缘组织剪成1mm×1mm小组织块，经消化酶处理后培养在12孔板中，培养细胞至形成单层；(2)角膜缘上皮细胞的深低温保存和复苏：形成单层的细胞消化后制成悬液，分别用两组冷冻保护液：A组为32.5％F12+32.5％DMEM+20％小牛血清+15％甘油；B组为90％小牛血清+10％二甲基亚砜(DMSO)按阶段降温保存在液氮里，冻存半月、1月和2月分批取出，进行复温和复温后处理；(3)深低温保存前后的角膜缘上皮细胞的传代培养和鉴定：将未冷冻的细胞和不同冻存时间、不同冻存保护液的冷冻复苏后细胞制成的悬液传代至无上皮细胞的羊膜上再培养，采用免疫组化、电镜鉴定培养后细胞的性质；(4)深低温保存前后的角膜缘上皮细胞活性比较：通过倒置显微镜、电镜、MTT比色法、台盼兰染色来比较传代培养的角膜缘上皮细胞深低温保存前后的形态结构和生物学活性。 动物实验阶段：将40只角膜缘干细胞损伤的模型兔随机分成单纯羊膜组、未冷冻细胞组、DMSO保存细胞组和甘油保存细胞组，每组10只，用传代培养2周后的角膜缘上皮细胞作移植实验，观察细胞体外功能完成情况来进一步比较深低温保存前后角膜缘上皮细胞的活性。 结果 (1)传代细胞免疫组化结果显示：鼠抗兔增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体、AE1单克隆抗体染色呈阳性反应，AE5单克隆抗体染色偶见阳性反应；(2)深低温保存前后的角膜缘上皮细胞活性比较：传代细胞冻存后的比未冻存的贴壁、生长均滞后1～2天，未冻存细胞约10天左右形成单层，而DMSO保护液组需要12～14天，甘油保护液组难形成良好单层；深低温保存后的细胞电镜检查均有不安徽医科大学硕士学位论文同程度细胞水肿，甘油组损伤较重，再培养7天后形态结构均恢复正常;MTT法和台盼蓝染色比较冻存前后细胞的增殖活性和存活率，结果显示复苏当天冻存后的比未冻存的细胞检测值低，差异显着(尸<0.05，但培养5天后无显着差异(P>0.05)，甘油组和DMSO组间有显着性差异(尸<0.05)，各冻存组不同冻存时间测得值无显着差异(尸>.05);(3)传代培养细胞同种异体移植表明:移植细胞组动物术眼4周后的AES染色阳性，PAS染色阴性或弱阳性，移植羊膜组AES染色阴性，PAS染色弱阳性;冷冻后细胞移植术后角膜评分高于未冷冻细胞，其中未冷冻细胞与DMSO保存细胞组比较，差异无显着性(尸>0.05)，和甘油保存细胞组相比差异有显着性(尸<0.05)。结论角膜缘上皮细胞深低温保存后仍保持上皮细胞特性，传代培养后细胞中含有较多有高增殖力的干细胞;DMSO保护液比甘油保护液低温保存效果好;角膜缘上皮细胞经阶段降温后深低温保存简单可行，选择适当的冷冻保护剂冻存后的细胞再培养，其细胞活性和结构与原代相似。
沈培清[3]2008年在《以兔浅层角膜基质为载体体外培养角膜缘上皮细胞深低温保存后生物学活性研究》文中研究表明目的通过对培养于浅层角膜基质上的角膜缘上皮细胞进行深低温保存,检测复苏后细胞的结构及活性,将细胞培养片移植到角膜缘干细胞严重损伤的异体模型兔角膜缘,并观察移植治疗效果,为角膜基质载体上培养的角膜缘上皮细胞应用于临床提供实验依据。方法实验室阶段:(1)角膜缘上皮细胞的原代培养:将切削的兔浅层角膜缘组织剪成1mm×1mm大小组织块,用含20%胎牛血清的细胞培养液培养于细胞培养瓶中,至细胞形成单层;(2)角膜缘上皮细胞种植于去上皮浅层角膜基质上传代培养:将原代培养的细胞经VTP(0.25%胰酶和0.02%EDTA V:V=1:1)消化制成单细胞悬液,滴加在去上皮浅层角膜基质载体上继续培养至细胞形成2～3层;(3)载体上培养的角膜缘上皮细胞深低温保存:将培养于角膜基质载体上的角膜缘上皮细胞放入冷冻保存液中按阶段降温保存在液氮罐中,冷冻保存液由90%胎牛血清+10%二甲基亚砜(DMSO)配成;(4)原代培养的角膜缘上皮细胞鉴定:采用倒置显微镜、电镜及免疫细胞化学染色鉴定培养的细胞的性质;(5)深低温保存前后载体上角膜缘上皮细胞形态比较及鉴定:通过倒置显微镜、电镜、HE染色及免疫细胞化学染色来比较培养的角膜缘上皮细胞的形态结构及生物学活性。动物实验阶段:将30只白兔制成角膜缘干细胞损伤模型,随机分成角膜基质组、新鲜培养细胞组及培养细胞深低温保存组,每组10只,分别用单纯的角膜基质、未冷冻及冷冻后的培养有角膜缘上皮细胞的角膜基质载体做移植实验,观察移植后一段时间受体角膜的眼表改变。结果(1)原代培养的角膜缘上皮细胞经VTP消化制成单细胞悬液,接种于去上皮浅层角膜基质载体上继续培养,细胞生长良好并能很好地附着在角膜基质载体上,传代培养第14天,载体上细胞可形成2～3层,经增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体免疫细胞化学染色呈阳性反应;(2)深低温保存前后角膜缘上皮细胞形态学变化和活性状况有所差异:倒置显微镜下观察可见冷冻复苏后细胞呈圆球形,与基质载体疏松相连,继续培养4～5天后,细胞渐伸展呈多边形,复苏后培养期间可见部分细胞脱落死亡;透射电镜检查也显示冻存后细胞的超微结构与未冻存培养细胞相比有轻度改变;(3)同种异体移植实验:兔角膜缘干细胞损伤模型制作术后5周,可见角膜大量新生血管长入并伴有结膜上皮入侵。以基质载体培养的角膜缘上皮细胞未冷冻及冷冻复苏后培养一周移植,移植术后一月,损伤角膜表面逐渐上皮化,角膜新生血管仅限于角膜缘,而对照组(仅移植角膜基质)术后一月,角膜上皮细胞仍然缺失,新生血管未见明显变化。结论以浅层角膜基质为载体进行角膜缘上皮细胞培养,可培养出复层上皮细胞,经深低温保存后仍保持上皮细胞特性并具有高增殖能力,可用来作异体角膜缘移植治疗角膜缘功能缺陷的角膜病。
参考文献：
[1]. 培养的兔角膜缘上皮细胞深低温保存后的生物学活性研究[J]. 顾起宏, 朱美玲, 王明丽. 临床眼科杂志. 2007
[2]. 培养的兔角膜缘上皮细胞深低温保存后的生物学活性研究[D]. 顾起宏. 安徽医科大学. 2004
[3]. 以兔浅层角膜基质为载体体外培养角膜缘上皮细胞深低温保存后生物学活性研究[D]. 沈培清. 安徽医科大学. 2008
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