肖华胜[1]1999年在《外周神经损伤后大鼠背根节中基因的克隆和表达》文中认为外周神经损伤后大鼠背根节中许多基因的表达发生了明显改变，以往主要采用原位杂交和免疫组织化学方法研究从正常组织中克隆的基因的表达改变，虽然发现了一些表达增加的物质，如甘丙肽、神经肽Y和神经肽Y的受体等神经肽和受体，以及一氧化氮合酶等，但是已有的研究结果还不能充分解释外周神经损伤后病理现象的分子和细胞机制，特别是慢性痛机制。本研究应用多种差异表达基因克隆技术，克隆在外周神经损伤后背根节中差异表达的基因。 首先，针对电生理实验提示的外周神经损伤后背根节中可能存在至少一种高表达的神经降压肽受体，最近神经降压肽受体2型被克隆，我们用原位杂交技术研究了神经降压肽受体2型在背根节中的分布和外周神经损伤后对它表达的影响。发现神经降压肽受体2型主要在大细胞中表达，有11％的神经元含神经降压肽受体2型mRNA，损伤后含这种神经降压肽受体mRNA的背根节神经元数目明显减少。神经降压肽受体2型同背根节小神经元中的神经降压肽受体1型一样仍然是表达降低的受体。该结果再次提示用组织化学研究方法已难以深入了解外周神经损伤后背根节中高表达的信息分子。 第二，我们探讨了联合应用差异表达基因克隆技术来进行研究，这些技术包括差异显示PCR(DD-PCR)、构建cDNA文库、差异筛库和差减杂交。应用DD-PCR技术和针对G蛋白偶联受体的第Ⅵ跨膜区段的四条简并引物，克隆了外周神经损伤后在背根节中高表达的
肖华胜, 韩泽广, 张方雄, 黄秋花, 陆莹谨[2]2001年在《正常和外周神经损伤后大鼠背根节基因表达谱的建立及差异基因的克隆》文中提出本研究以坐骨神经损伤为动物模型,构建了高质量的正常组和损伤组背根节cDNA文库,并展开了大规模的EST测序,结合cDNA microarray分析,建立了外周神经损伤前后背根节的表达图谱,着重对背根节中表达的离子通道、受体、生长相关蛋白、神经肽进行了分析。在背根节中表达了不同种类的离子通道,如钠通道、钾通道、氯通道、钙通道或同一通道的
曲玉娟[3]2016年在《TRPV4-MAPK通路在大鼠背根神经节持续受压致神经病理性疼痛中的作用机制研究》文中研究表明背景神经病理性疼痛(Neuroapthic pain, NP)在2008年被国际疼痛学会(Intrenational Association for the Study of pain, IASP)下设的神经病理性疼痛特别兴趣小组(NeuPSIG)将神经病理性疼痛更新定义为由躯体感觉系统的损害或疾病导致的疼痛。神经病理性疼痛按照损伤部位可分为周围性疼痛及中枢性疼痛两种类型。常见的周围性神经病理性疼痛有：三叉神经痛、根性神经病变(颈、胸或腰骶)、带状疱疹后神经痛、糖尿病周围神经病变、嵌压性神经病变(腕管综合征等)、创伤后神经痛、残肢痛等等；常见的中枢性神经病理性疼痛有：脑卒中后疼痛、脊髓空洞症疼痛、脊髓损伤性疼痛、缺血性脊髓病疼痛、压迫性脊髓病(脊髓型颈椎病、肿瘤)疼痛等等。神经病理性疼痛的产生有很多原因,临床特点为：1、自发痛：是指在没有外伤及损伤性刺激的情况下,局部区域可出现疼痛；2、非伤害性刺激即可引起疼痛：疼痛可因为轻微的刺激或微小的温度变化而诱发；3、痛觉过敏-机体对正常致痛刺激可出现较强的痛觉反应；4、疼痛的性质多种多样：疼痛可表现为牵扯样痛、电击样痛、针刺样痛、烧灼样痛等；5、异常感觉：可出现感觉迟钝、麻木、瘙痒感等不适症状。而神经病理性疼痛的发病机制也相当复杂,最主要的原因可能由于神经系统解剖结构的改变以及神经功能受损,从而引起外周和/或中枢敏化、背根神经节或脊髓内的胶质细胞活化、脑干或大脑皮层下行的抑制系统失能、神经元细胞离子通道发生改变等等,从而导致神经损伤、神经源性炎症、神经末梢兴奋性改变、交感神经系统异常以及神经的可塑性改变等等一系列的病理生理变化,最终引发各类的疼痛表现。神经病理性疼痛2008年IASP推荐的诊断标准为：1、疼痛有明确的神经解剖范围；2、病史提示患者的周围或中枢感觉神经系统中存在相关的疾病或损害；3、至少有一项辅助检查证实了疼痛的分布范围符合神经解剖的范围；4、至少有一项辅助检查证实存在疼痛相关的神经系统的疾病或损害。目前,临床上对神经病理性疼痛的治疗效果欠佳,一线用药为加巴喷丁、普瑞巴林等钙离子拮抗剂以及抗抑郁药物,也可给以卡马西平、奥卡西平等钠通道阻断剂或局部给予利多卡因治疗,但临床上约有一半的患者疼痛不能得到有效缓解。根性神经痛是一种临床上较为常见的神经病理性疼痛类型,它的发生是由于脊神经根或神经节受到某些伤害性刺激(如腰椎间盘突出、脊髓肿瘤的压迫、腰椎管狭窄或炎性物质的刺激等)导致神经炎症、兴奋性增强而引起的疼痛。大鼠背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)持续受压(chronic compression of DRG, CCD)模型是实验研究中典型的神经病理性疼痛模型,造模成功后,CCD大鼠可出现自发性的疼痛、机械痛敏、热痛敏和异常疼痛,并且伴随有神经元自发性放电的增加、动作电位降低,且出现电流阈值降低。DRG神经元细胞膜上存在有多种离子通道,其中一种跨膜的离子通道：瞬时感受器电位离子通道家族中香草素受体亚家族4(transient receptor potential vanilloid receptor 4, TRPV4)的作用越来越受到关注。我们前期的研究(国家自然基金项目30472006)发现TRPV4参与了CCD导致的DRG的高兴奋性、痛觉过敏和异常疼痛,乔内注释TRPV4反义核苷酸干扰序列后,CCD导致的疼痛阈值的降低可被部分逆转,而对大鼠的基础疼痛阈值无影响。但TRPV4传导CCD大鼠痛觉过敏和异常疼痛的通路机制和分子基础还有待进一步研究。DRG是感觉信号传入通路上的第一级神经元,CCD模型中DRG神经元持续受压,导致神经元胞体兴奋性增加,电活化之后产生大量持久的异位放电,上行可引起脊髓和高位中枢的敏化,从而引起自发疼痛、痛觉过敏及触诱发痛等神经病理痛症状,所以说,DRG可以称为神经病理性痛的信号源；抑制损伤后DRG神经元的异位放电可以抑制慢性疼痛信号。产生放电的神经纤维主要包括介导刺痛的细的有髓鞘的Aδ类轴突纤维和介导灼痛的无髓鞘的C类纤维,且不同神经纤维在不同状态下的放电形式不同。我课题组先前的实验证明(基金号：81071597),TRPV4参与CCD模型中DRG的异常放电,但其传导异常放电的机制尚未明确；且TRPV4介导的DRG异常放电以哪类纤维为主,以及TRPV4的激活对放电形式的影响都需进一步研究。疼痛的传导起始于背根神经节中的初级感觉神经元,经神经纤维的中枢端将伤害性信息传向脊髓背角,传入神经纤维的中枢端止于脊髓背角的中间神经元,中间神经元再发出上行神经纤维组成脊髓丘脑侧束等痛觉传导束,进一步将伤害性信息上传至背侧丘脑和大脑皮层,经加工整合最后产生痛觉。在CCD模型中,对DRG的慢性压迫,使其缺血、水肿,促进炎性介质释放,引起DRG神经元的兴奋性增高,将伤害性刺激信号传入脊髓背角,进而兴奋脊髓背角,产生痛敏和异常疼痛。脊髓背角神经元的过度兴奋,可能参与CCD后神经病理性疼痛的中枢敏化机制。本课题组前期的研究主要着眼于CCD后的外周敏化机制的研究,但脊髓背角作为伤害性信息传导通路中不可或缺的重要组成部分,亟需进一步的研究。也有研究表明外周组织及神经的炎症使脊髓内TRPV1、TRPA1及TRPM8表达上调,而有关TRPV4在脊髓背角处的变化与疼痛信号传递的研究甚少。外周丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-actived protein kinases, MAPKs)系统广泛存在于神经系统中,主要包括ERK(胞外信号调节激酶)、JNK(c-jun氨基末端蛋白激酶)和p38(高渗甘油反应激酶)三个亚系统,以磷酸化形式来发挥生物效应。MAPK信号通路分子接受细胞表面的受体传递的胞外刺激,并将其转化为胞内的转录和翻译后反应,从而将胞外刺激同胞内关键的调节目标联系起来,在细胞内信号转导通路中发挥关键作用。研究证实,MAPK信号通路与神经病理性疼痛的形成与发展密切相关。