徐松云[1]2006年在《基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱的新基质及其应用》文中认为DIOS-MS技术在低分子量范围内克服了有机基质离子信号的干扰,实现了对小分子化合物和肽段的分析。大多数酶的底物都为小分子化合物,采用DIOS-MS技术检测酶催化底物生成的产物,可以监测酶的催化活性。胰蛋白酶修饰的多孔硅晶片对蛋白的原位酶解和原位肽谱分析提供了一个快速的和灵敏的工具。在对蛋白细胞色素C和牛血清白蛋白的鉴定上,取得了良好的序列覆盖度。亚胺二乙酸衍生的多孔硅表面可以对含有干扰物如尿素和表面活性剂的蛋白质样品进行预处理,通过清洗其表面,从而实现对蛋白质分子的MALDI质谱分析。此外,衍生化的多孔硅表面还可以转化为铁离子衍生的多孔硅表面,能从磷酸化蛋白酶解产物特异性地和选择性地纯化和富集磷酸化肽段。我们筛选出应用于MALDI分析的新基质3, 4-二氨基苯基苯甲酮,新基质对样品溶液中的污染物如盐酸胍和尿素表现出相对较好的抗干扰能力。此外, 3, 4-二氨基苯基苯甲酮在MALDI质谱分析中能有效抑制金属离子的加和现象。通过电弧法制备的多壁碳纳米管首次用作MALDI基质,用于代替有机基质检测样品分子,发展了碳纳米管上的解吸离子化飞行时间质谱技术分析小分子化合物。在脉冲激光的照射下,碳纳米管充当有机基质吸收能量,然后传递给样品分子,成功实现了对小肽,药物,糖类化合物和核苷类小分子化合物的分析。该方法为MALDI质谱在小分子化合物分析中的应用提供了新的途径。
张清春[2]2001年在《多孔硅和硅胶作为基质的激光解吸离子化飞行时间质谱》文中研究表明多孔硅表面的解析离子化质谱（DIOS）是一种新的生物质谱分析方法。具有纳米结构的多孔硅吸收激光能量并使待测分子解吸离子化。该方法克服了MALDI-TOF-MS技术中的基体干扰现象，适合进行小分子分析。用该方法本论文进行了氨基酸、肽、糖以及有机合成产物的分析测定。 针对DIOS中存在的一些问题，本论文对多孔硅进行了处理，提出了新的样品制备方法，可以扩大测定范围，消除吸附杂质等的干扰。并对DIOS的机理做了一定的探索。发现该方法与多孔硅的光致发光特性及表面疏水性无关，而与多孔硅的孔结构有关。 为了证明孔结构对解吸离子化的重要作用，我们用多孔硅胶及其衍生物作为无机基体材料进行质谱分析，在小分子分析中得到了较好的结果，克服了常规MALDI中的基体干扰信号。此外，本论文研究了硅胶的粒度、孔径大小、硅胶表面不同性质的基团对质谱图的影响情况。 本论文中将多孔硅表面进行处理，使其接上活性蛋白质基团BSA，形成亲和靶，用来研究小分子药物与蛋白质的非共价相互作用情况。亲和靶还可以固定胰蛋白酶，用来酶切蛋白进行肽谱研究。亲和DIOS技术中不使用基体，不会使配基变性，也不会有基体峰干扰小分子样品的测定。此外，多孔硅的比表面较大，键合量较大。所以，该方法在药物筛选中可能会有较好的发展前景。
