陈瑜[1]2004年在《乙肝病毒感染的特异性CTL应答机制研究》文中指出[背景和目的] HBV感染肝细胞后，病毒抗原被抗原提呈细胞(APC)的蛋白酶体裂解成小分子的寡肽，并与肝细胞内HLA—Ⅰ类分子结合成复合物，表达于细胞表面，成为T细胞表位。CTL通过表面的CD8~+分子与HLA—Ⅰ类分子产生粘附，并由TCR识别上述寡肽表位，此类CTL即为HBV抗原特异性CTL(HBV antigens specific cytotoxic lymphocytes，HBV sCTL)。近期一系列的研究显示，乙肝病毒抗原特异性细胞毒T淋巴细胞应答在乙肝感染中有重要意义。HBV特异性CTL通过分泌大量IFN-γ等发挥非损伤清除HBV作用，这种作用发生在肝细胞损伤前，后续引起的肝细胞损伤可能与特异性应答后引起非特异性免疫活性细胞在肝内浸润、凋亡激活等有关。进一步研究揭示，HBV特异性应答功能的差异与乙肝患者的不同临床转归密切相关。在自限性急性乙型肝炎患者中，特异性CTL应答作用强，可能与病毒被迅速清除而肝细胞损伤轻有关，而在慢性乙型肝炎患者中，特异性CTL应答能力弱，可能与清除病毒能力不足而导致炎症细胞浸润和慢性化有关。新近研究认识到，通过刺激特异性CTL应答可能是促进慢乙肝患者病毒清除和机体恢复的一种有效途径。本课题受上述研究启发，采用以主要组织相容性复合物—抗原肽四聚体(HLA—肽四聚体，Tetramer)流式细胞技术为核心的HBV特异性CTL实验研究新技术，围绕具有典型的清除病毒和肝细胞损伤双重作用的乙型重型肝炎患者为主要研究对象，对乙肝病毒感染的特浙江大学博士学位论文异性CTL应答机制作初步探讨，旨在为乙肝的发病机理研究、有效防治等提供新的思路和新的实验研究技术平台。l材料和方法】1.研究对象自2002年2月一2003年8月间收治的慢性乙肝患者共34例，经组织分型技术获得HLA一A2‘19例，包括男n例，女8例，年龄16一54岁，平均年龄32岁;余15例HLA一A2一作为对照组，包括男10例，女5例，年龄28~49岁，平均年龄34岁。血清HBsAg阳性的病毒携带者25例，其中HLA一A2’14例，包括男7例，女7例，平均年龄36岁;余n例HLA一A2一作为对照组，包括男5例，女6例，平均年龄34岁;急性乙型肝炎患者共10例，其中HLA一A2’6例，包括男5例，女1例，年龄30一56岁，平均年龄42岁，余4例HLA一A2一作为对照组，包括男3例，女1例，年龄26一42岁，平均年龄35岁。经组织分型为HLA一A2+的乙型重型肝炎患者共42例，分成两组:一组为急性乙型重型肝炎，共20例，其中男12例，女8例，年龄18一46岁，平均年龄30岁;另一组为慢性乙型重型肝炎，共22例，其中男巧例，女5例，年龄33一65岁，平均年龄45岁。全部符合2000年中华医学会传染病与寄生虫病分会、肝病学分会联合修订的病毒性肝炎诊断标准。HLA一A2+的健康人15例，检测血清甲、乙、丙、丁、戊肝炎病毒标志物以及HIV抗体等均阴性，作为正常对照组。2.实验方法 (l)外周血单个核细胞(PBMO分离:空腹静脉采集全血标本，采用淋巴细胞分离液分离PB珑。 (2) HLA分型技术:采用流式细胞技术快速检测HLA一A2抗原分型，并用序列特异引物聚合酶链反应(Sequenee sp舰ine Primer Polymera:e Chain Reac幼on，SSP-PCR)分型技术确认。 (3) Tetramer流式细胞技术测定PB就中特异性CDS℃TL数量:采用藻红蛋白 (PE)标记的HLA一肤四聚体(Tetramer)和荧光色素(FITC)标记的anti一DS+，通过双色标记流式细胞技术检测分别针对HBv corels一27、polym~575一583和envelo伴335一 343表位的特异性的CDS‘T细胞，并以针对HCvC区178一187表位乙肝病毒感染的特异性CTL应答机制研究陈瑜2001年秋2浙江大学博士学位论文的Tetralner作为对照。