在炎性痛、神经瘤疾病、脊髓损伤以及部分神经病理性疼痛模型的病理生理机制中,外周丝裂原活化蛋白激酶家族(ERK、JNK和p38)通过对现有蛋白的表达后修饰以及对一些关键基因在表达时的转录调节,进而以其磷酸化形式来对在外周伤害感受器或者背角神经元产生的痛觉起维持和放大作用,而且局部注射MAPK家族的抑制剂可以明显抑制机械和热痛觉过敏。在CCD大鼠中,p-ERK的表达增加,抑制p-ERK的表达可导致DRG神经元的兴奋性降低。CCD模型中,DRG持续受压后,TRPV4基因、蛋白的表达量增加,低渗溶液和4 α-PDD引起的TRPV4通道开放增加,通过TRPV4的电流内流增加,细胞内钙峰值升高。研究表明,细胞内Ca2+的升高可以使MAPK家族激活和磷酸化,从而介导MAPK发挥其生物作用。如离体和在体研究均证实细胞内Ca2+浓度升高可使p38MAPK激活和磷酸化,从而介导机械痛敏及炎性痛敏。在染色体隐性多囊性肾病中,TRPV4亦可通过调节胆管上皮细胞内Ca2+的水平进而调节B-Raf/ERK的活性和表达。有研究表明C类纤维受到刺激时,ERK和P38发生磷酸化和活化,而A类纤维受到刺激时,ERK亦有部分磷酸化。CCD模型中, p-ERK表达增加,应用U0126抑制p-ERK的表达可导致DRG神经元的兴奋性降低,产生动作电位的电流阈值和平均基强度升高。因此,我们猜测,CCD模型中,TRPV4参与了DRG持续受压所致神经病理性疼痛的外周敏化及中枢敏化机制,其中TRPV4通道的变化可调节MAPK通路的活性和表达,进而调节其在神经病理性疼痛外周敏化中的生物作用。基于以上研究进展,本研究采用神经纤维电生理技术、Real-time PCR、 Western Blot、免疫组织化学及免疫荧光等方法研究TRPV4-MAPK途径在CCD模型所致痛敏和DRG神经元异常放电中的作用,同时研究了脊髓背角内TRPV4蛋白表达及分布的变化,以期为神经病理性疼痛的发生探讨新理论。第一部分：TRPV4-p38 MAPK通路在大鼠背根神经节持续受压致神经病理性疼痛中的作用目的1.研究干预TRPV4及p38 MAPK通路是否会影响大鼠背根神经节持续受压所致神经病理性疼痛。2.研究大鼠背根神经节中TRPV4与p38 MAPK是否存在相互影响关系。方法1.大鼠背根神经节持续受压模型制作采用体重约为180-220g的健康成年雄性Wistar大鼠(购自山东大学实验动物中心),以水合氯醛(0.3ml/l00g体重)腹腔麻醉后,暴露右侧L4及L5椎间外孔,将直径0.63mm“L”形棒的一端沿L4及L5椎间外孔的前壁与脊柱斜向上成30。角插入椎间孔内,另一端位于椎间孔外。术后用生理盐水冲洗切口,依次缝合肌肉、腰背筋膜和皮肤,术中采用无菌操作,术后给予青霉素腹腔注射以预防感染。剔除术后出现自残现象或出现感觉完全缺失的大鼠。2.鞘内注射以异氟烷和氧气混合吸入麻醉大鼠。大鼠皮肤消毒后,以双侧髂棘连线与脊柱的交点定位L4/L5椎间隙,向下一椎间隙及L5/L6椎间隙进针,微量注射器针头沿食指尖端刺入椎间隙(针头方向略偏向前方),至有突破感,大鼠出现侧向快速甩尾,表明进入蛛网膜下腔,小心回抽,无血液回流,以1ul/s的速度缓慢推注,鞘注完毕后快速抽出微量注射器,按压注射部位约lmin,防止脑脊液漏出。结束操作,停止吸入麻醉,大鼠lmin内可恢复翻正反射。3.神经行为学测定-机械刺激缩爪反应痛阈的测量室温25℃,安静明亮,将大鼠置于长*宽*高分别为40cm*20cm*40cm的红色半透明玻璃笼内,底部及顶部无玻璃覆盖,底部铺以0.5cm*0.5cm的金属网格。大鼠适应环境20分钟后,以BME-404型电子式机械测痛仪进行测试。以针刺端垂直刺激大鼠足底第三、四趾间皮肤,大鼠出现缩爪或舔足现象视为阳性,记录刺激数值(G),每次刺激间隔5min,连续测5次,取其平均值作为统计变量。4. TRPV4和P38蛋白含量测定选取大鼠术侧L4及L5背根神经节,冰上快速取材,提取总蛋白,采用SDS-PAGE凝胶电泳方法分离蛋白,将分离后的蛋白条带转印至PVDF膜,用5%牛奶室温封闭2h,4℃一抗孵育过夜,二抗孵育2小时,显影。检测CCD术后及给予各激动剂和抑制剂后大鼠背根神经节TRPV4及P38表达变化。5.大鼠背根神经节神经元TRPV4及P38免疫组织化学染色处死大鼠,用预冷的生理盐水和4%多聚甲醛依次灌注,先快后慢,待灌注液清亮后,快速冰上取出术侧L4及L5背根神经节,制作石蜡切片,92-98℃抗原修复15分钟,兔抗大鼠TRPV4及P38一抗4℃孵育过夜,HRP结合的二抗室温孵育2小时。DAB染色,苏木素复染,进行TRPV4及P38蛋白定位。6.异位放电记录造模后3-8天,大鼠水合氯醛腹腔麻醉(0.3ml/100g),小心去除腰骶段椎板,充分暴露腰膨大、马尾及L5背根神经节,切断L5外周端及周围交通支,以中断外周及其他节段的感觉传入；将大鼠背部两侧皮肤悬吊,形成浴槽,浴槽内加入适量37℃的人工脑脊液；分离L5神经节前纤维,轻放于引导电极上,用37℃的液体石蜡覆盖,参考电极刺入大鼠骶尾部皮下,通过BL-420E生物机能实验系统记录神经放电。结果1.鞘内注射激动剂及抑制剂后CCD大鼠机械刺激缩爪反应阈值的变化CCD术后第二天大鼠机械刺激缩爪反应阈值明显下降,持续至14天(P<0.01),之后恢复至正常水平。给予RR和SB203580后,与盐水组相比,机械刺激缩爪反应阈值增高。给予4 α-PDD和anisomycin后,机械刺激缩爪反应阈值明显降低。药物注射后2小时,反应最明显,没有明显的剂量依赖性。2.CCD大鼠鞘内注射激动剂和抑制剂后TRPV4和p38蛋白表达的变化RR和4 α-PDD的使用浓度分别为1 nmol/L,10 nmol/L和100 nmol/L; SB203580的使用浓度为10 μmol/L,20 Wnol/L和40 μmol/L; anisomycin的使用浓度为5 μg/mL,25 μg/mL和40 μg/mL.鞘内注射1、2、4、8小时后检测TRPV4, p38和P-p38的表达变化。对照组CCD大鼠鞘内注射等体积生理盐水。TRPV4, p38和P-p38的表达可被RR明显抑制(2-4 h for TRPV4; 1-8 h for p38 1-4 h for P-p38), RR对TRPV4和p38蛋白表达的影响具有剂量依赖性。鞘内注射4α-PDD后,TRPV4蛋白表达增高(2h),同时p38和P-p38的表达也上调,且具有剂量依赖性。鞘内注射SB203580可显著抑制p38和P-p38 (4 h for p38; 2-4 h for P-p38)的蛋白表达,但TRPV4 (1-8 h)的表达明显上升且不具有剂量依赖性。鞘内注射anisomycin后；p38蛋白表达显著增高(1-2 h),TRPV4的表达显著降低(1-8h),P-p38的表达无明显变化,无明显的剂量依赖性。3.CCD大鼠鞘内注射TRPV4和P38激动剂或抑制剂后蛋白分布的变化背根神经节内大、中、小神经元细胞内TRPV4和p38均有阳性表达(small < 30 μm, middle 30 μm-40 μm, large> 40 μm)。 CCD术后阳性细胞数目增加,并可被鞘内注射的激动剂或抑制剂影响。计数分析结果显示,TRPV4阳性的小体积神经元及总神经元数目明显增加(P<0.01,与对照组相比)。鞘内注射RR和SB203580后,TRPV4阳性的小体积神经元及总神经元细数目减少(P<0.01)。鞘内注射anisomycin后,与对照组相比,总的阳性细胞数目增加(P<0.01)。与对照组相比,CCD大鼠大、中、小体积的P38阳性细胞数目均明显增加,(P< 0.05, large; P< 0.01, medium, small and total)。鞘内注射SB203580后,P38阳性的小体积神经元和总神经元细胞数目均明显减少(P<0.01),鞘内注射4 α-PDD (P< 0.01)和anisomycin后(P<0.01)P38阳性的小体积神经元和总神经元细胞数目均明显减少。4.鞘内注射TRPV4和P38激动剂或抑制剂对背根神经节异位放电的影响。正常对照大鼠很少出现异位放电,各组间异位放电的频率无明显差异。