马迪, 洪斌[1]2007年在《新型烯二炔类抗肿瘤抗生素力达霉素的研究进展》文中进行了进一步梳理带有烯二炔结构发色团的抗肿瘤抗生素力达霉素对肿瘤细胞有极强的杀伤力,是近年来发现的抗肿瘤活性较强的化合物之一,在肿瘤的化学治疗方面有良好的应用前景。本文介绍力达霉素的分子结构与生物合成、化学合成、分子作用机制与抗肿瘤活性、单克隆抗体高效偶联物、组合生物合成等方面研究的最新进展。
刘文[2]2000年在《关于新型烯二炔类抗肿瘤抗生素C-1027的生物合成研究》文中提出C-1027是由链霉菌S.globisporus C-1027产生的一种新型抗肿瘤抗生素，由一个酸性辅基蛋白和一个烯二炔的发色团非共价结合组成。辅基蛋白含有110个氨基酸残基，其编码基因csgA已被克隆和测序。辅基蛋白对于稳定发色团的结构，并使之具有水溶性具有重要作用。同时由于它的前体带有一个32氨基酸的导肽，具有把发色团输出细胞外的功能，因此可能作为抗性基因保护产生菌免受发色团造成的DNA自我损伤。发色团是抗生素C-1027的活性中心，含有一个烯二炔结构的九元环。其电子重排形成的不稳定双自由基作用于DNA的小沟，通过吸引双链上脱氧核糖的氢原子而造成DNA损伤。C-1027是现有烯二炔类抗生素中活性最强的一员，其抗肿瘤活性比临床上常用的阿霉素高出1000倍以上。近年来，由于独特的分子结构，显著的生物活性以及新颖的作用模式，烯二炔类抗生素在化学，生物和医学领域备受瞩目。对于C-1027的研究将有助于这类抗生素生物合成机制的阐明，对以此为基础采用生物及化学手段合成新型高效的抗肿瘤药物具有重要意义。 根据已知类似结构分子的生物合成途径提供的信息，C-1027的发色团可以假设由四个构建单位组成：bensoxazol inate，deoxy sugar，β-amino acid和enediyne core。首先，我们以cosmid pOJ446为载体，构建了S.globisporus C-1027的基因文库。使用一套根据不同来源放线菌dNDP-glucose dehydyatase基因的N-端保守序列而设计的引物，我们用PCR方法扩增了一条550 bp的片段，序列分析表明它是dNDP-glucose dehydyatase基因的一部分。以此片断为探针筛选基因文库，克隆了S.globisporus C-1027的染色体上大约75 kb的区域，并且dNDP-glucose dehydyatase基因(ORF 1)被定位在一条3.0 kb BamHI片段上。通过PCR和Southern杂交的方法，我们发现辅基蛋白基因cagA位于ORF 1上游约15 kb一条4.2 kb BamHI片段上。结构基因(ORF 1)和抗性基因(cagA)的连锁有力地支持了C-1027基因簇位于已克隆的80 kb区域。
李敏[3]2002年在《一. 力达霉素（C-1027）生物合成酶基因的克隆、表达和性质研究 二. 人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅰ型基因在黑曲霉中的表达》文中提出C-1027是从我国湖北省土壤中分离得到的一株球孢链霉菌Streptomyces globisporus C-1027产生的新型抗肿瘤抗生素。它具有极强的抗肿瘤活性，比临床上常用的阿霉素高1000倍以上。C-1027的分子结构由一个酸性辅基蛋白和一个发色团以非共价键结合而成，辅基蛋白含有110个氨基酸，本身无明显的抗肿瘤活性，但对维持发色团的稳定性十分重要。发色团由一个九元烯二炔核心结构与氮氧杂萘甲酸、氨基吡啶糖和β-酪氨酸四部分组成，是抗肿瘤的活性部位。其作用机理为烯二炔核心结构与DNA双螺旋小沟结合，通过电子重排形成不稳定双自由基吸引DNA脱氧核糖上的氢原子，从而切断DNA。 近年来，C-1027由于具有独特的分子结构，极强的抗肿瘤作用和新颖的作用机制而成为众多学者的研究对象。关于C-1027已见诸多报道，但尚未有C-1027生物合成酶的相关报道。刘文首次从S．globisporus C-1027中克隆获得长度为75kb，包含33个开放阅读框架(opening reading frame，ORF)的C-1027生物合成基因簇，并用基因中断和基因互补实验证实了10个ORFs与C-1027生物合成相关。为了确定这些ORF编码酶的性质，以期获得C-1027的生物合成路径，需对每个ORF的表达产物进行定性分析。在本文报道的研究中，我们选择了ORF24和ORF4为研究对象。 C-1027生物合成基因簇中ORF24的大小为1620bp，编码一个540-aa的蛋白。经同源性分析，ORF24编码的蛋白与一些不同来源的组氨酸或苯丙氨酸脱氨酶具有一定的同源性，由于脱氨过程是一个可逆反应，我们推测ORF24可能编码氨基变位酶(aminomutase)，催化α-酪氨酸转化成β-酪