单喆[3]2006年在《大孔径新型介孔材料用于生物质谱基质及蛋白分子特异性富集和酶解载体的研究》文中研究说明本论文工作的主要贡献是研究了多种不同的新型无机介孔材料在生物质谱以及蛋白分子特异性富集和快速酶解技术中的首次应用,对将生物分析科学与介孔材料科学领域的结合进行了探索性的研究,具有一定的理论和现实意义。生物质谱在最近的20多年间得到了迅猛的发展。由于其信号检测灵敏、速度快以及种类多样化的优点,生物质谱已经成为生物分析领域中最前沿研究如蛋白组学研究的支撑技术。其中,以基质辅助激光解吸(MALDI)为离子化方法、以飞行时间(TOF)为质量分析器的生物质谱,具有良好的质量精度、分辨率和灵敏度,且操作简便,常常被用于分子量大于500的肽段测定和通过肽质量指纹谱(PMF)进行蛋白鉴定。另一方面,实际的生物分析样品大多是组成复杂的混合物,在进行生物质谱测定之前需要进行分离、富集等处理;在进行肽段分析之前,蛋白样品也需进行彻底的酶解反应。目前,随着低丰度的后修饰蛋白的深入研究和以小分子为对象的代谢组学的兴起,进一步发展生物质谱技术对于小分子样品的分析、低丰度蛋白的富集和快速酶解新技术显得尤为重要。自90年代初,介孔材料MCM－41首次被合成以来,介孔材料的制备方法得到了不断的完善,已日趋成熟,这使得介孔材料的种类和结构也得到不断地创新和突破。新型的介孔材料具有不同的组成、较高的比表面积、较大的孔径、开放的孔道等特点,在吸附、催化、光学和电子器件等方面有着潜在的应用前景。目前,如何将合成的介孔材料投入到实际应用中去是材料学家们思考的焦点问题,尤其是随着介孔材料对生物分子吸附行为的不断研究,与生物分子具有相融性的介孔材料在生物技术中的应用越来越引起人们的关注。同时,将介孔材料应用到生物技术中也为解决现存的生物分离、分析技术问题提供了新的切入点。本论文工作共包括以下叁个部分:第一部分介孔MALD工基质的研究有机基质的引入使得MALDI质谱在生物分子的分析领域中取得了成功而广泛的应用。但同时有机基质本身也存在着一些不可避免的问题,如低分子量范围内的复杂背景的存在严重影响了小分子样品的测量,有机基质的MALDI对生物样品中的共存金属盐的耐受度也很有限,盐对质谱信号的抑制作用明显。无机材料作为MALDI基质的研究一直受到关注,尤其是近几年,无机基质的灵敏度和产生的谱图效果都有了进一步的提高。本论文研究了介孔材料作为无机基质在质谱中的应用。实验结果发现,不同组分的介孔材料对分析物的电离能力表现出极大差异,材料对样品的电离能力与其紫外吸收趋势相一致,即紫外吸收越强,电离能力越强。以紫外吸收强的氧化钛一氧化铈混合氧化物(CeTi0)为基质检测低皮摩尔级浓度的聚丙酸甘油(PPG),可以得到信噪比良好的谱图,这相对于已有文献所报道的纳摩尔级检测水平有了很大的提高。以标准的环十肽Gramicidin S为样品分别测试了四种具有不同孔结构的氧化钛-氧化钨混合氧化物(WTi0)作为MALDI基质时的质谱信号,发现以有序介孔材料作为基质解吸得到的样品离子强度明显高于无孔和无序介孔材料,其原因可能是有序介孔结构既为吸附生物分子提供了高的比表面积,同时又有利于样品分子的解吸过程。利用有序介孔基质成功地检测到低分子量小肽,弥补了有机基质的弱点。相对于有机基质,介孔材料也显示出极好的耐盐性,样品溶液中共存的钾盐成份并没有抑制肽信号的检测,相反地,可以有效地提升样品的信号强度。在优化了的样品制备条件下,有序介孔基质对复杂的马心肌红蛋白的酶解肽段进行检测,并利用PMF方法成功完成蛋白鉴定:同时选择了较短的酶解肽段HKIPIK进行了有效的串级质谱分析。本部分的研究显示有序介孔无机基质有望在小分子(如药物分子)和生物短肽的MALDI－TOFMS分析中得到广泛的应用。第二部分介孔氧化铁对生物分子的特异性富集磷酸化修饰是蛋白组学中蛋白翻译后修饰研究的重要内容。