计数50 000个CDS‘阳性细胞，同时计数CDS+和Tetralner双阳性细胞为特异性CDS+细胞，并以占总计数CDS’细胞的百分比表示。(4)EI ispot技术测定特异性CTL表达INF一Y、TNF一a、IL一4和IL一10水平:按照试剂盒说明，先将针对上述细胞因子的特异抗体包被于专用酶标板中，再加入经HBV eorels一27肤段刺激、RPMll640培养36h的PB毗，孵育后加入第二抗体，经底物显色反应，用解剖显微镜观察计数整个视野紫色斑点数量，代表表达水平。(5)特异性eTL裂解靶细胞能力测定:采用CytoTox96 Non一RadioaetiveCytotoxieity Assay试剂盒，将经HBv eore18一27短肤、重组乙肝病毒核心抗原(rHBcAg)共刺激培养13日的PBMC与HLA一A2+的靶细胞(B一LCL)按一定比例混合，靶细胞被裂解后，释放的乳酸脱氢酶与底物反应显色，酶标仪测定吸光度，吸光度与裂解程度成正比，按照公式计算百分裂解率(%)。 (6)血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定:使用HITACHI 7600一110型全自动生化分析仪测定。 (7)血清pZ微球蛋白(p 2 mierog一obu一in，pz一Me)测定:采用AxsYM全自动免疫分析系统的微粒子酶免疫分析技术(microparticlee拓理meimmunoassay，MEIA)测定。 (8)血清细胞因子INF一Y、TNF一a、IL一4和IL一10测定:采用定量ELISA技术测定。(9)血清HbcAg测定:采用AssYM全自动免疫分析系统的微粒子酶免疫分析技术(ME认)定量测定。 (10)数据的统计学处理:?
田瑛[2]2006年在《HBV感染：宿主细胞免疫应答与临床转归》文中提出目的： 通过比较慢性乙型肝炎患者、HBV携带者、HBV隐性感染者的T细胞亚群、HBV特异性T细胞应答以及外周血Treg比例来分析宿主的细胞免疫状态对HBV感染后临床转归的影响，探讨乙型肝炎的发病机制，为慢性乙肝的治疗提供新的线索。 方法： 选取2004年2月至10月在北京协和医院肝炎门诊就诊的慢性乙型肝炎患者35例，HBV携带者25例，HBV隐性感染者12例为研究对象，另外选取35例健康献血员作为正常对照： 1)使用流式细胞仪检测慢性乙肝组、HBV携带者组及正常对照组外周血T细胞亚群，测定T细胞、B细胞、NK细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+CD28+T、CD8+CD28+T、CD4+CD45RA+62L+纯真T细胞、CD4+CD45RA-记忆／效应T细胞以及CD8+CD38+T细胞激活亚群比例及绝对计数的变化。另外选取HIV感染者47例和HIV／HBV共感染者11例作为对照，比较这两组与慢性乙肝组CD8+CD38+T细胞激活亚群比例的差异。 2)以重组乙型肝炎病毒核心抗原和5个HLA-A2限制性的乙型肝炎病毒合成肽段作为刺激原，使用ELISpot法检测慢性乙肝组、HBV携带者组、HBV隐性感染组病毒特异性的CD4+T细胞应答强度以及CD8+T细胞应答强度和宽度，比较各组之间差异并探讨其意义。 3)使用流式细胞仪检测慢性乙肝组、HBV携带者组、HBV隐性感染组及正常对照组外周血调节性T细胞(Treg即CD4+CD25+CD45RO+T细胞)的比例，比较其差异并分析其意义。 结果： 1)慢性乙肝组和HBV携带者组与正常对照组相比外周血白细胞、淋巴细胞、T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+CD28+T细胞和CD8+CD28+T细胞计数均显着减少，但其比例叁组间无显着性差异；慢性乙肝组NK细胞计数较正常对