张文军[4]2009年在《一株新Calicheamicins产生株小单孢菌C3509的发酵、分离纯化及其抗肿瘤活性研究》文中研究说明随着抗肿瘤“弹头”药物的抗体导向治疗的研究进展,使得一些高效但毒副作用较大的药物充分发挥抗肿瘤作用的同时避免其毒副作用。高效“弹头”药物已成为治疗肿瘤的一种利器。我们实验的目的是对用精原细胞法筛选到的菌株C-3509发酵产物分离纯化,寻找高效抗肿瘤“弹头”药物,并对其抗肿瘤活性、机理进行研究。分类培养采用通常有代表性的培养基及国际链霉菌规划会议拟定的培养基(简称ISP培养基),28℃静止培养21天,观察C-3509菌株的培养特征。颜色鉴定参考Ridgwa图谱;生理生化实验参照文献方法;细胞壁化学组份研究参照Backer、Lechevalier和Hasegawa的方法;磷酸类脂、醌类及G+C mo1%的分析按照中国科学院微生物所Ross、阮继生的方法进行。根据理化特征、生理特征及初步的16s DNA对菌株C-3509分类,其属于棘孢小单孢菌属(M echinospora)。与M.echinospora subsp.Calichensis cheamicins的产生株比较,C-3509在孢子形态、ISP系列培养基上的培养特征及对碳源利用的偏好与之不同。此外,在生长温度、细胞壁组成成份上两者也有所差别。我们在本实验室前期研究的基础上设计了含不同组份的培养基,比较其活性产物的含量。对活性产物含量高的培养基,用响应曲面法(response surfacemethodology RSM)对其培养基组份配比进行优化,首先用部分因子实验设计(Fractional Factorial Design FFD)筛选其中影响实验结果的重要因素(组份),然后重点考察筛选出的重要因素,用梯度寻优法使得因素取值接近最优化水平。我们用响应曲面法对发酵培养基优化后,分别用原发酵培养基和改进的发酵培养基进行发酵,重复两次,用DNA断裂法检测活性产物的含量,改进后的培养基发酵液对DNA切割能力比初始培养基发酵液的DNA切割能力强约30倍。接着我们用大孔吸附树脂柱层析、乙酸乙酯萃取、正已烷沉淀、硅胶柱层析、薄层层析、高效液相制备柱层析等方法分离纯化活性产物。纯化的产物通过ESI-MS来确定其分子量,HR-ESI-MS来确定其分子式。我们根据上述的纯化方法得到粗品3,然后将粗品3用HPLC-MS分析,发现其中有四种组份组份A、组份B、组份C、组份D分子量分别为1321,1367,1344,1381,分别与已知的化合物calicheamicinγ1~(Br),calicheamicinγ1~(I)。,calicheamicinβ1~(Br),calicheamicinβ1~(I)分子量相同。我们对其中含量高的B组份进一步分离,得到纯度为87.8%的C-3509B,HR-ESI-MS确定其分子式C_(55)H_(74)N_3O_(21)S_4I,辅以~1H-NMR的分析,基本确定C-3509B是已知的烯二炔类抗肿瘤抗生素calicheamicinγ_1~I。我们用DNA断裂法、MTT法检测了C-3509B的生物学活性及细胞毒性。用流式细胞术检测了不同浓度C-3509B对人肝细胞周期阻滞情况。用Western blot检测低浓度的C-3509B引起HepG2细胞周期阻滞的分子学机制。DNA断裂法检测C-3509B的最小DNA损伤浓度为0.02μg/ml,MTT法检测C-3509B对多种细胞有极强的杀伤性。流式细胞术检测表明低浓度C-3509B处理人肝癌细胞会引起细胞周期阻滞,高浓度的C-3509B处理人肝癌细胞会引起细胞内的DNA断裂。Westernblot检测表明,在C-3509B诱导Hep G2周期阻滞中可能与ATM/CHK2信号通路有关。我们以精原细胞法筛选到的小单孢菌菌株C-3509为出发菌,通过对其发酵条件的优化提高活性物质在发酵液中的含量,分离纯化出C-3509B。经过ESI-MS,HR-ESI-MS,UV和DNA断裂活性分析,推断C-3509B为Calicheamicinγ_1~I。我们对菌株C-3509分类研究表明,其是一株不同于M.echinospora subsp.Calichensis的棘孢小单孢菌。不同浓度的抗生素C-3509B对细胞有不同的损伤作用,低浓度的C-3509B会引起细胞G2/M期阻滞。C-3509B诱导Hep G2周期阻滞中可能与ATM/CHK2信号通路有关。