然而,RR组及SB203580组放电幅度明显减低(P<0.01),4α-PDD和anisomycin组放电幅度明显增加(P<0.01)。结论1.干预TRPV4及p38 MAPK通路可影响大鼠背根神经节持续受压所致神经病理性疼痛的程度,TRPV4及p38 MAPK参与了CCD后神经病理性疼痛的形成。2.大鼠背根神经节TRPV4与p38 MAPK存在相互影响关系。第二部分：MAPK通路参与介导大鼠背根神经节持续受压后的神经病理性疼痛目的研究MAPK通路是否参与大鼠背根神经节持续受压后神经病理性疼痛的形成与发展实验动物及方法1.实验动物及造模健康成年雄性Wistar大鼠,购自山东大学实验动物中心,体重180-2208,室内层流滤菌,室内温度20+-2℃,每笼两只,维持12小时昼夜节律,水、食持续供给。大鼠笼内饲养适应环境7天后开始进行后续实验。所有动物实验已经经过山东大学实验动物伦理委员会批准。采用10%水合氯醛(300mg/100gi.p.)腹腔注射,将不锈钢棒插入右侧L4、L5椎间外孔,假手术组手术方式同手术组,仅不插入钢棒。剔除出现自噬、感觉缺陷及残疾的大鼠。2.行为学测试于术前、术后4天及给药后2小时进行机械刺激缩爪反应阂值测定。采用BEM-404型机械刺激仪(中国医学科学院研制)检测机械刺激缩爪反应阈值的变化。将刺激针对准大鼠足底第三、四足趾间皮肤,缓慢均匀施加刺激力,出现缩爪或舐足为阳性反应,记录此刻施加的力,间隔5min再次测试,重复5次,取平均值。3.蛋白免疫印迹术后4天,鞘内注射MAPKs抑制剂后2小时,处死大鼠,冰上快速取术侧L4、L5背根神经节。提取总蛋白,采用5%及10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白,转印至PVDF膜上,5%牛奶室温封闭2小时,一抗4℃孵育过夜,HRP结合的二抗室温孵育1小时,发光显影。一抗为兔抗大鼠ERK多克隆抗体(1:1000, CST, USA),兔抗大鼠p-ERK多克隆抗体(1:2000, CST, USA),兔抗大鼠JNK多克隆抗体(1:1000, CST, USA),兔抗大鼠p-JNK多克隆抗体(1:1000, CST, USA),兔抗大鼠P38多克隆抗体(1:200, CST, USA),兔抗大鼠p-P38多克隆抗体(1:1000, CST, USA).4.背根神经节神经元p38, ERK, JNK免疫组织荧光染色采用5%异氟烷将大鼠深度麻醉,经预冷的生理盐水和4%多聚甲醛灌注后,取手术侧L4和L5被跟神经节,4%多聚甲醛4℃后固定过夜,脱水后石蜡包埋,制作不连续石蜡切片,切片厚度4um。一抗4℃孵育过夜,一抗分别为：兔抗大鼠ERK多克隆抗体(1:200, CST, USA),兔抗大鼠JNK多克隆抗体(1:200, CST, USA),兔抗大鼠P38多克隆抗体(1:50, CST, USA),采用小鼠抗大鼠NF200多克隆抗体(1:1,000, Abeam, Cambridge, UK)标记背根神经节神经元。二抗为Alexa Fluor 488标记的驴抗兔IgG (H+L)和Alexa Fluor 594标记的驴抗小鼠IgG(H+L),二抗混合后室温孵育2小时。DAPI染核10min后,采用抗荧光淬灭封片剂封片,观察。使用Olympus-u-rf1-t/dp 72自动荧光显微镜观察,采集图片,采用IPP.6进行图像分析,计数阳性细胞,每种抑制剂(SB203580, U0126 and SP600125)取6只大鼠。5. Real-time quantitative RT-PCRL4及L5背根神经节快速冰上取材,提取总RNA,测定浓度。p38, JNK, ERK和β-actin的引物序列分别为:p38 (forward,5'-CCTGCGAGGGCTGAAGTA-3'; reverse, 5'-ACGGACCAAATATCCACTGTCT-3'), JNK(forward,5'-AGCCTTGTCCTTCGTGTC-3'; reverse, 5'-AAAGTGGTCAACAGAGCC-3'), ERK1(forward,5'-CCAGAGTGGCTATCAAGA AG-3'; reverse, 5'-TCCATGAGGTCCTGAACAA-3'), ERK2(forward,5'-TGCCGTGGAACAGGTTGT-3'; reverse, 5'-TGGGCTCATCACTTGGGT-3'), β-actin (forward,5'-AGACCTTCAACACCCCAG-3'; reverse, 5'-CACGATTTCCCTCTCAGC-3').6.主要试剂SB203580(p38抑制剂,CST, USA,推荐浓度=40 Wnol/L), SP600125 (JNK抑制剂,CST, USA,推荐浓度=50 μnol/L) and U0126 (ERK抑制剂,CST, USA,推荐浓度=40 μmol/L).试剂采用DMSO溶解,储存至-20℃,鞘内注射时用生理盐水稀释至使用浓度,现用现配。结果1.CCD术后机械刺激缩爪反应阈值的变化CCD术后4天大鼠术侧机械刺激缩爪反应阈值明显降低(n=8 in each group, **P<0.01)。 CCD诱导的机械痛敏可被SB203580, SP00125或U0126 (n=8 in each group,#P<0.05)缓解,假手术组与对照组相比,无明显差异。2.背根神经节内p38、erk及jnk蛋白表达的变化CCD术后,大鼠背根神经节内p38、erk及jnk蛋白表达及磷酸化水平显著增高(n=5,*p<0.05,**p<0.01与对照组相比;#p<0.05,##p<0.01与假手术组相比)。CCD诱导的MAPKs蛋白表达及磷酸化水平增高可被相应的抑制剂抑制(SB203580 for p38, SP600125 for JNK, U0126 for ERK)(&p<0.05,&&p<0.01与CCD组相比).3.背根神经节内p38、erk及jnk基因表达的变化MAPK通路抑制剂不仅可以抑制CCD术后大鼠背根神经节神经元细胞内p38,ERK和JNK蛋白表达,也可影响其基因表达。CCD术后大鼠背根神经节内p38,JNK和ERK基因表达上调(n=6,*p<0.05,**p<0.01与对照组相比)。CCD诱导的MAPK基因水平上调可被其特异性抑制剂抑制(n=6,##p<0.01与CCD组相比)。4. p38, ERK和JNK在背根神经节神经元的分布变化在背根神经节神经元细胞质及细胞核内p38, JNK和ERK均有表达,与对照组相比,CCD术后,NF200标记的大、中神经元细胞数目明显增加(n=6,*p<0.05,**p<0.01)。SB203580,SP600125或U0126鞘内注射后,NF200阳性细胞数目明显减少(n=6,#p<0.05,##p<0.01与CCD组相比)。NF200阴性的小体积神经元细胞数目无明显变化。结论1. MAPK通路参与大鼠背根神经节持续受压后神经病理性疼痛机制2.抑制MAPK通路可缓解CCD诱导的神经病理性疼痛第三部分：大鼠背根神经节持续受压后脊髓背角TRPV4蛋白表达及分布的变化目的探讨大鼠背根神经节持续受压(CCD)后瞬时感受器电位离子通道香草素亚族受体4(TRPV4)在脊髓背角中的蛋白表达及分布规律。方法1.实验分组选取清洁级雄性Wistar大鼠30只,按随机数字表法分组：空白对照组5只,手术组25只(术后4天、7天、14天、28天各5只；免疫荧光组5只)。2.制备大鼠背根神经节持续受压模型手术方式同第一部分。3.行为学检测于造模成功后4天,7天,14天及28天,测量机械刺激缩爪反应痛阈,观察机械痛阈的变化。4.蛋白免疫印迹技术利用western blot技术检测空白对照组及术后4天,7天,14天及28天,手术侧及对侧脊髓背角TRPV4蛋白表达的变化。5.免疫荧光技术利用免疫荧光技术检测术后4天,手术侧与对侧脊髓背角TRPV4阳性细胞分布。结果1.大鼠背根神经节持续受压后机械痛阈变化手术组分别于术前及背根神经节持续受压后4天、7天、14天、28天测量大鼠机械刺激缩爪反应痛阈,对照组同时进行测量。与术前相比,术后4天,7天及14天时机械痛阈值明显下降,差异有显著性意义(n=5,P<0.001)；对照组不同时间测量结果无明显差异。2.脊髓背角TRPV4蛋白表达变化于术后4,7,14与28天进行完行为学测试后取材。与空白对照组比较,大鼠背根神经节持续受压后4天及7天,手术侧脊髓背角TRPV4表达升高,差异有显著性意义(n=5,p<0.01)；14天及28天,差异无统计学意义。手术对侧与对照组相比,差异无统计学意义。3、脊髓背角TRPV4阳性细胞数目变化大鼠背根神经节持续受压4天后,手术侧及对侧均存在TRPV4阳性细胞,荧光信号分布于胞质及胞膜上,轴丘处荧光信号集中。共5只大鼠,每只大鼠选取5张不连续切片,统计高倍视野内,脊髓背角TRPV4阳性细胞数目。相较于对侧,手术侧脊髓背角内TRPV4阳性细胞数目较多,差异有显著性意义(n=5,p=0.0008)。结论大鼠背根神经节持续受压后,机械痛阈下降的同时,手术侧脊髓背角内TRPV4蛋白表达上调及阳性数目增多,TRPV4可能参与CCD后神经病理性疼痛的中枢敏化机制。