张亚丽[3]2008年在《小鼠LIGHT真核表达载体的构建及其与乙肝核酸疫苗的联合免疫研究》文中认为感染HBV能导致急性、慢性肝炎,与肝硬化及肝细胞癌有密切关系。目前,控制HBV感染的有效方法是接种乙肝疫苗。基因疫苗的兴起和发展为乙型肝炎病毒感染的防治提供了新的途径。基因疫苗可诱导机体产生细胞及体液免疫反应,特别是诱导细胞免疫反应的能力优于蛋白、多肽类疫苗,在乙型肝炎病毒的清除方面具有较好的应用前景,更适应于慢性病毒感染的预防与治疗。核酸疫苗的免疫效果在不同动物个体中差异较大,某些肿瘤及病毒的T、B细胞表位抗原性弱,难以诱导有效的T、B细胞免疫应答,提高核酸疫苗的免疫效果已成为研究热点。基因佐剂是将编码某些细胞因子及T、B细胞表面共刺激分子等的基因与目的基因克隆于同一载体或不同载体共同免疫动物,其表达的相应蛋白可起到佐剂的作用,从而大大增强T、B细胞的免疫应答水平。LIGHT是TNF配体家族的成员,可以共刺激T细胞增殖。HVEM是LIGHT介导T细胞活化的受体,LIGHT通过与HVEM结合发挥共刺激作用,参与T细胞增殖和细胞因子的产生。越来越多的证据表明LIGHT与其受体的相互作用可作为控制细胞免疫应答的潜在目标。本研究对小鼠LIGHT作为乙肝核酸疫苗的基因佐剂方面进行了初步研究。在克隆小鼠LIGHT基因的基础上,构建其胞外段基因的原核表达载体,在大肠杆菌中进行诱导表达并对其表达条件进行了初步的探索;构建LIGHT全长基因的真核表达质粒并在体外转染细胞,检测结果表明真核表达质粒中的LIGHT基因可在哺乳动物细胞中进行表达;混合淋巴细胞反应中LIGHT转染的树突状细胞可显着增强同种异体T淋巴细胞增殖;将LIGHT真核表达质粒与乙肝核酸疫苗质粒联合免疫Balb/c小鼠,细胞免疫与体液免疫功能检测结果表明LIGHT可以增强小鼠体内的特异性免疫应答,从而发挥免疫佐剂的作用。
周承[4]2008年在《CTLA-4胞外段与HBsAg融合DNA疫苗增强抗HBV免疫的研究》文中进行了进一步梳理乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是世界性的公共卫生问题,HBV感染所致的慢性肝炎及其并发症严重危害了人类健康。目前临床上对慢性肝炎的治疗主要是采用α干扰素和核苷类药物进行抗病毒治疗,但它们清除HBV cccDNA的作用有限,因此急需新的治疗策略。HBV感染慢性化与机体抗HBV特异性免疫应答的缺陷或低下有关,有效打破慢性HBV感染的免疫耐受状态,诱导出多克隆、多特异性、应答强的免疫应答是慢性肝炎治疗的关键之一。DNA疫苗能同时诱导机体体液和细胞免疫反应,因此作为治疗性疫苗在慢性肝炎的动物和临床试验研究中显示出良好的应用前景,但其诱导的免疫应答在大动物种系和人类中仍较弱,这主要是由于被注射入体内的DNA只有很少部分被抗原递呈细胞(antigen-presenting cells,APC)摄取,因此如何增强DNA疫苗的免疫原性,是目前急需解决的课题。将DNA疫苗编码的抗原靶向引导至APC表面,可促进APC对抗原的摄取、加工和递呈,广泛增强抗原特异性CD4~+Th应答、CD8~+Tc应答及抗体反应,从而放大了免疫应答效应,是增强DNA疫苗免疫原性的有效策略之一。表达于激活T细胞表面的共刺激分子受体—细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4,CTLA-4)能特异性地结合APC表面的B7-1/B7—2分子,并且它与B7的亲和力比CD28与B7的亲和力高20～50倍左右。利用CTLA-4胞外段与B7分子结合的高亲和力,能够将与其融合表达的特异性抗原靶向至APC,促进APC对抗原的摄取、加工和递呈并激活APC这一特点,本课题构建CTLA-4胞外段与乙肝病毒表面抗原(Hepatitis B virussurface antigen,HBsAg)融合的真核表达重组质粒作为抗HBV免疫的DNA疫苗,通过免疫正常BALB/c小鼠和HBV转基因小鼠,研究该融合表达质粒增强特异性抗HBV免疫功能,打破HBV免疫耐受的可能性;同时,初步研究该融合表达质粒增强机体免疫应答的作用机制,探讨它作为一种新型乙肝基因疫苗对HBV持续感染的治疗作用和应用前景,为该疫苗用于慢性乙型肝炎的防治提供实验和理论依据。