廖志勇[5]2000年在《抗肿瘤抗生素C-3509以及抗肿瘤生化调节剂Geldanamycin的研究》文中进行了进一步梳理为寻找高效的抗肿瘤抗生素，我们采用抗枯草杆菌法和精原细胞法追踪活性成分，从一株稀有小单孢菌C-3509(Micromonospora echinospora var．Sheshansis)的发酵液中分离到高活性初精品A(C-3509(A))和B(C-3509(B))，C-3509(A)和C-3509(B)主组分的含量分别为70％和85％。理化性质研究表明，C-3509的高活性C-3509(A)和(B)均为脂溶性抗生素；C-3509(A)为浅棕色粉末，C-3509(B)为浅黄色粉末。C-3509(A)和(B)对酸、碱、热及光照都不稳定，水溶液在低温和避光条件下比较稳定。C-3509(A)和(B)易溶于低级醇、乙酸乙酯、二氯甲烷及丙酮，不溶于水。从C-3509(B)的紫外光谱及质谱分析结果推测C-3509(B)可能为烯二炔calicheamicin类抗肿瘤抗生素。C-3509(B)在10或1.0μg／ml浓度时可不同程度地导致质粒pBR322 DNA断裂成碎片；0.1μg／ml时可将质粒pBR322 DNA造成切口，产生开环型和线型DNA。C-3509(B)在1.0μg／ml浓度下作用于HL-60细胞20分钟，用单细胞凝胶电泳法分析，荧光显微镜下可见DNA受损的细胞形同“彗星”状。C-3509(A)和(B)浓度分别低至1.0和0.1μu／ml时，精原细胞法测定为阳性。MTT法测得CDDP、MMC和C-3509(B)抑制Bel-7402细胞增殖的IC_(50)分别为1.00、0.65、0.00612μg／ml，抑制PG细胞增殖的IC_(50)分别为0.77、0.89、0.013μg／ml。克隆形成法测得ADR、MMC、C-3509(B)抑制Bel-7402细胞的克隆形成的IC_(50)分别为0.64、0.27、0.0011ng／ml。按IC_(50)比较，C-3509(B)抑制克隆形成作用分别比ADR和MMC强580和240倍。总之，从理化性质和生物活性来看，C-3509与calicheamicin相似。C-3509有可可能用作免疫偶连物的高效“弹头”而应用与肿瘤导向治疗。 苯醌安莎霉素类Geldanamycin(GDM)是具有多方面活性的抗生素，特异性地结合热休克蛋白90(Hsp90)并抑制其分子伴侣功能，引起一些客体分子，如参与增殖或生存的许多酪氨酸和丝氨酸、苏氨酸激酶在内的细胞信号传递蛋白的去稳定。MTT法测得GDM对肝癌BEL-7402和肺癌PG细胞的生长抑制IC50分别为0.28μmol／L和0.32μmol／L。GDM处理
李敏, 刘文, 李元[6]2003年在《新型抗肿瘤力达霉素合成酶基因sgcD的克隆、表达和性质研究》文中进行了进一步梳理力达霉素是由球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)C1027产生的一种新型烯二炔类抗肿瘤抗生素,具有很强的抗肿瘤活性.从S.globisporusC1027中克隆获得长度为75 kb的力达霉素生物合成基因簇,包含33个开放阅读框架(ORF).以sgcD(ORF24)为研究对象,对其功能进行了研究.基因中断实验证明,sgcD与力达霉素生物合成相关.经同源性分析,推测sgcD编码氨基变位酶,催化α-酪氨酸转化为β-酪氨酸,参与力达霉素生物合成中β-酪氨酸的合成.为了确定sgcD编码的酶的性质,将sgcD克隆至大肠杆菌表达载体pET30a中进行诱导表达,然后对表达产物进行酶学分析.实验结果表明,sgcD的表达产物具有氨基变位酶的活性.sgcD编码的氨基变位酶是第一个被定性的烯二炔类抗肿瘤抗生素生物合成酶.本研究将有助于这类抗生素生物合成机制的阐明,对改造和研发新型抗肿瘤药物具有显著意义.