赵睿[4]2015年在《Wnt信号通路在臂丛神经根性撕脱伤诱发的神经病理性痛中的作用机制研究》文中研究指明[背景]臂丛神经根性撕脱伤(BPA)是一种伴随神经病理性痛(NPP)高发且损伤部位特殊的外伤性周围神经损伤。由于损伤因素会同时累及脊髓背根神经节(DRG)及相应节段损伤侧的脊髓背角(SDH),因此BPA是周围神经系统和中枢神经系统同时受累的交界性损伤。BPA致伤因素各异,损伤类型繁杂,累及范围广泛,受累及的神经根组合类型多样,因此明确诊断BPA并且制定合理有效的治疗方案对临床医生来说并非易事。更加棘手的是,BPA患者同时伴发NPP等严重并发症的发生率高达90%,然而目前可供临床医生选择的治疗和缓解NPP症状的方法非常有限并且疗效并不理想。近年基础研究结果显示,Wnt信号通路在神经系统发育过程中可发挥多种作用,其下游信号分子活化与突触的形成及结构和功能可塑性的调节密切相关,而突触可塑性改变又与NPP的发生息息相关。那么,Wnt信号通路是否也参与了BPA诱发NPP的过程；如果参与,其作用机制是什么现在仍不得而知。因此,本课题的研究目的希望能够发现Wnt信号通路是否参与了BPA诱发NPP的过程；如果参与,希望能够进一步揭示Wnt信号通路在BPA诱发NPP过程中的调控机制,为临床治疗BPA合并NPP患者提供基础理论支持,进一步探索出治疗和缓解此类患者疼痛症状的新思路或治疗切入点。[目的]1.建立臂丛神经根性撕脱伤诱发神经病理性痛(BPA-NPP)大鼠模型,并对其进行行为学和分子生物学鉴定。2.检测Wnt信号通路相关分子在BPA-NPP模型组大鼠SDH中的表达和定位,进一步观察该通路对神经胶质细胞活化以及神经元突触可塑性的影响。3.探究抑制Wnt信号通路对BPA-NPP大鼠神经病理性痛行为学和SDH突触可塑性的影响。4.观察Wnt信号通路分子在BPA-NPP大鼠背根神经节(DRG)神经元中的表达,进一步探究其对钠离子信号通路Nav1.8表达的调控机制。[方法]1、撕脱大鼠臂丛神经C8和T1神经根,建立臂丛神经根性撕脱伤诱发神经病理性痛(BPA-NPP)大鼠模型。利用von Frey纤维丝检测大鼠BPA损伤后机械性缩足阈值的改变；运用Hargreaves热辐射法检测大鼠BPA损伤后热缩足潜伏期的改变；运用丙酮喷雾实验进行大鼠BPA损伤后冷痛敏评分；根据旷场实验进行大鼠自主活动能力评价。Western blotting检测大鼠SDH和DRG中pERK的表达,免疫组织荧光三重标记观察c-Fos的表达。2、RT-PCR、Western blotting、免疫荧光双重标记检测BPA-NPP大鼠模型SDH和DRG中Wnt信号通路相关分子(Wnt-3a、Frizzled 4和β-catenin)的表达以及定位。Western blotting检测突触可塑性相关分子的磷酸化水平、Nav1.8、CCL2以及CCR2表达的变化。3、BPA-NPP大鼠鞘内置管给予不同剂量Wnt信号抑制剂IWP-2或氯硝柳胺(Nsm),再观察对大鼠行为学、SDH和DRG区域星形胶质细胞活化情况以及突触可塑性相关分子表达的影响。4、免疫组织荧光化学法检测神经胶质细胞活化标记分子(GFAP)与脊髓浅层突触形成相关蛋白(PSD-95和突触素)的表达。RT-PCR检测炎症因子的mRNA水平。全细胞膜片钳技术记录大鼠SDH浅层神经元微小兴奋性突触后电流(mEPSCs)以及Nav1.8电流的变化。[结果]1、成功建立BPA-NPP大鼠模型。BPA损伤术后,大鼠术侧和对侧机械性缩足阈值降低,热缩足潜伏期(TWL)无明显变化,冷痛敏评分升高,自主活动能力无显著变化,且这种NPP的行为学变化至少可以持续至BPA术后28天。BPA-NPP组大鼠SDH和DRG中损伤相关分子pERK表达上调,SDH神经元活化标志分子c-Fos的表达增加。2、BPA-NPP大鼠SDH中Wnt-3a及其受体Frizzled 4和下游效应分子β-catenin表达上调,Wnt-3a主要表达于SDH星形胶质细胞和神经元中,而Frizzled 4和β-catenin则集中表达于神经元中。同时BPA损伤引起突触可塑性相关分子(CaMKⅡ,谷氨酸能受体亚型NR2B、CREB、PKC等)表达升高。3、BPA-NPP大鼠鞘内置管给予Wnt信号抑制剂IWP-2后,机械性缩足阈值升高,此效应可以维持约9天。IWP-2抑制Wnt信号后,星形胶质细胞活化减少,细胞促炎因子(IL-1β,IL-6和TNF-α)水平显著降低,突触可塑性变化相关分子的磷酸化水平降低,SDH浅层新生突触形成相关蛋白PSD-95和突触素下调,同时SDH浅层神经元：nEPSCs受到抑制。4、BPA-NPP大鼠DRG中Wnt-3a、Frizzled 4和β-catenin表达上调,同时CCL2及其受体CCR2以及Nav1.8表达上调,IWP-2抑制CCR2和Nav1.8的表达而不影响CCL2的产生,CCR2拮抗剂可降低Nav1.8的表达以及电流。[结论]1.BPA损伤引起大鼠SDH和DRG中Wnt/β-catenin信号通路分子表达上调。2.BPA损伤导致大鼠SDH神经胶质细胞活化,促炎因子表达升高,同时活化的Wnt信号通路引起SDH神经元突触可塑性增加,痛敏阈值降低。3. CCL2/CCR2以及Nav1.8参与BPA损伤后DRG感觉神经元疼痛信号的传导,Wnt/β-catenin信号通路通过上调CCR2可增加Nav1.8从而引起NPP的发生。4.Wnt信号通路活化引起的SDH神经元突触可塑性的改变以及Nav1.8离子通道的激活对BPA后NPP的产生发挥重要作用。
王新星[5]2018年在《电针对神经病理性疼痛大鼠背根神经节Nav1.8表达影响的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:本实验拟研究坐骨神经分支损伤(SNI)的大鼠,经电针治疗后机械痛阈值及热痛阈值的变化及其背根神经节中电压门控钠离子通道Nav1.8表达的变化,探讨Nav1.8与神经病理性疼痛发病的关系和电针治疗神经病理性疼痛的潜在机制。方法:将50只健康SD大鼠随机分为5组,每组10只,设为正常对照组(N组),模型组(M组),假手术组(P组),电针组(E组)和假电针组(SE)组,选择模型为坐骨神经分支损伤模型,具体方法是暴露大鼠坐骨神经,将其分支胫神经和腓总神经结扎离断,保留腓肠神经。假手术组为仅暴露坐骨神经而不离断分支。电针组为造模后当天及以后每2日进行一次电针治疗,假电针组为造模后当天及以后每2日进行一次假电针治疗,即只刺入钢针,不加电流。分别于造模当天、造模后第3天、第7天、第14天测量5组大鼠的机械痛及热痛阈值。机械痛阈值以大鼠50%缩爪阈值来表示,热痛阈值以大鼠对热刺激的抬脚潜伏期来表示。并在术后第14天完成测量后,取全部大鼠的背根神经节(DRG),用免疫蛋白印迹法(Western Blot)测量DRG中的Nav1.8表达浓度。结果:1.