由于磷酸化蛋白质在生物体内的含量很低,以及磷酸肽在正离子模式质谱中的离子化效率较低,所以在对它的质谱检测和位点分析之前需要进行富集、分离预处理。目前最广泛采用的磷酸化肽段富集技术是固定金属亲和色谱法(IMAC),此方法中,键合在螯合底物上的金属离子(通常是Fe~(3+)或Ga~(3+))选择性地与磷酸化肽相结合,并且在高pH或磷酸缓冲液中可以释放出磷酸化肽,从而实现其与非磷酸化肽的分离。但该方法操作复杂,混合液中含有带较多酸性残基的肽段时的亲和选择性较低,虽然利用其螯合铁填料直接点样进行质谱检测可以简化操作,但对多磷酸化肽段具有一定的歧视效应。本论文发展了一种利用介孔氧化铁对磷酸化肽段进行富集分离、直接进行靶上点样分析的简易新方法。首先利用尿素和甲醛的缩聚来诱导氢氧化铁溶胶粒子间的聚集、高温焙烧获得晶化了的大孔径氧化铁微球材料,然后将大孔径氧化铁微球材料用于磷酸化肽段的富集分离。通过一系列的富集条件优化实验,选择在含有30%乙腈、0.1%乙酸的溶液中进行氧化铁微球分别对非磷酸化和磷酸化磷蛋白混合物、磷酸化蛋白混合物的酶解肽液中的磷酸化肽段进行的选择性亲和吸附,离心、去上层清液后,利用pH值为10的氨水溶液重新分散氧化铁沉淀,将所得氧化铁颗粒悬浮液直接点样后进行质谱分析,结果显示出介孔氧化铁对磷酸化肽段具有快速、有效的富集分离能力。与传统IMAC方法相比较,介孔氧化铁富集技术步骤简单,具有更高的亲和选择性。而且,这种直接点样的方法对多位点的磷酸化肽段也能够实现有效的富集、检测。同时,通过与商品化无孔的纳米氧化铁材料富集效果的比较,证明介孔氧化铁的介孔表面在高效的磷酸化肽段富集中发挥了重要的作用。第叁部分介孔材料在蛋白酶解中的应用胰蛋白酶酶解反应是蛋白组学研究中利用质谱进行蛋白鉴定之前所必需的关键步骤。目前,蛋白组学研究中最普遍的蛋白质酶解方法包括胶上酶解和溶液酶解,但这两种酶解方法都需要较长的反应时间(数小时至过夜),一定程度地限制了蛋白组学研究中蛋白分析的快速、高通量要求,而固定化酶技术可以极大地提高酶解速度到秒级。本论文利用大孔径硅质介孔泡沫材料(MCF)作为酶固定化材料以及毛细管柱填料,对蛋白柱上酶解进行初步探索。通过蛋白自动进样系统,溶解在碳酸缓冲液中的标准马心肌红蛋白,在以纯水为流动相的条件下,经过装有已固定蛋白酶的二氧化硅介孔泡沫填料的毛细管柱,流出液直接点靶板进行质谱分析,结果表明该酶解技术方法快速、高效,在秒级的酶解反应时间内,酶解肽段覆盖率达95.42%,远远高于相同时间内传统溶液酶解所得肽段的覆盖率(26.79%)。而用孔径较小的SBA－15作载体的毛细管柱酶反应器所得的酶解肽段覆盖率仅为22.22%,原因可能是介孔泡沫的超大孔径能够保证蛋白在柱中已吸附有蛋白酶的介孔孔道里自由扩散,大大增加了蛋白与酶的接触机率,从而提高了酶解效率。利用大孔径MCF材料填充的毛细管柱酶反应器还具有可在常温下进行酶解、可重复使用、酶活性持久的优点。另外,在MALDI靶板上也可以实现蛋白的快速酶解。本论文考察了多种介孔材料(包括FUU－12、SBA－15和WTi0)对靶上酶解效率的影响,实验结果表明,在靶板上加入适量的介孔材料可以有效地提高酶解效率。而结构相近的SBA－15和wTi0对靶上酶解效率提升的程度不同,SBA－15的提升程度相对地小一些,原因可能是WTi0的MALDI基质特征有利于酶解产物从材料表面的解吸。