朱锦桃[7]1997年在《抗肿瘤抗生素C-1027发色团烯二炔单元的合成研究》文中指出烯二炔类抗肿瘤抗生素是近年来发现的活性最强的抗肿瘤物质。我所从放线菌Stereptomyces globisporus发酵液中分离得到的抗生素C—1027由一个含九元环的烯二炔单元的发色团和外周蛋白以非共价键结合而成，含烯二炔的发色团保留整个分子的全部抗肿瘤活性。C—1027主要抑制细胞DNA的合成，对肿瘤细胞具有强烈的杀伤作用，是迄今已报道的最强的抗肿瘤抗生素之一。国外也有若干报道，目前已确定为烯二炔结构的抗生素有7种，这类抗生素的独特的分子结构、新颖的作用机制和强烈的生物活性，日益受到国内外学者的重视。 本研究旨在于探索有关C—1027的若干非环状烯二炔、九元环状烯二炔与十元环状烯二炔的合成，以便了解构效关系，为进一步修饰和研究这类抗生素奠定基础。 为合成与环戊烯骈连的九元环状烯二炔，陆续探索了四条合成路线，终于由二聚环戊烯9出发，经9步反应，制得烯炔醛40，再与由溴乙酸乙酯出发、经5步反应制得的碘代烯炔47反应，生成了关键中间体48，脱去三甲基硅基
李保卫[8]2008年在《单链抗体、RGD与力达霉素在链霉菌中的融合表达研究暨多靶点RNA联合干扰在肿瘤治疗中的应用研究》文中进行了进一步梳理第一部分单链抗体、RGD与力达霉素在链霉菌中的融合表达研究力达霉素(Lidamycin,LDM)是由球孢链霉菌C-1027(Streptomyces globisporusC-1027)产生的抗肿瘤抗生素。LDM分子由两部分组成:一为烯二炔结构的发色团(Lida-chromophore,LDC),具有极强的细胞毒作用但不稳定;一为110个氨基酸残基组成的辅基蛋白(Lida-protein,LDP),对LDC的稳定起保护作用。发色团与辅基蛋白以非共价键结合,其结合具有特异性和稳定性。LDM生物合成基因簇包括约75kb DNA中的56个开放阅读框(ORF),其中辅LDP编码基因cagA位于ORF A1与ORF A4之间。单克隆抗体与化疗药物偶联物是肿瘤靶向治疗药物的一个重要分支。特定的化疗药物与不同抗体偶联可以作为一种技术平台制备系列化的抗体药物。抗IV型胶原酶单抗及其单链抗体(single-chain Fv fragment,scFv)可以有效地抑制肿瘤细胞的生长。LDM是迄今已报道的对肿瘤细胞具有最强杀伤作用的抗肿瘤抗生素,可以作为单抗导向药物的“弹头”。本实验室已将LDP与抗IV型胶原酶scFv在大肠杆菌中成功进行融合并表达scFv-LDP,再装配LDC,形成scFv-LDM融合蛋白。本研究尝试以LDM原产生菌S.globisporus C-1027为基础,通过遗传重组构建能稳定表达并分泌scFv-LDM的链霉菌重组菌株。其策略是利用同源双交换的方法,用cagA-scFv基因序列取代LDM生物合成基因簇中LDP编码基因cagA,不改变LDM生物合成基因簇其他组分的编码基因。首先使用Pfu DNA聚合酶,以S.globisporus C-1027的总DNA为模板进行PCR反应,在辅基蛋白基因cagA终止密码子TGA两侧扩增出用于双交换的两臂——E臂和G臂;以含有scFv基因的pEFL质粒为模板,扩增scFv基因;从质粒pUO9090中酶切得到阿普霉素抗性基因片段。将上述4个片段连入带有硫链丝菌素抗性基因(tsr),且可用于接合转移的大肠杆菌菌-链霉菌穿梭质粒pBS03,最终得到用于同源双交换的含融合蛋白编码基因cagA-scFv的质粒pBS-scFv。scFv基因序列连接在cagA的C末端终止密码子之前,为了保持两个基因编码蛋白质的生物活性,在两个基因之间用编码GGGGS五肽的DNA序列连接。