关于机械痛阈值方面,M组机械痛阈值在造模后第3天(4.87±0.67g)、7天(3.11±0.91g)、14 天(3.07±0.33g)之间存在差异 p=0.019<0.05,E组大鼠的机械痛阈在造模后第 3 天(6.04±1.03g)、7 天(11.11±1.39g)、14 天(13.31±2.38g)之间存在差异p=0.023<0.05,E组与M组比较:机械痛阈值在电针治疗3天、7天、14天时存在差异p=0.036<0.05,SE组与M组比较:假电针治疗3、7、14天后,大鼠的机械痛阈与模型组比较存在显著差异p=0.0014<0.05,E组与SE组比较:治疗3、7、14天后,大鼠的机械痛阈存在显著差异p=0.001<0.05。2.关于热痛阈值方面:造模后第7天,M组大鼠右脚抬脚潜伏期(13.3±1.80s)较造模前(28.87±1.96s)明显降低,M 组与 N 组(26.8±1.34)、P 组(24.6±3.21)相比,抬脚潜伏期测定与存在显著差异P=0.004<0.05,造模后第14天,M组的抬脚潜伏期(14.5±2.96s)仍较 N 组(24.7±1.53s)、P 组(22.4±3.01s)降低,P=0.003<0.05,M组大鼠抬脚潜伏期在造模后3天(8.67±1.27s)、7天(13.3±1.80s),14天(14.5±2.97s)之间存在差异p=0.018<0.05,E组大鼠的热刺激抬脚潜伏期在治疗后3天(16.17± 1.70s)、7 天(15.63±3.59s)、14 天(21.43± 1.89s)之间没有显著差异p=0.073>0.05,E组与M组比较:在电针治疗3天、7天、14天时大鼠的抬脚潜伏期存在差异p=0.029<0.05,SE组与M组比较:假电针治疗3、7、14天后,大鼠的热痛阈无明显差异p=0.104>0.05,E组与SE组比较:治疗3、7、14天后,大鼠的抬脚潜伏期无显著差异p=0.343>0.05。3.关于Western Blot:M组与N组相比较,灰度值存在明显差异p=0.028<0.05,E组与M组相比,灰度值存在差异p=0.025<0.05,E组与SE组相比,灰度值存在明显差异,p=0.01<0.05。结论:SNI模型的大鼠出现机械痛阈值和热痛阈值的下降,且背根神经节中Nav1.8表达增加,电针治疗可以明显提高SNI模型大鼠机械痛和热痛阈值,并降低DRG中Nav1.8的表达,假电针治疗可以改善SNI大鼠的机械痛敏,但对改善热痛敏及降低Nav1.8的表达方面作用不明显。
李芳[6]2008年在《条件性损伤对脊髓损伤后再生的作用及其机制的初步探讨》文中认为第一部分条件性损伤在脊髓损伤后再生中的作用目的:利用示踪技术,观察条件性损伤(坐骨神经损伤或者腰5运动根损伤)对脊髓背索损伤后薄束、楔束再生的影响。方法:成年健康雌性SD大鼠,随机分为正常组、单纯脊髓损伤组(脊髓背索损伤)和合并损伤组(条件性损伤1周后行脊髓背索损伤)。脊髓背索损伤后,动物存活2周。在脊髓背索损伤同时,于脊髓损伤区头侧端5mm处注射快蓝(Fast blue,FB)逆行示踪背根节感觉神经元,动物处死前3天于坐骨神经注射霍乱毒素亚单位B(Cholera Toxin B Subunit,CTB)顺行示踪脊髓上行感觉束,观察脊髓损伤后薄束、楔束的再生情况。结果:正常大鼠薄束核和楔束核可见CTB阳性纤维;单纯脊髓损伤组薄束核和楔束核则未发现CTB阳性纤维,CTB阳性纤维终止于脊髓损伤区尾侧端,形成膨大样结构,没有进入胶质瘢痕;合并损伤组,可见CTB标记的上行感觉束纤维,穿过脊髓损伤区进入损伤区头侧端,胶质瘢痕中CTB阳性纤维数目较单纯脊髓损伤组多。FB逆行示踪显示,合并损伤组背根节中FB标记的感觉神经元数目较单纯脊髓损伤组多。结论:条件性损伤能促进脊髓背索损伤后薄束、楔束的再生。第二部分条件性损伤促进脊髓损伤后再生的作用机制目的:观察条件性损伤后脊髓和背根节中脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophin factor,BDNF)的表达情况及中和了内源性BDNF后条件性损伤对脊髓再生的影响,探讨条件性损伤在脊髓损伤后再生中的作用机制。方法:成年健康雌性SD大鼠,随机分为正常组、单纯条件性损伤组、单纯脊髓损伤组和合并损伤组,合并损伤组动物腹腔给予BDNF抗血清或正常羊血清(NSS),术后动物存活1天、7天或14天。采用免疫组织化学、原位杂交和酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测BDNF在损伤脊髓局部、脊髓腰骶膨大部及双侧L4、L5背根节中的表达,并结合FB逆行示踪观察FB阳性神经元BDNF的表达情况。用FB逆行示踪背根节感觉神经元和CTB顺行标记上行感觉束,观察BDNF抗血清处理后脊髓再生的情况。条件性损伤1周后,取背根节神经元和背根节组织进行体外培养,通过βⅢ-tubulin免疫荧光染色观察BDNF抗血清处理后背根节神经元突起的生长情况。结果:单纯条件性损伤组,损伤侧的脊髓腰骶膨大部、背根节中BDNF蛋白及mRNA表达均上调。与单纯脊髓损伤组相比,合并损伤组在脊髓损伤的尾侧端可见较多的BDNF阳性纤维,这些纤维呈膨体样结构,主要分布于损伤脊髓尾侧端的白质里,合并损伤组FB标记的感觉神经元数目也较单纯脊髓损伤组多,且大部分FB标记的感觉神经元是BDNF阳性的神经元。中和内源性BDNF后,合并损伤组脊髓CTB标记的纤维终止于脊髓空洞前,仅有极少数纤维长入损伤区。通过测量由损伤区尾侧端长入损伤区的再生轴突长度发现,BDNF抗血清处理组再生轴突的长度明显短于NSS处理组,同时,背根节中FB标记的感觉神经元数目也显著少于NSS处理组。背根节神经元体外培养和Matrigel里培养背根节组织显示,BDNF抗血清处理后,背根节神经元和背根节组织神经突起的长度较NSS组明显缩短。结论:条件性损伤促进脊髓损伤后的轴突再生机制可能与脊髓和背根节中BDNF的表达增加有关。第三部分BDNF参与条件性损伤促进脊髓损伤再生作用的可能机制目的:通过观察条件性损伤或合并损伤结合BDNF抗血清处理后,脊髓和背根节中生长相关蛋白-43(growth associated protein-43,GAP-43)、磷酸化细胞外信号调节激酶(phosphorylated extracellularsignal-regulated kinase,p-Erk)和RhoA的表达变化,探讨BDNF参与条件性损伤促进脊髓损伤再生作用的可能机制。方法:成年健康雌性SD大鼠,随机分为正常组、单纯条件性损伤组、单纯脊髓损伤组和合并损伤组,单纯条件性损伤组和合并损伤组动物术后给予BDNF抗血清或NSS处理,大鼠存活3天、7天或14天。用免疫组织化学方法、谷胱甘肽转移酶pull down(GST-pulldown)及蛋白质免疫印迹等,检测单纯条件性损伤组背根节中GAP-43和p-Erk的表达,单纯脊髓损伤组和合并损伤组脊髓损伤局部GAP-43和RhoA的表达情况,及BDNF抗血清处理后,上述指标的表达变化情况。结果:与正常对照相比,单纯条件性损伤后1周,背根节中GAP-43和p-Erk阳性的感觉神经元数目显著上调,BDNF抗血清处理后,GAP-43阳性和p-Erk阳性的感觉神经元比例下调。脊髓损伤后3天,单纯脊髓损伤组GAP-43和RhoA表达上调,7天达到高峰,并持续到损伤后14天。合并损伤组GAP-43的表达明显上调,较单纯脊髓损伤组高,但RhoA表达下调。BDNF抗血清处理后,合并损伤组脊髓损伤局部GAP-43的表达较NSS组下调,RhoA表达上调。结论:在条件性损伤促进脊髓损伤后再生过程中,BDNF可能通过上调GAP-43的表达,激活p-Erk信号通路及下调RhoA发挥作用。