郭忠[4]2003年在《固定化酶微反应器和混合基体应用于MALDI TOF-MS的肽谱分析和小分子分析》文中研究指明以各种软电离技术为手段的生物质谱的兴起标志着质谱学从近代结构和分析化学领域进入生命科学范畴。基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)作为生物质谱最主要的组成部分之一，由于其分析速度快、灵敏度高、适合于复杂体系分析及抗杂质干扰能力强的特点，成为当前质谱领域中的研究热点。 本论文利用熔融石英毛细管为载体，制备了共价键合及金属螯合两种蛋白质水解酶固定化微反应器。利用微反应器水解蛋白样品、质谱检测水解产物然后将所获得的肽质谱图用于蛋白质数据库检索，从而建立了微量蛋白质的快速结构分析和鉴定方法。实验表明这种方法可以对低达9 fmol的蛋白质进行鉴定。 针对常规光谱法测定酶微量反应困难的问题，采用MALDI TOF-MS质谱方法来表征固定化毛细管微反应器酶的活性。以精氨酸及N_α-苯甲氧羰基-L-精氨酸为内标物首先考察了MALDI质谱定量分析能力，同时通过对质谱法和常规分光光度法测定胰蛋白酶活性的比较，验证了质谱方法的可行性。进而对固定化酶的最适反应pH值、温度、稳定性等性质进行考察，并测定出其反应动力学常数K_m。 针对MALDI分析小分子时常规有机基体信号干扰问题，提出利用在常规基体中加入表面活性剂以抑制基体信号的新方法，成功地进行了低分子量化合物的分析。考察了表面活性剂与基体浓度的比例对质谱分析结果的影响，并对离子化机理进行推测，同时应用这种方法对氨基酸、多肽和药物等小分子进行了分析。此外还考察了该方法定量分析的可行性。
谷雪[5]2005年在《新型毛细管液相色谱柱的研制及其相关应用》文中指出毛细管液相色谱柱是微分离分析的核心，也是毛细管分析技术的瓶颈。研究新型、实用、专用的毛细管色谱柱，揭示其分离机制，且与相关技术相结合，始终是毛细管微分析的首要任务。溶胶凝胶(sol-gel)技术是色谱分析领域一种灵活多变的、简单易行的固定相制备技术。溶胶凝胶技术与包覆型复合填料制备结合，是一个全新的交叉点。传统包覆型复合填料制备过程中聚合物的固载化方法通常涉及自由基引发的交联反应，这种方法不易控制，交联重现性差。探索性地采用溶胶凝胶固载化技术将气相固定液包覆并固载在无机载体表面，制备出具有不同色谱选择性的复合型固定相，无疑有利于拓展溶胶凝胶技术的应用范围和开展相关复合型色谱柱保留行为的研究。溶胶凝胶技术与普通毛细管填充柱相结合，制备的细内径颗粒固定化无塞整体柱已在毛细管电色谱领域得到应用。在此基础上，开创性制备高性能大口径无开裂颗粒固定化无塞整体柱，并将其应用于复杂蛋白质组学样品的固相预富集，无论从柱制备技术还从应用范围，是一项创新性和实用性兼备的工作。发展高通量、高峰容量、高分辨率的新型蛋白质组学技术平台已成为当务之急。鉴于蛋白质组学样品的复杂性和现有二维液相／串级质谱体系有限的运行通量，建立一个新型的和实用性极强的蛋白质组学分析技术平台，无疑对蛋白质组学多维色谱技术的发展提供了有益的支持。本论文以溶胶凝胶技术制备毛细管色谱柱为核心，研究开发了新型实用的毛细管色谱柱，并在此基础上开展相关研究和应用工作。