本研究分以下四部分。第一部分CTLA-4胞外段与HBsAg融合表达重组质粒的构建及鉴定目的:构建CTLA-4胞外段与HBsAg融合表达重组质粒,并在体外对其进行鉴定,以用于后续DNA免疫的动物实验研究。方法:通过RT-PCR和PCR法分别获得小鼠的CTLA-4胞外段和HBsAg基因,采用分子克隆基本技术将获得的目的基因分别插入至分泌型质粒pSecTagB中,获得重组质粒pCTLA和pS,再以pCTLA为骨架,采用分子克隆法将HBsAg基因插入pCTLA中的CTLA-4基因的3'端,从而得到融合表达质粒pCTLA-S。全自动序列分析仪验证序列正确后,用脂质体转染法,将上述重组质粒转染至真核细胞Cos-7,分别用RT-PCR和放免法检测目的基因mRNA和HBsAg的表达。结果:测序分析结果显示,重组质粒pCTLA、pS和pCTLA-S中插入了正确的基因序列。RT-PCR法检测pCTLA、pS和pCTLA-S转染的Cos-7细胞中均有特异性目的基因mRNA的表达,放免法检测表明pS和pCTLA-S转染Cos-7的胞内和胞外均有HBsAg的表达。结论:成功构建了CTLA-4胞外段与HBsAg融合表达重组质粒pCTLA-S及对照重组质粒pCTLA和pS,并能在真核细胞内有效表达。第二部分CTLA-4胞外段与HBsAg融合表达重组质粒免疫增强小鼠抗HBsAg免疫应答的研究目的:研究CTLA-4胞外段与HBsAg融合表达重组质粒免疫增强小鼠抗HBsAg免疫应答的特点,探讨该融合重组质粒免疫用于抗HBV感染的治疗的可行性。方法:将重组质粒pCTLA-S及对照重组质粒pCTLA、pS和pSecTagB经超纯质粒大量抽提后,常规肌肉免疫BALB/c小鼠后,采用ELISA法动态检测小鼠血清抗-HBs;在加强免疫4周后处死一半小鼠(4只),无菌取单个脾细胞,用MTT法检测HBsAg特异性淋巴细胞增殖活性,LDH法检测HBsAg特异性的CTL反应,流式细胞术检测脾细胞中HBsAg特异性CD8~+T细胞;ELISA法检测HBsAg特异性IgG亚类和培养脾细胞HBsAg特异性的IFN-γ和IL-4的分泌水平。结果:动态检测小鼠血清抗-HBs结果表明,pCTLA-S免疫后,抗体在初次免疫2周后开始上升,至免疫后8周达到高峰,此后缓慢下降,至免疫后16周仍有较高水平的抗体;pCTLA-S免疫组与未融合质粒pS免疫组相比,其抗体出现的时间明显提前,滴度亦显着升高,pCTLA-S免疫组最高可达7123mIU/ml,而pS最高仅为261mIU/ml,升高达数百倍(pCTLA-S vs pS,P＜0.0001)。pCTLA-S免疫明显增强了HBsAg特异性T细胞增殖(pCTLA-S vs pS,P＜0.01)和细胞毒T淋巴细胞杀伤功能(pCTLA-S vs pS的CTL活性分别为:E/T=80,38.1±5.4%vs 25.4±3.7%,P＜0.05);融合表达质粒pCTLA-S免疫较非融合的pS免疫能够诱导出更多的HBsAg特异性的CD8~+T细胞分泌IFN-γ,促进Tc1细胞增殖(pCTLA-S Vs pS:7.27±1.29%vs 2.76±0.6%,P＜0.01);对免疫球蛋白IgG亚类进行分析和脾细胞培养上清细胞因子IFN-γ和IL-4水平检测表明,pCTLA-S与非融合质粒pS免疫组相比,能同时增强HBsAg特异性IgG1和IgG2a的产生,增强抗原特异性的IFN-γ和IL-4的分泌(pCTLA-S vs pS,IFN-γ:369.7±117.8pg/ml vs 101.7±31.9pg/ml,IL-4:94.2±15.6pg/ml vs 42.0±10.2pg/ml,均P＜0.01)。