用构建好的质粒pBS-scFv转化大肠杆菌ET12567,通过接合转移转入S.globisporus C-1027中,筛选有阿普霉素抗性而对硫链丝菌素敏感(Am~rThio~s)的转化子,即可能为发生双交换的重组菌株。对重组菌株进行PCR扩增并对产物进行测序,Southern blot对重组菌株进行验证。结果显示,重组菌株S.globisporus C-1027-scFv构建完全正确,LDM生物合成基因簇中的LDP编码基因cagA已经被融合蛋白编码基因cagA-scFv序列所取代。构建成功的重组菌株被命名为S.globisporus C-1027-scFv。由于LDM的抗肿瘤活性和抑菌活性相互平行,本研究用抑菌活性来代替抗肿瘤活性。结果显示,重组菌株S.globisporus C-1027-scFv发酵产物具有抑菌活性。使用C1培养基对重组菌株不同发酵时间点的发酵液抑菌活性进行检测,结果发酵60小时后抑菌活性开始出现,随发酵时间延长活性逐渐增加,84小时达到顶峰,108小时后活性消失。SDS-PAGE分析显示,重组菌株S.globisporus C-1027-scFv不再产生LDM条带。然而,检测到一条新蛋白条带,相对分子质量约38000道尔顿,位置与scFv-LDM融合蛋白分子量相对应,而S.globisporus C-1027菌株中没有检测到该条带。根据以上结果,推测该新蛋白条带为scFv-LDM融合蛋白表达条带。ELISA方法检测了重组菌株发酵液抗IV型胶原酶的免疫活性,结果表明重组菌株发酵液具有IV型胶原酶结合活性。对活性发酵液样品进行Western blot检测,结果显示重组菌株发酵液在scFv-LDM融合蛋白位置显色,进一步证实发酵液中含有scFv-LDM融合蛋白。RGD三肽特异性与α_vβ_3整合素结合,而α_vβ_3整合素在很多肿瘤组织中高表达,与肿瘤的血管形成高度相关。为了构建力达霉素融合蛋白表达技术平台,我们还开展了RGD-LDM融合蛋白的研究工作。根据含RGD十肽ACRGDMFGCA的氨酸酸序列和链霉菌偏好密码子,合成十肽(ten peptide,tenp)基因序列,连接到cagA的C末端,构建了含cagA-tenp基因序列可用于同源双交换的质粒pBSten。测序鉴定正确的质粒pBSten经接合转整合到S.globisporus C-1027基因组中,根据抗性差异挑取重组子,进行PCR验证和Southern blot验证。验证正确的菌株命名为S.globisporus C-1027-tenp,抑菌圈检测显示重组菌株发酵液具有抑菌活性。综上所述,我们成功构建了重组菌株S.globisporus C-1027-scFv和S.globisporus C-1027-tenp,重组菌株S.globisporus C-1027-scFv可以产生并分泌scFv-LDM,但该重组菌株scFv-LDM的产率有待进一步提高。本研究为力达霉素融合蛋白表达技术平台的建立打下了良好的基础。第二部分多靶点RNA联合干扰在肿瘤治疗中的应用研究RNA干扰技术是一种非常有潜力的肿瘤基因治疗手段,目前用于治疗研究的RNA干扰剂主要有化学合成小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)和短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体。为了实现多基因联合干扰,实验设计并构建了一个能同时表达多种shRNA的质粒pCSH1。其优点是分子量小,可以同时携带多个shRNA转录单位,使DNA转染时只需要较小的量就可以实现有效的RNA干扰作用,从而实现多个基因的联合抑制。