制备出气相固定液包覆硅胶复合型固定相，并与线性溶剂化相关能色谱理论相结合，研究其分离机理和色谱行为；制备了大口径颗粒固定化型无塞整体柱，对其作为肽段预富集柱的性能指标进行了测试和评价；搭建了蛋白质组学阵列式全多维色谱分离技术平台，将所制备预柱应用其中，提高和拓展多维色谱分离技术的分离性能。本论文共分五章。主要内容摘要如下：第一章总结了毛细管色谱柱的发展概况和溶胶凝胶技术在色谱固定相制备领域的应用及进展，同时概述了蛋白质组学多维色谱技术的发展及新型色谱柱与之相结合的应用前景。介绍了本论文选题的目的和意义。第二章开创性地采用溶胶凝胶法制备了气相固定液包覆硅胶复合型固定相。详细考察研究了制备中对色谱柱性能影响的主要因素，通过优化气相固定液的用量、溶胶凝胶前驱体的体积浓度和柱内反应时间及温度，确定了最佳包覆工艺条件，明确了用溶胶凝胶法进行聚合物包覆无机载体的可行性。以不同极性的的芳香族化合物为探针，测试评价了合成固定相的色谱性能。结果表明，所制备的复合型SE-30包覆硅胶固定相分离性能良好，柱效可达10000／m，耐碱性良好，对碱性化合物的分离存在一定程度的色谱峰拖尾。疏水选择性和绝对流动相灵敏度的检测表明，该固定相具有反相固定相保留的特征。第叁章利用线性溶剂化相关能理论(LSERs)对不同气相固定液(SE-30，SE-54，OV-1701)包覆硅胶固定相的反相色谱行为分别做了研究，建立了线性良好的化合物保留预测方程，并与碳十八键合硅胶固定相的溶质保留行为做了比较。研究表明，气相固定液包覆硅胶固定相与碳十八键合硅胶固定相(ODS)在保留机理上有很大不同，溶解机理多于吸附机理。溶质的体积，偶极性／极化率，氢键给体酸性和氢键受体碱性共同成为决定溶质保留主要因素。另外固定液包覆硅胶固定相与溶质之间可以发生很强的π-π作用，因此它对强偶极性极化率的化合物选择性较高。由于保留机理不同，气相固定液包覆硅胶固定相和ODS固定相对于相同的化合物将表现出不同的选择性。无疑这对满足实际样品分析中复杂的分离要求提供了一个新的手段。另外，所制备固定相的选择性可通过改变包覆的聚合物的类型来控制，相比通常情况下反相液相色谱中只靠改变流动相配比来控制分离选择性，无疑具有机动灵活的优势。第四章用溶胶凝胶法以甲基叁乙氧基硅氧烷为单一前驱体成功制备出了内径为320μm和530μm的大口径无开裂的颗粒固定化型无塞整体柱。首先对柱制备的溶胶凝胶配方和工艺条件进行了优化，摸索出的制作工艺简便易行，可靠性和可控性强，避免了批量装填短柱的繁琐和费时，提高了预柱制备重现性和批量生产可能性。其次，我们将其作为肽段预富集柱应用于多维液相色谱平台，对预富集柱的相关性能指标进行了测试和评价，探讨了最佳富集条件。建立了在线预富集／分离检测体系，利用六通阀将毛细管预柱与毛细管反相分离柱相连，联用紫外检测。结果表明，自制的320-μm-i．d．和530-μm-i．d．的预柱机械强度高，长度5mm即可耐压至300bar，且通透性良好。富集流速可达60μL／min，样品负载量高达70μg，回收率90％，浓度线性回归系数R~2=0.99，富集倍数达60倍。重复使用150次，重现性和化学稳定性依然良好。因此自制预富集柱能够方便快捷地实现肽段的除盐和高倍浓缩，极大改善了样品上样量、分析灵敏度和检测限，非常适合应用于二维液相色谱分离技术平台。第五章搭建了新型阵列式二维液相色谱分离-MALDI-TOF-TOF-MS检测技术平台，将自制预富集柱应用于样品的在线预处理，对人肝组织的蛋白质组进行了高效分离和检测。