结论:pCTLA-S不仅显着增强小鼠抗HBsAg的特异性抗体免疫应答,而且显着增强HBsAg特异性T细胞增殖和细胞毒T淋巴细胞杀伤功能,有效诱导HBsAg特异性的CD8+T细胞分泌IFN-γ,促进Tc1细胞增殖,显着增强了HBsAg特异性的Th免疫应答,预示着该融合质粒免疫可能在抗HBV感染治疗中具有潜在的应用前景。第叁部分CTLA-4胞外段与HBsAg融合表达重组质粒免疫在HBV转基因小鼠中的抗病毒效应及其诱导的抗HBsAg免疫应答的研究目的:观察融合重组表达质粒pCTLA-S免疫对HBV转基因小鼠(Tg小鼠)中HBV的免疫清除作用,并对其在HBV转基因鼠中的免疫应答进行研究,探讨pCTLA-S免疫对HBV持续感染的治疗作用和应用前景。方法:重组质粒pCTLA-S及对照重组质粒pS和pSecTagB经超纯质粒大量抽提后,常规肌肉免疫Tg小鼠后,分别采用放免法(RIA)和ELISA法动态检测血清HBsAg和抗-HBs水平,荧光定量PCR法检测血清HBV DNA滴度;在加强免疫4周后处死一半小鼠,无菌取单个脾细胞,用MTT法检测HBsAg特异性淋巴细胞增殖活性,LDH法检测HBsAg特异性的CTL反应,流式细胞术检测脾细胞中HBsAg特异性CD8~+T细胞,ELISA法检测培养脾细胞HBsAg特异性的IFN-γ和IL-4的分泌水平;常规化学比色法检测血清ALT水平;病理切片常规HE染色及免疫组化分析肝脏组织学及HBsAg表达。结果:融合质粒pCTLA-S免疫组有效下调血清HBV DNA和HBsAg水平,且与pS组相比,其下调作用更迅速、更明显,尤其在免疫后8、12、16周,其下调作用自初次免疫后2周开始,以后逐渐增强,于免疫后8周下调效果十分明显(其中实验组中有1只测不到HBV DNA,即＜1×10~3 copies/ml),以后维持在较低水平,直到实验结束,在实验的16周内没有任何反弹(16周时,HBVDNA滴度的对数pCTLA-S vs pS:3.58±0.09 vs 4.46±0.18,P＜0.05;HBsAg抑制率pCTLA-S vs pS为:33.2±4.6%vs 17.04±2.76%,p＜0.01)。研究该融合质粒免疫后Tg小鼠中的免疫应答特点表明,融合表达重组质粒pCTLA-S免疫能有效诱导Tg小鼠产生抗-HBs应答,与pS相比,其出现的时间提早,滴度也明显升高,于8周达到高峰(6～16周,pCTLA-S vs pS均p＜0.001);pCTLA-S免疫能有效诱导Tg小鼠产生抗原特异性的CTL应答,当效靶细胞比在80:1时,其CTL应答与pS免疫组相比具有显着差异(26.1±4.6%vs 16.1±3.8%,p＜0.05);与非融合质粒pS免疫相比,pCTLA-S免疫能显着增强淋巴细胞抗原增殖活性(SI:3.6±0.49 vs 2.3±0.51,p＜0.01),同时促进脾细胞HBsAg特异性IFN-γ和IL-4的产生,其中pCTLA-S免疫组释放的IFN-γ是pS组的3倍,而IL-4为pS组的2倍多(均P＜0.05);流式细胞术分析抗原特异性的CD8~+T细胞表明,pCTLA-S免疫能够诱导出更多的HBsAg特异性的CD8~+T细胞分泌IFN-γ,大约是pS免疫组的3倍(P＜0.01);小鼠血清ALT的动态检测表明,重组质粒pCTLA-S和pS免疫后有仅个别小鼠ALT有轻度增高,但与空载体pSecTagB免疫组相比无统计学差异(P＞0.05);肝脏免疫组化结果表明,空载体pSecTagB免疫后Tg鼠肝组织HBsAg表达强阳性,pCTLA-S免疫组有3例(3/8)HBsAg表达明显减弱,而pS组HBsAg表达有1例(1/8)HBsAg表达明显减弱。结论:在HBV-Tg小鼠中,融合重组表达质粒pCTLA-S免疫比非融合的pS免疫能诱导出更强的HBsAg特异性的抗体应答;增强HBsAg特异性的淋巴细胞增殖反应、细胞毒T淋巴细胞杀伤功能,有效诱导HBsAg特异性的CD8~+T细胞分泌IFN-γ,促进Tc1细胞增殖,增强Th应答,对HBV-Tg小鼠血清HBsAg、HBV DNA水平有明显的抑制作用。