李响[7]2013年在《基于生物信息技术的慢性疼痛致病基因分析与表达验证》文中研究说明目的：通过生物信息技术对数据库芯片结果进行筛选,以发现可能与慢性疼痛(神经病理性疼痛)发病相关的新致病基因,并对所过滤的差异基因表达谱进行分析。同时构建大鼠脊神经结扎(SNL)模型,观察大鼠疼痛行为学变化,并检测所获致病基因在损伤及非损伤背根神经节(DRG)的表达情况及在不同神经元中的分布,以验证生物信息学筛选基因的可行性,并探讨所获致病基因对神经病理性疼痛发病的可能影响机制。方法：1、从GEO数据库中搜索并下载与神经病理性疼痛相关的芯片数据,应用BRB ArrayTools软件对数据进行标准化、过滤及差异基因比较,通过基因功能挖掘平台挖掘文献,并与已有Meta分析比对筛选出未在SNL模型损伤及非损伤侧DRG中发现的致病基因,同时,应用DAVID6.7数据库对非损伤DRG中的差异基因进行分析,探讨非损伤DRG中可能发生的病理生理变化。2、将65只大鼠随机分为正常组(n=15)、Sham组(n=25)及SNL组(n=25),SNL组建立大鼠左侧SNL模型,Sham组仅暴露左侧L5脊神经而不结扎,正常组未作处理。术前1天及术后1、4、7、10、13、16、19、22、25、28天测定各组大鼠左后足机械痛阈变化情况,术后3、7、14、21、28天分批处死,取术侧及健侧L4、L5DRG,采用RT-PCR及Western-Blot技术分别对生物信息学方法所获致病基因的mRNA及蛋白表达变化水平进行检测。3、将36只大鼠随机分为正常组(n=9)、Sham组(n=9)及SNL组(n=18),SNL组建立大鼠左侧SNL模型,Sham组仅暴露左侧L5脊神经而不结扎,正常组未作处理。术前1天及术后1、3、5、7、9、11、14天测定各组大鼠左后足机械痛阈变化情况,术后3、7、14天分批灌注处死,取术侧L4、L5DRG,采用免疫荧光技术检测生物信息学方法所获致病基因在NF200、IB4和CGRP免疫阳性DRG神经元中的表达变化情况。结果：1、采用生物信息技术共获得123条同时在损伤及非损伤DRG中差异表达的基因,经过进一步文献挖掘发现34条与神经病理性疼痛发病相关,其中20条基因未见报道NSF在已有Meta分析中被认定为与疼痛发生具有最明显联系,此外,在非损伤DRG中基因差异表达主要导致了离子通道及离子运输、神经元损伤、免疫应答、囊泡转运等方面的变化。2、术前三组大鼠机械痛阈无显著差异(P>0.05),术后SNL组与空白组及Sham组相比,机械痛阈显著下降(P<0.05),同时术侧后肢抬起、足趾并拢、足底轻度外翻,而健侧及其它两组大鼠无明显变化。3、术后各时间点RT-PCR及Western-Blot结果均显示SNL组大鼠术侧L4、L5DRG内NSF的mRNA及蛋白水平较健侧、正常组及Sham组L4、L5DRG显著下降(P<0.05)。4、免疫荧光结果显示NSF在正常大鼠三种亚型DGR中分布广泛,NSF(?)日性神经元主要分布于中小神经元。NSF在SNL大鼠IB4及CGRP免疫阳性神经元中表达下降,同时NSF的表达逐渐由中小神经元转向大中神经元。结论：1、利用生物信息技术能够寻找到与神经病理性疼痛发病相关的致病基因,并能通过分子生物学和组织学试验得到验证,提示其可以作为寻找疾病致病基因的一种有效方法。2、大鼠脊神经结扎后NSF的表达下调可能与神经病理性疼痛的发生发展有关。3、生理状态下NSF可能参与DRG各亚型神经元中无害及有害感觉信息的传递,而脊神经结扎后IB4及CGRP阳性神经元中的NSF表达变化可能在神经病理性疼痛的发生发展中起着更为重要的作用。
董岩[8]2010年在《脊髓EphB1/ephrinB1信号通路在大鼠胫骨癌痛中的作用及机制》文中研究表明目的：Eph受体是目前已知最大的受体酪氨酸激酶家族。与其配体ephrin相互作用广泛参与神经系统的发育。近来文献报道Eph受体及ephrin配体也存在于成年神经系统内,在神经痛及炎性痛的调节中发挥着重要的作用。本课题旨在研究EphB1/ephrinB1信号通路在大鼠胫骨癌痛中的作用,并进一步探讨EphB1/ephrinB1信号通路发挥作用的下游机制。方法：胫骨骨髓腔内注射Walker256大鼠乳腺癌细胞建立大鼠胫骨癌痛模型,通过测定模型大鼠体重、后肢的机械性痛阂值和检查胫骨组织病理标本对模型进行简单的评估。运用免疫组织化学、Western blot和RT-PCR等分子生物学方法对胫骨癌痛大鼠脊髓及背根神经节内EphB1/ephrinB1的表达进行检测。观察在接种肿瘤细胞16天时,鞘内注射EphB1-Fc(EphB1受体阻断剂,10μg)对胫骨癌痛大鼠机械性痛觉超敏的影响及对脊髓内炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α基因表达的影响。结果：胫骨接种肿瘤细胞后大鼠出现了机械性痛阈值的降低,并在第16天达到了最低水平。在接种肿瘤细胞的大鼠脊髓内EphB1/ephrinB1蛋白表达增加,在背根神经节ephrinB1表达下降,EphB1表达水平没有显著的变化。免疫组织化学结果显示：接种肿瘤细胞后EphB1/ephrinB1在脊髓背角内的表达显著增加。RT-PCR结果显示在脊髓及背根神经节内EphB1/ephrinB1的mRNA水平没有显著变化。在接种肿瘤细胞第16天时,鞘内注射EphB1-Fc可以显著地缓解由于骨癌造成的机械性痛觉超敏并抑制了脊髓内由于骨癌痛引起的炎性细胞因子的基因表达的增加。结论：EphB1/ephrinB1信号通路参与了大鼠胫骨癌痛的维持。抑制脊髓内EphB1受体激活可以缓解骨癌痛的同时还能够降低脊髓内炎性细胞因子的表达。因此,我们推测EphB1/ephrinB1信号通路可能是通过调节脊髓内炎性细胞因子的表达在大鼠胫骨癌痛的维持阶段起作用的。我们的研究提示EphB1/ephrinB1信号通路可能是骨癌痛治疗的一个重要靶点。
徐昌水[9]2010年在《葛根素对初级感觉神经元P2X_3受体介导的痛觉传递的影响和机制研究》文中认为1、研究背景疼痛(pain)包括痛觉和痛反应,是临床上大多数疾病共有并最常见的症状之一,主要表现为机体对损伤组织或潜在的损伤所产生的一种不愉快的反应。在临床上,疼痛的分类十分复杂。按疼痛的性质、起因和时程,疼痛可分为急性疼痛和慢性疼痛。急性疼痛主要表现为疾病或组织损伤所致的急性症状,为各种伤害性刺激作用于机体伤害性感受器而导致的疼痛,故又称之为伤害感受性疼痛。临床上常见于手术创伤、烧伤、烫伤、急性炎症、心肌梗死、脏器穿孔、分娩等引起的疼痛。而慢性疼痛是指引起伤害性刺激的损伤痊愈而疼痛却依然存在的一种状态,临床表现为其本身就是一种疾病,常见于神经源性疼痛(神经病理性疼痛)、慢性腰腿痛、晚期癌性痛等。另外,基于病理学特征,可将疼痛划分为伤害感受性疼痛(nociceptive pain)和神经病理性疼痛(neuropathic pain)。伤害感受性疼痛的产生与组织损伤或炎症有关,又称为炎症性疼痛,属于急性疼痛。而神经病理性疼痛属于慢性疼痛,其产生机制比较复杂,主要是由于外周或中枢神经系统的直接损伤或功能紊乱所引起。疼痛表现为人对伤害性刺激的一种主观感受,常常与其他疾病伴随发生,如果伴随神经异常,则提示可能存在神经病理性因素或神经损伤等,而表现为神经病理性疼痛,为临床最常见的难治性疼痛。神经病理性疼痛分类复杂、类型较多,主要分为周围性神经病理性疼痛和中枢性神经病理性疼痛。临床上,神经病理性疼痛通常表现为一种慢性疾病,比较难诊断,而且尚缺乏有效的治疗措施,常规止痛药一般不能有效缓解疼痛,因此很难治愈。因此,临床上常常面临着治疗无效或效果不佳的尴尬,给患者带来了极大的痛苦,严重影响患者正常工作和日常生活,极大地降低患者的生活质量,对医疗服务亦是个巨大的负担。烧伤是临床常见的一种严重的急性创伤,常伴有剧烈疼痛。烧伤、烫伤引起的疼痛是一种特殊类型的急性外伤性疼痛,一般在烧伤、烫伤后最初1小时内出现,并伴随着出现在烧伤后的整个治疗过程中。严重烧伤后将导致严重而且持续性的疼痛(基础痛),并且还要在数周乃至数月内经历令人难以忍受的创面处理引起的疼痛(操作痛)。烧伤痛是烧伤患者所经历的最难以忍受的痛苦和最常见的临床症状,其控制不当将可导致患者的精神预后不良,甚至有自杀行为和暴力倾向,而且严重的会引起烧伤病人并发症的产生甚至死亡。但目前临床上对烧伤痛的治疗远不尽人意,寻找更有效、更实用和更经济的方法治疗烧伤痛,成为烧伤治疗的重要组成部分。目前,国际上认为疼痛是继呼吸、脉搏、血压、体温之后的第五个生命体征,为生命体征的重要指标；疼痛治疗亦成为现代医学的一个重要组成部分,并已逐渐发展成为疼痛治疗学。然而,目前化学药物镇痛仍是最主要的疼痛治疗手段,主要包括阿片类镇痛药、中枢作用的非阿片类镇痛药、作用于外周的抗炎镇痛药和复方抗炎镇痛药。