多通道式的并行接口模式使系统在第二维18根反相柱上实现并行式洗脱，使样品分析时间缩短18倍。该平台以强阳离子交换色谱(SCX)为第一维色谱分离模式，以反相液相色谱(RPLC)为第二维分离模式，可快速完成进样，浓缩除盐、分离及鉴定，实现真正的蛋白质组学研究所需的高通量分析。SCX柱采用阶梯式盐梯度洗脱，洗脱下来的组分通过两个十通阀的切换被依次保留在18个自制预富集柱的柱头，进行样品的浓缩和除盐。然后经多通道式接口被并行反冲到相应的反相色谱柱上，在18根反相色谱柱上同时完成色谱分离。色谱流出物通过一个自行设计加工的接口实现并行式点样到MAIDI靶板上(点样频率15s／次)，最后联用MALDI-TOF-TOF-MS快速鉴定。整个系统对300μg人肝蛋白酶解肽段进行了分离鉴定，共鉴定出462个蛋白。
靳文海[6]2005年在《多维液相色谱-质谱联用技术在蛋白质组学中的应用》文中认为由于血浆中蛋白质的种类繁多,各组分含量的动态分布范围很大,采用二维液相色谱对人血浆样品首先进行蛋白质水平上的分级,收集到的组分分别酶解后再利用毛细管液相色谱—电喷雾—串连质谱分析,在人类蛋白质组学组织(HUPO)建议的较为严格的数据库搜索标准下,成功鉴定到了1292种蛋白质,有效避免了常规方法中去除高丰度蛋白质给血浆中低丰度蛋白质所带来的损失,从而大大提高了鉴定到的蛋白质的数量。 采用固定化金属亲和色谱对小鼠肝组织蛋白质酶解所产生肽段进行亲和纯化,富集到了大量的磷酸化肽段,之后利用纳升级毛细管液质联用系统进行分析,成功鉴定到了26段小鼠肝组织的磷酸化肽段的26个磷酸化位点,并对磷酸化肽段的质谱行为做了分类总结。建立了对组织样品进行磷酸化蛋白质分析的方法。 充分利用了磷酸化肽段在聚苯乙烯类色谱柱上不保留或保留很弱以及磷酸化肽段在碱性条件下通常带有较多负电荷的特点,采用新型一体柱在碱性条件下上样和pH台阶梯度洗脱,有效富集了小鼠肝组织酶解肽段中的磷酸化肽段。通过对收集到的酸性洗脱液中肽段的质谱分析,成功鉴定了31组蛋白质的37段磷酸化肽,确定了46个磷酸化位点。 通过改变聚合单体的比例和添加新的致孔剂,快速制备出了聚苯乙烯类毛细管电色谱整体柱,并成功分离了苯的同系物、苯胺、荷尔蒙、碱性药物、肽段以及小肽的同分异构体,最高柱效超过20,000N/m。
参考文献：
[1]. 基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱的新基质及其应用[D]. 徐松云. 中国科学院研究生院（大连化学物理研究所）. 2006
[2]. 多孔硅和硅胶作为基质的激光解吸离子化飞行时间质谱[D]. 张清春. 中国科学院大连化学物理研究所. 2001
[3]. 大孔径新型介孔材料用于生物质谱基质及蛋白分子特异性富集和酶解载体的研究[D]. 单喆. 复旦大学. 2006
[4]. 固定化酶微反应器和混合基体应用于MALDI TOF-MS的肽谱分析和小分子分析[D]. 郭忠. 中国科学院研究生院（大连化学物理研究所）. 2003
[5]. 新型毛细管液相色谱柱的研制及其相关应用[D]. 谷雪. 复旦大学. 2005
[6]. 多维液相色谱-质谱联用技术在蛋白质组学中的应用[D]. 靳文海. 中国科学院研究生院（大连化学物理研究所）. 2005
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