第四部分CTLA-4胞外段与HBsAg融合表达重组质粒免疫增强抗HBV免疫应答机制的初步研究目的:构建一个含突变的CTLA-4胞外段与HBsAg融合的重组表达质粒pmCTLA-S,该突变是将CTLA-4胞外区的MYPPPY基序中的104位酪氨酸残基的密码子突变为丙氨酸密码子。通过免疫正常和转基因小鼠,观察pmCTLA-S的免疫应答特点和抗病毒作用,初步研究融合表达质粒pCTLA-S抗HBV免疫增强机理。方法:用PCR法扩增突变的CTLA-4胞外段,采用分子克隆基本技术将获得的突变的CTLA-4胞外段插入至切除CTLA-4胞外段的pCTLA-S质粒中,构建得到含突变的CTLA-4胞外段的融合质粒pmCTLA-S。全自动序列分析仪验证pmCTLA-S序列正确后,脂质体转染真核细胞Cos-7,放免法(RIA)检测转染细胞HBsAg的表达,用流式细胞术检测培养上清中融合表达蛋白mCTLA-S中突变的CTLA-4与B7结合力,将突变的pmCTLA-S质粒分别免疫BALB/c和HBV-Tg小鼠,采用ELISA、MTT和LDH等方法检测pmCTLA-S免疫对小鼠抗HBsAg特异性抗体应答和细胞免疫应答的影响;分别用荧光定量PCR和RIA检测pmCTLA-S免疫对小鼠血清HBV DNA滴度和HBsAg的表达水平的影响。结果:测序结果显示,重组质粒pmCTLA-S中插入的突变的CTLA-4胞外段基因序列完全正确;放免法检测表明pmCTLA-S的目的基因在Cos-7细胞有效表达。流式细胞术检测表明,pmCTLA-S表达的突变CTLA-4与B7结合力较未突变pCTLA-S明显下降,结合力约为未突变CTLA-4的1/4(平均荧光强度MIF:12.3vs 3.06)。研究pmCTLA-S诱导的免疫应答表明,pmCTLA-S免疫诱导的小鼠抗-HBs比未突变pCTLA-S显着降低(各周抗体滴度pmCTLA-S vs pCTLA-S,均p＜0.001),且与pS所诱导的抗体滴度无显着性差异(各周抗体滴度pmCTLA-S vs pS,均p＞0.05);pmCTLA-S免疫后小鼠的无论是细胞增殖活性还是CTL应答与pS免疫组相比并未见有意义的升高(均p＞0.05),与pCTLA-S免疫组相比细胞增殖活性和CTL活性均明显下降(pmCTLA-S vs pCTLA-S,SI:2.54±0.75 vs 4.05±0.47,P＜0.01;CTL活性:E/T=40,17.5±3.2%vs 27.0±2.8%,p＜0.05);进一步检测pmCTLA-S免疫对HBV Tg小鼠血清HBV DNA和HBsAg的影响,发现pmCTLA-S免疫对Tg小鼠血清HBV DNA和HBsAg表达均有一定的抑制作用,其抑制效应与pS基本一致(均P＞0.05),但与pCTLA-S免疫相比抑制效应明显下降,尤其在免疫后8周两组差异最为显着(pmCTLA-S vs pCTLA-S:HBsAg抑制率为17.05±5.75%vs 30.5±4.38%,p＜0.01)。结论:CTLA-4与B7的有效结合是融合重组质粒pCTLA-S疫苗增强抗HBV免疫和控制HBV病毒复制与表达所必需的,在体外通过基因工程等方法提高CTLA-4胞外段与B7的亲和力有助于增强CTLA-4融合表达DNA疫苗的的免疫原性,是CTLA-4融合基因疫苗改良的有效途径之一。
孙成刚[5]2005年在《HLA等位基因和MHC-多肽特异性CTL在乙型病毒性肝炎的作用机制》文中提出[目的] 探讨山东地区慢性乙型肝炎、乙肝病毒携带者、乙肝病毒感染后自然恢复者与HLA-DRB1等位基因之间的相关性,了解HBV感染后各种预后的遗传背景。 [方法] 乙肝病毒相关抗原抗体系统采用酶联免疫法进行检测;HBV-DNA定量用Roche light-cycler荧光PCR检测仪进行检测;肝功能(包括转氨酶、血浆白蛋白、球蛋白等)使用全自动生化分析仪检测;HLA-DRB1等位基因采用聚合酶链反应/序列特异性引物(PCR/SSP)技术进行检测。 [结果] ①、依据乙肝病毒相关抗原抗体指标和HBV DNA定量结果,分为HBV高复制状态和HBV低复制状态,进行二者之间的HLA-DRB1等位基因频率的比较,发现等位基因HLA-DRB1*0701在HBV高复制状态组中出现频率比低复制状态组明显升高(45% vs 12.5%,P<0.05),其余等位基因未发现具有显着性差异(P值>0.05)。②、在慢性乙型肝炎组中,四个等位基因HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*1001、HLA-DRB1*1201和HLA-DRB1*1501出现的频率明显高于正常对照(分别是23.3% vs 4%、16.7% vs 2%、60% vs 4%、56.7% vs 12%,P值分别<0.05、<0.05、<0.01、<0.01),把此组再细分为乙肝肝硬化组和原发性肝癌组,发现在乙肝肝硬化组中,等位基因HLA-DRB1*1001、HLA-DRB1*1201出现的频率远比正常对照高(30% vs 2%、50% vs 4%,P值分别为0.01、0.04),在原发性肝癌组中,等位基因HLA-DRB1*1501明显高于正常对照(60% vs 12%,P值为0.002)。③、在乙肝病毒携带组中,等位基因HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*1201、HLA-DRB*1501出现的频率明显高于正常对
龙长江[6]2007年在《乙型肝炎免疫模型与仿真》文中研究说明乙型肝炎病毒(HBV)感染诱发的乙型肝炎是一种世界性的疾病,世界1/3的人口曾经感染乙肝病毒,约有3.5亿人为HBV携带者,其中25%的人会发展成肝硬化甚至肝癌。中国是世界上乙肝患者最多的国家,为预防和治疗HBV感染,国家采取了众多措施,每年投入的经费高达数百亿人民币,如何预防和治疗乙肝一直是社会关注的焦点和重要的医学课题。动物试验和分子生物学手段适于研究单一过程或单独的细胞,对于研究病毒的致病机理具有极其重要的作用,但对于分析有许多因素相互作用而无法分割的复杂系统如免疫系统则存在很大局限性。而数学方法可以突破实验手段的局限,综合已有的知识,根据可能的机理,依据不同的假设建立数学模型,通过检验仿真结果与实验和临床数据的符合程度来选择最适合的模型和参数用于解释医学现象、指导下一步医学实验或辅助治疗方案的确定。目前感染医学中应用最为广泛的是Nowak建立的描述HIV在感染人体后艾滋病慢性发作过程的数学模型,该模型还用于评估药物抑制病毒感染的疗效。但由于HBV感染有急性、慢性等多种后果,Nowak模型还无法仿真,不能应用于HBV感染过程。本文依据从简单到复杂的原则,先抓住最本质的因素构建最简单的模型,在简单模型能够表达HBV感染的多种后果,定性分析结果符合临床结论的基础上,逐步考虑更多的因素,构建复杂的模型反映更多的信息,并且保证复杂模型的分析结论可以概括简单模型的分析结论。复杂模型仿真时尽量利用简单模型仿真中使用的参数以减少搜寻参数的工作量。在缺乏临床数据检验仿真结果准确性的条件限制下,以被验证的简单模型的仿真结果为标准来判断复杂模型仿真结果的正确性,努力使各个模型的仿真结果一致。本文首先基于Nowak模型,建立了HBV感染的细胞免疫模型,使用Nowak估计参数对初始模型进行仿真的结果表明模型可以反映人体被HBV感染的各种可能后果。鉴于模型的定性分析结果复杂,无法提供有价值的信息,对模型进行了改进,使模型的定性分析结果简洁明了,并与医学结论相符。根据近年来发现的细胞免疫的非杀伤效应机理,对模型进行了相应修正,定性分析结果可以包括前面的分析结论。因为使用临床数据对模型进行仿真时发现肝细胞总是全部死亡,分析原因后重新设置了肝细胞增殖函数,同时将肝细胞受损程度与临床检验指标丙氨酸转氨酶(ALT)联系起来建立方程,形成了新的模型。应用该模型解释了慢性乙肝患者再感染甲肝后肝炎彻底消除,但同时易于发生暴发性肝炎的临床现象。