但阿片类等镇痛药物的副作用,如呼吸抑制、恶心、呕吐、嗜睡、尿潴留等发生率较高,而且长期应用易产生药物耐受与依赖以及突然停药导致的戒断综合征等。因此,在临床上如何规范疼痛治疗是每一位医师必须认真对待的问题,寻找以新的镇痛药物成为目前医务工作者的研究热点和面临的首要任务。研究发现,伤害感受器上表达许多与疼痛和感觉过程有关的分子,特别是嘌呤受体中的P2X3受体在背根感觉神经元特异表达,与感觉神经末梢释放的ATP(P2X受体激动剂)结合而参与疼痛的信息传递,由此表明脊髓背根初级感觉神经元在疼痛的感知和传递中发挥着重要的作用。嘌呤与嘧啶受体包括P1和P2受体,腺苷为腺嘌呤核苷酸前体和代谢产物,主要激活P1受体,而ATP及其类似物作用于P2受体。一般认为,外周神经损伤、伤害性刺激等使损伤细胞、应激细胞以及感觉神经末梢本身释放大量ATP,刺激感觉神经元P2X2/3受体或P2X3受体,使感觉神经末梢去极化,引起感觉神经元放电增强而产生痛觉。由此提示,不同类型细胞释放的ATP能通过激活感觉神经终末上的P2受体(尤其是P2X3受体或P2X2/3受体),在疼痛的发生机制中起到一定作用。因此,P2嘌呤受体的激动剂和拮抗剂具有广阔临床应用前景,特异性的P2X3受体阻断剂将可能成为痛觉等病理状态下新的治疗药物。葛根为豆科植物野葛的干燥根,气味甘、辛、平,无毒；具清热解毒、升阳解肌、透疹止泻之功效。而葛根素(Puerarin)是从葛根中提取的一种黄酮苷,化学名为4,7-二羟基-8-β-D-吡喃葡萄糖醛基异黄酮,临床上主要用于心肌梗塞、冠心病、心绞痛等心血管疾病及视网膜动/静脉阻塞、突发性耳聋和糖尿病等病症的治疗。文献报道,以葛根为主药的葛根汤具有抗炎作用；关节腔内联合注射类固醇和葛根素可显著地提高骨关节炎治疗的远期疗效。疼痛是炎症的表现,而炎症与伤害性反应密切相关,由此提示从葛根中提取的葛根素可能具有抗伤害性反应和镇痛的作用。本实验将通过建立大鼠坐骨神经慢性压迫损伤(CC1)和浅Ⅱ度烧伤模型,观察葛根素对实验模型大鼠的机械痛敏和热痛敏等行为学的影响,同时采用免疫组化、原位杂交、RT-PCR和Western Blot技术观察葛根素对P2X3受体介导的神经病理性疼痛和烧伤痛的作用；并结合急性伤害性行为学研究,观察葛根素对P2X3受体介导的大鼠急性伤害性反应的影响。通过这些实验以期了解葛根素对初级感觉神经细胞P2X3受体介导的神经病理性疼痛、烧伤痛和急性伤害性疼痛的作用,扩大中药葛根素的应用范围,为临床上神经病理性疼痛、烧伤痛和急性伤害性疼痛等急、慢性疼痛的防治探寻新的镇痛药物提供实验依据。2、葛根素对P2X3受体介导的急性伤害性反应的作用目的：观察葛根素(puerarin, PUE)对初级感觉神经细胞嘌呤2X3 (P2X3)受体介导的急性伤害性反应的影响。方法：通过大鼠痛行为反应确定鞘内应用葛根素对P2X3受体激动剂ATP、α,β亚甲三磷酸腺苷(α,β-meATP)和福尔马林(formalin)所致大鼠足底伤害性反应的影响；同时应用免疫组化和RT-PCR方法,观察葛根素对炎性物质福尔马林所致伤害性行为反应大鼠的L4-L6段背根神经节(dorsal root ganglion, DRG) P2X3受体表达的影响。结果：足底局部皮下分别注射ATP (10μmol/L)、α,β-meATP(1μmol/L)或formalin(2.5%)后产生明显的急性伤害性反应；鞘内注射ATP(10μmol/L)或α,β-meATP(1μmol/L)能分别加强足底局部皮下注射ATP (10μmol/L)或α,β-meATP(1μmol/L)所产生的急性伤害性反应；鞘内注射葛根素(10mmol/L)能明显抑制足底注射2.5%formalin所致的大鼠足底急性伤害性反应；鞘内注射葛根素(10mmol/L)能明显抑制鞘内注射ATP所加强大鼠足底急性伤害性反应；鞘内注射不同浓度的葛根素(2、10、50mmol/L)呈剂量依赖性地抑制鞘内注射α,β-meATP所加强的大鼠足底急性伤害性反应；DRG免疫组化和RT-PCR实验结果显示葛根素可明显减少足底皮下注射福尔马林引起的DRG中P2X3受体蛋白和mRNA的上调表达。结论：葛根素可通过抑制初级感觉神经元P2X3受体兴奋介导的伤害性信号传递产生抗伤害性反应作用。3、葛根素对P2X3受体介导的神经病理性疼痛的作用目的：观察葛根素对P2X3受体介导的神经病理性疼痛的作用。方法：建立大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤(Chronic constriction injury,CCI)模型(结扎右后肢),实验大鼠随机分为正常大鼠对照组(Ctrl)、假手术对照组(Sham)、正常大鼠葛根素处理对照组(Ctrl+PUE)、CCI模型组(CCI)和CCI模型+葛根素处理组(CCI+PUE)等5组。应用Von Frey细丝法和热辐射法观察葛根素对CCI大鼠机械缩足反射阂值(mechanical withdrawal threshold, MWT)和热缩足反射潜伏期(thermal withdrawal latency, TWL)的影响,结合免疫组化、蛋白印迹、原位杂交和]RT-PCR方法观察各组实验大鼠右侧(即结扎侧)L4/L5段背根神经节(dorsal root ganglion, DRG) P2X3受体蛋白和mRNA表达的变化。结果：术后4-7 d,神经病理性疼痛大鼠模型基本形成,CCI大鼠模型组和CCI+PUE组大鼠右后爪(结扎侧)的机械和热痛敏阈值明显降低,与Sham对照组、Ctrl+PUE对照组和Ctrl对照组比较有显著性意义(p<0.01),而：Sham对照组、Ctrl+PUE对照组和Ctrl对照组之间相比较无显著性差异(p>0.05)；术后7-10 d,CCI+PUE组的MWT和TWL明显升高,与CCI大鼠模型组相比有明显的差异性(p<0.01),与Ctrl对照组之间相比较无显著性意义(p>0.05)；术后14 d,各组实验大鼠DRG的免疫组化、蛋白印迹、原位杂交和RT-PCR等实验结果显示：与Sham对照组、Ctrl+PUE对照组和Ctrl对照组相比,CCI模型组大鼠右侧L4/L5段背根神经节P2X3受体蛋白和mRNA的表达明显升高(p<0.05或0.01),而CCI+PUE组背根神经节P2X3受体蛋白和mRNA的表达较CCI大鼠模型组的低(p<0.05或0.01)。结论：葛根素对初级感觉神经元P2X3受体介导的神经病理性疼痛具有抑制作用。4、葛根素对P2X3受体介导的烧伤痛的作用目的：探讨葛根素对P2X3受体介导的烧伤痛的作用。方法：建立大鼠浅Ⅱ度烧伤动物模型(右后肢或背部烫伤),实验大鼠随机分成10组,每组6只。其中足部假烫组(Sham paw burn, SPB)、无足部烫伤葛根素处理对照组(puerarin-treated paw unburned control, PPC)、足部浅Ⅱ度烫伤组(untreated superficial second degree paw burn, UPB)、足部浅Ⅱ度烫伤葛根素处理组(puerarin-treated superficial second degree paw burn, PPB)和足部烫伤空白对照组(blank paw control, BPC)用于行为学研究,背部假烫组(sham back burn, SBB)无背部烫伤葛根素处理对照组(puerarin-treated back unburned control,PBC)、背部浅Ⅱ度烫伤组(untreated superficial second degree back burn, UBB)、背部浅Ⅱ度烫伤葛根素处理组(puerarin-treated superficial second degree back burn, PBB)和背部烫伤空白对照组(blank back control,BBC)用于免疫组化、原位杂交或分子生物学等研究。应用Von Frey细丝法和热辐射法测定各组实验大鼠右后肢机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)和热缩足反射潜伏期(thermal withdrawal latency,TWL),观察葛根素对浅Ⅱ度烧伤大鼠MWT和TWL的影响。