（1.昌图县动物卫生监测预警中心，辽宁昌图 112599；
2.昌图县畜产品安全监察所，辽宁昌图 112599）
摘 要：本试验依据精液常温保存的原则设计了4种猪精液常温保存稀释液配方。并将新鲜精液稀释后保存于37℃水浴锅中，并测定精子的呼吸强度。从而筛选出可以在较长保存时间内维持精子较高活率的稀释剂配方。结果表明，经稀释液Ⅰ和稀释液Ⅱ稀释的精子的呼吸强度分别为6.50min、8.75min（37℃），显著优于稀释液Ⅲ、稀释液Ⅳ和对照组（p<0.05）。
关键词：猪精液；常温保存稀释液；精子呼吸强度
精子的代谢情况反映精子的品质，而精子的耗氧量是其代谢强度的重要指标。精子在呼吸过程中，要消耗溶解在精液中的氧。由于氧的耗尽，美兰褪色，美兰遇氧时又恢复其颜色（蓝色），其反应机制是由于精子脱氢酶的作用，脱去糖原上的氢原子，在无氧条件下，氢原子与蓝色的甲烯蓝（美兰）结合变成甲烯白（白色）。因此，实际上也是测定精子脱氢酶活性的一种方法。
精子呼吸强度与美兰褪色在时间上呈反比，精子密度越大，活率越高，则精子的耗氧量也越大，美兰褪色的时间也就越短。以上过程一般要求在37℃条件下进行测定。
本试验中将稀释好的精液与美兰试剂各一滴于载玻片上混匀，然后吸入到两段毛细管中约2-3cm，再将毛细管置于37℃的条件下观察美兰褪色所需要的时间。
1.材料与方法
1.1 稀释液的配制
本试验所用稀释液在试验开始前一天配制分装并保存在4℃的冰箱中待用。其配方如表1所示。
表1 猪精液常温保存稀释液配方
注：青霉素在精液稀释前单独添加。
1.2 新鲜精液的稀释与处理
采集杜洛克猪的精液60ml，用毛巾包裹后浸入盛有41℃温水的保温瓶中并迅速运回实验室，以减少温度变化对精液品质的影响。
在精液稀释前将分装的稀释液放入37℃水浴锅中升温备用，稀释精液前分别加入青霉素并使之溶解。通过对原精液的精子活率和精子密度进行测定以判定是否达到试验要求。具体过程为将一滴原精液滴在一张预热的显微镜载玻片上，制作压片进行观察。精子活力应在80％以上，才能进行下一步稀释。精子的密度主要用目测法，即分为高、中、低三级：精子头部间距小于精子体长时为高密度，等于精子体长时为中密度，大于精子体长时为低密度。本试验要求精子密度为中密度以上。
将通过鉴定的精液进行分组稀释。具体操作为首先用针管（不带针头）吸取5ml原精液分别加入2组8个离心管内，分装时动作要快但不宜过猛；然后分别用4种已升温的稀释液对其进行等温等倍稀释，稀释液温度应与精液温度基本一致，以免精子因温度突变而活力降低；稀释时，将稀释液沿瓶壁缓缓注入精液中，为使其混合均匀可轻轻晃动，但不能搅拌；稀释完毕后，立即封口并粘贴标签。最后放入37℃的水浴锅中哺育。每隔0.5h测定各稀释液中精子的呼吸强度。
1.3 精子的呼吸强度的评定
每过0.5h从37℃水浴锅中取正在哺育的精液一滴于载玻片上，然后滴加等量的美兰试剂并轻轻摇匀，再用玻璃点样毛细管吸取2~3cm精液，最后放入以白色纸张为背景的37℃水浴锅中并观察记录美兰试剂的褪色时间。
2.结果与分析
2.1 数据处理
每个处理组和对照组均设置3个重复，试验数据用Excel进行初步统计，利用SPSS软件进行统计分析，结果用平均值±标准差表示。
2.2 不同稀释液对猪精液37℃保存精子呼吸强度的影响
不同稀释液对猪精液37℃保存精子呼吸强度的影响见表2。
表2 37℃下精子呼吸强度（min）（平均数±标准差）%
根据表3分析得出：经由稀释液Ⅰ稀释过后的精子其呼吸强度最强，稀释液Ⅱ的效果次之但差异不显著。稀释液Ⅲ的效果略差于稀释液Ⅱ且稀释液Ⅳ的效果最差。
3.结论
在本试验中，稀释液I和II常温保存的精液，经过72 h保存后精子活率可达35%以上，质膜完整率45%以上，顶体完整率80%以上，表明稀释液I和II保存后精子具有较高的保护精子的能力。
姓名：陈志鸿
出生日期：1990年5月9日
性别：男
籍贯：广东揭阳
学历：硕士研究生
工作单位：广东省特种设备检测研究院
邮编：528251
职位：无（检验员）
研究方向：特种设备检测
论文作者:朱艳1，万单1，郭宏伟2
论文发表刊物:《科技新时代》2019年7期
论文发表时间:2019/9/10
标签：稀释液论文; 精子论文; 精液论文; 强度论文; 呼吸论文; 常温论文; 美兰论文; 《科技新时代》2019年7期论文;