癌基因N-ras和c-Myc经常在肿瘤细胞中过表达或突变。在人肝癌HepG2细胞中,N-ras和c-Myc同时异常表达。本研究以N-ras和c-Myc为靶点,将该基因中的shRNA模板序列串联构建到载体pCSH1中,构建了能表达N-ras shRNA和c-Myc shRNA的双干扰载体pCSH1-NM,使该载体在导入HepG2细胞后即可同时抑制两个基因的表达。以对照载体pCSH1-mock、N-ras干扰载体pCSH1-Nras、c-Myc干扰载体pCSH1-cMyc和双干扰载体pCSH1-NM分别转染HepG2细胞,进行RT-PCR和Western blot检测。结果表明,双干扰载体能同时抑制两个基因的表达,每个基因的干扰都达到和单基因干扰载体同样的抑制效果。生长抑制实验结果表明,同时干扰N-ras和c-Myc对细胞生长抑制作用强于单独干扰N-ras或c-Myc。Hochest染色结果显示,经过pCSH1-NM质粒瞬时转染处理后,凋亡细胞比例增加,凋亡细胞百分比明显高于N-ras或c-Myc单独干扰组。结果提示同时干扰N-ras和c-Myc能明显增强凋亡诱导作用。pCSH1-Mock转染组和空白对照组结果基本一致,且细胞密度明显高于pCSH1-Nras或pCSH1-cMyc单独转染组以及pCSH1-NM转染组。这些结果说明,人肝癌HepG2细胞凋亡主要是由N-ras或(和)c-Myc基因抑制引起的。基因芯片分析结果表明,N-ras单基因干扰引起的基因变化(显著升高或降低)数明显高于c-Myc单基因干扰引起的基因表达变化数。N-ras与c-Myc双干扰引起的基因表达变化数介于二者之间。3个促凋亡基因TSC22,GMF和NRIF3在pCSH1-NM组与pCSH1-cMyc同时上调,说明N-ras和c-Myc基因可促进HepG2细胞调亡。综上所述,HepG2细胞中异常表达的N-ras和c-Myc可以通过RNA干扰手段同时抑制,且N-ras和c-Myc双基因干扰比N-ras或c-Myc单基因干扰在抑制细胞生长和促进HepG2细胞凋亡方面更为有效。RNA干扰介导的多靶点基因治疗有望成为一种有效的肿瘤治疗手段。
参考文献：
[1]. 新型烯二炔类抗肿瘤抗生素力达霉素的研究进展[J]. 马迪, 洪斌. 中国抗生素杂志. 2007
[2]. 关于新型烯二炔类抗肿瘤抗生素C-1027的生物合成研究[D]. 刘文. 中国协和医科大学. 2000
[3]. 一. 力达霉素（C-1027）生物合成酶基因的克隆、表达和性质研究 二. 人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅰ型基因在黑曲霉中的表达[D]. 李敏. 中国协和医科大学. 2002
[4]. 一株新Calicheamicins产生株小单孢菌C3509的发酵、分离纯化及其抗肿瘤活性研究[D]. 张文军. 中国协和医科大学. 2009
[5]. 抗肿瘤抗生素C-3509以及抗肿瘤生化调节剂Geldanamycin的研究[D]. 廖志勇. 中国协和医科大学. 2000
[6]. 新型抗肿瘤力达霉素合成酶基因sgcD的克隆、表达和性质研究[J]. 李敏, 刘文, 李元. 中国科学(C辑:生命科学). 2003
[7]. 抗肿瘤抗生素C-1027发色团烯二炔单元的合成研究[D]. 朱锦桃. 中国协和医科大学. 1997
[8]. 单链抗体、RGD与力达霉素在链霉菌中的融合表达研究暨多靶点RNA联合干扰在肿瘤治疗中的应用研究[D]. 李保卫. 中国协和医科大学. 2008