结合免疫组化、蛋白印迹、原位杂交和RT-PCR方法分别观察各组大鼠背部烫伤区背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)P2Χ3受体蛋白和]nRNA的表达变化。结果：烫伤后,足部浅Ⅱ度烫伤组(untreated superficial second degree paw burn, UPB)、足部浅Ⅱ度烫伤葛根素处理组(puerarin-treated superficial second degree paw burn, PPB)大鼠右后爪的机械和热痛敏阈值明显降低,与足部假烫组(sham paw burn, SPB)、无足部烫伤葛根素处理对照组(puerarin-treated paw unburned control, PPC)、和足部烫伤空白对照组(blank paw control, BPC)比较有显著性意义(p<0.01),而足部假烫组(SPB)、无足部烫伤葛根素处理对照组(PPC)、和足部烫伤空白对照组(BPC)之间相比较无显著性差异(p>0.05)；与UPB组相比,PPB组的MWT和TWL分别于烫伤后48h和1h明显升高,并有明显的差异性(p<0.05)；烫伤后96h,PPB组的MWT和TWL与SPB、PPC和BPC组之间相比较无显著性差异(p>0.05),而UPB组的MWT和TWL仍然很低(P<0.01)；烫伤3d后,各组实验大鼠DRG的免疫组化、蛋白印迹、原位杂交和RT-PCR等实验结果显示：背部假烫组(sham back burn, SBB)、无背部烫伤葛根素处理对照(puerarin-treated back unburned control, PBC)和背部烫伤空白对照组(blank back control, BBC)相比,背部浅Ⅱ度烫伤组(untreated superficial second degree back burn, UBB)大鼠背根神经节(DRG) P2X3受体的蛋白和mRNA的表达明显升高(P<0.01),而背部浅Ⅱ度烫伤葛根素处理组(puerarin-treated superficial second degree back burn,PBB)背根神经节(DRG)P2X3受体蛋白和mRNA的表达较UBB组低(P<0.05或0.01),与SBB、PBC和BBC组比较无显著性差异(p>0.05)。结论：葛根素可缓解初级感觉神经元P2X3受体所介导的烧伤痛。
杨隆秋[10]2010年在《脑源性神经营养因子及其前体对疼痛的调控》文中指出目的：研究不同给药方式下给予抗BDNF、抗proBDNF以及抗proBDNF复合阿片类、非甾体类药物对大鼠后足切割后的行为学影响。方法: 1)不同给药方式下给予抗BDNF、抗proBDNF,建立切割疼痛模型,测切割后PWT值。2)分别单独和复合腹腔注射吗啡、抗proBDNF,建立切割疼痛模型,测切割后PWT值。3)分别单独和复合腹腔注射纳洛酮、抗proBDNF,建立切割疼痛模型,测切割后PWT值。4)分别单独和复合腹腔注射氟比洛芬酯、抗proBDNF,建立切割疼痛模型,测切割后PWT值。结果：1)鞘内注射抗BDNF、腹腔注射抗proBDNF大鼠切割后PWT值增高。2)抗proBDNF复合吗啡注射大鼠在切割后PWT值高于单独注射抗proBDNF、吗啡大鼠。3)抗proBDNF复合纳洛酮注射大鼠在切割后PWT值低于单独注射抗proBDNF大鼠；抗proBDNF复合大剂量纳洛酮注射大鼠切割后的PWT值低于复合小剂量纳洛酮注射大鼠。4)抗proBDNF复合氟比洛芬酯注射大鼠在切割后PWT值高于单独注射抗proBDNF、氟比洛芬酯大鼠。结论：鞘内注射抗BDNF和腹腔注射抗proBDNF能降低大鼠后足切割引起的痛觉过敏,其药效呈剂量依赖性,最佳剂量是10mg/kg;吗啡和氟比洛芬酯能增强抗proBDNF降低大鼠后足切割引起的痛觉过敏的作用；纳洛酮不能够完全翻转抗proBDNF降低大鼠后足切割引起的痛觉过敏；proBDNF的药理作用不是通过与阿片受体结合而实现的。目的：研究大鼠后足切割后BDNF、TrkB、proBDNF、Sortilin、P75NTR、BDNFmRNA在脊髓和背根神经节的变化。方法：1)48只大鼠随机分为8组：对照组、切割后0.5h、1h、3h、6h、24h、72h组、腹腔注射抗proBDNF后切割组,取脊髓、右侧背根神经节标本,行免疫组织化学实验。2)42只大鼠随机分为7组：对照组、切割后0.5h、1h、3h、6h、24h、72h组,取脊髓、右侧背根神经节标本,行Elisa、免疫印迹、RT-PCR实验。结果：1)大鼠后足切割后BDNF、TrkB在脊髓的表达增强,proBDNF、Sortilin、P75NTR的表达无明显改变；BDNF、TrkB、proBDNF、Sortilin、P75NTR在背根神经节的表达增强。2)大鼠后足切割后BDNF、TrkB在脊髓的蛋白含量增加,proBDNF、Sortilin、P75NTR的蛋白含量无明显改变；BDNF、TrkB、proBDNF、Sortilin、P75NTR在背根神经节的蛋白含量增加；大鼠切割后在脊髓BDNFmRNA的表达无明显变化,在背根神经节的表达增强。结论：在切割疼痛中BDNF及proBDNF都是通过与其高亲和力的受体结合发挥各自的生物学功效,proBDNF在到达脊髓前就转化为成体BDNF,后者通过转运至脊髓进而促进切割疼痛痛觉过敏的发生。目的：研究BDNF、proBDNF对炎性疼痛和神经病理性疼痛大鼠的行为学影响和BDNF、proBDNF在这两种疼痛模型中的表达。方法：1)分别腹腔、鞘内给予抗BDNF、抗proBDNF后建立炎性疼痛模型、神经病理性疼痛模型,测给药后的PIS值、PWT值。2)建立炎性疼痛和神经病理性疼痛模型,免疫组织化学方法检测BDNF、proBDNF在脊髓和背根神经节的表达。结果：1)鞘内注射抗BDNF和腹腔注射抗proBDNF能降低炎性疼痛大鼠静止相的PIS值,同样能降低神经病理性疼痛大鼠的PWT值。2)炎性疼痛模型中BDNF在脊髓和背根神经节的表达增强,proBDNF在脊髓的表达无明显改变,而在背根神经节的表达增强；神经病理性疼痛模型中BDNF在脊髓和背根神经节的表达增强,proBDNF在脊髓的表达无明显改变,而在背根神经节的表达增强。结论：BDNF及其前体参与了福尔马林炎性疼痛静止相和神经病理性疼痛的调控,在这两种疼痛模型中proBDNF在到达脊髓前就转化为成体BDNF,后者通过转运至脊髓促进疼痛的发生。
参考文献：
[1]. 外周神经损伤后大鼠背根节中基因的克隆和表达[D]. 肖华胜. 第四军医大学. 1999
[2]. 正常和外周神经损伤后大鼠背根节基因表达谱的建立及差异基因的克隆[C]. 肖华胜, 韩泽广, 张方雄, 黄秋花, 陆莹谨. 中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集. 2001
[3]. TRPV4-MAPK通路在大鼠背根神经节持续受压致神经病理性疼痛中的作用机制研究[D]. 曲玉娟. 山东大学. 2016
[4]. Wnt信号通路在臂丛神经根性撕脱伤诱发的神经病理性痛中的作用机制研究[D]. 赵睿. 第四军医大学. 2015
[5]. 电针对神经病理性疼痛大鼠背根神经节Nav1.8表达影响的实验研究[D]. 王新星. 北京中医药大学. 2018
[6]. 条件性损伤对脊髓损伤后再生的作用及其机制的初步探讨[D]. 李芳. 中南大学. 2008
[7]. 基于生物信息技术的慢性疼痛致病基因分析与表达验证[D]. 李响. 中南大学. 2013
[8]. 脊髓EphB1/ephrinB1信号通路在大鼠胫骨癌痛中的作用及机制[D]. 董岩. 复旦大学. 2010
[9]. 葛根素对初级感觉神经元P2X_3受体介导的痛觉传递的影响和机制研究[D]. 徐昌水. 南昌大学. 2010
[10]. 脑源性神经营养因子及其前体对疼痛的调控[D]. 杨隆秋. 中南大学. 2010
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