模型定性分析的结果与前面的结果一致,模型可以仿真出人体被HBV感染后可能出现的各种后果,且仿真结果的潜伏期、转氨酶水平以及HBV DNA浓度均在临床范围内。在前面模型的基础上构建了包含细胞免疫和体液免疫功能的HBV感染免疫模型。模型的定性分析结果可以涵盖前面的结论,并且可以体现体液免疫在抗感染中的作用。应用前面模型的仿真参数并添加新参数后的仿真结果可以表达人体被HBV感染的各种可能后果,并且仿真图形与世界卫生组织发布的HBV感染趋势图一致。鉴于抗原提呈细胞在HBV感染免疫中的重要作用,在前面模型的基础上构建了包括抗原提呈细胞(APC)、辅助T细胞(Th1,Th2)、细胞毒性T细胞(CTL)和抗体分泌细胞(B细胞)以及抗体(Ab)等变量的HBV感染免疫模型。模型的定性分析结果与前面完全一致。仿真结果表明模型可以表现人体被HBV感染的各种可能后果。选择一种位于最严重后果和彻底痊愈之间的中间状态——急性转慢性感染过程的模型,且其方程的主要动力学参数变动10倍或为原来1/10时可遍历各种感染后果,通过研究表现不同后果的参数情况来分析各种因素对感染后果的影响。通过假设药物能将对免疫反应有利的参数扩大为原来2倍,对病毒有利的参数缩小为原来1/2,确定各种感染状态下最有效的治疗措施。仿真结果发现状态不同,治疗目标不同,最有效的措施也不相同。但一般而言降低病毒感染率和抑制病毒复制都是最有效的措施。
陈瑜[7]2004年在《乙肝病毒感染的特异性CTL细胞免疫应答研究进展》文中进行了进一步梳理目前,已较一致地认为,乙型肝炎的发病机理主要是机体清除乙肝病毒(HBV)而引发的细胞免疫病理改变,涉及病毒和机体两方面因素,而由机体产生的针对HBV 抗原的特异性细胞毒T 淋巴细胞(HBV specific CTL)在清除病毒中发挥主要作用,其水平和功能状况与乙肝的转归及抗病毒疗效密切相关。因此,对HBV 特异性CTL 细胞进行研究,对于弄清乙型肝炎发病机理,为有效防治提供科学依据具有重要意义,也是当前抗HBV 感染免疫研究领域的热点问题。本文就有关HBV感染的特异性CTL 细胞免疫应答研究最新进展以及作者在近期的相关研究工作进行总结和报告。
陈德良[8]2014年在《慢性乙型肝炎湿热中阻证和肝郁脾虚证患者HBV特异性CTL应答研究》文中进行了进一步梳理背景和目的：慢性乙型肝炎(CHB)是严重危害人类健康的疾病之一。据世界卫生组织统计全世界有3.5亿人携带乙肝病毒,每年约100万人因HBV感染而死亡。干扰素-α、核苷(酸)类似物虽能降低部分患者病毒含量,但干扰素-α有效率仅为25%-40%,且其不良反应严格限制了其使用范围,而核苷(酸)类似物有需长期服药、停药后易复发、易产生耐药性的缺点,更为重要的是,它们难以完全清除乙肝病毒,因此有必要积极探索治疗慢性乙型肝炎的新方法。现已普遍认为乙肝病毒本身对肝脏没有损伤作用,HBV感染后主要通过机体对病毒的免疫应答而导致肝细胞的损害。其中CD8+T细胞所介导的乙肝病毒特异性CTL应答反应起关键作用,是启动肝细胞损伤和清除乙肝病毒的始动者。故探索以增强HBV特异性CTL应答的方法十分必要,进行此类研究首要的任务是确定能诱导强的HBV特异性CTL应答的抗原或具有广泛免疫原性的特异性表位。中医药在慢性乙型肝炎治疗上有独特的优势,辨证论治是祖国传统医学的精髓,因此有必要探讨HBV特异性CTL应答与中医证型之间关系,为慢性乙型肝炎中西医结合治疗提供理论依据。大量研究证实,机体免疫与慢性乙型肝炎中医证型之间存在密切关系,免疫指标检测为中医证型断定提供了客观依据,但基于慢性乙型肝炎具体中医证型与不同诱导剂特异性CTL应答之间关系尚未见系统报道。为此本研究通过HBcAg、HBsAg及混合肽段(HBcAg18—27、HBcAg60—68、HBsAg183-191)对慢性乙型肝炎患者特异性CTL应答的影响与其不同中医证型之间的相关性观察,为选择更加高效的诱导剂诱导HBV特异性CTL应答治疗慢性乙型肝炎,以及指导中医辨证分型提供客观依据。方法：收集据中医辨证分型为湿热中阻型和肝郁脾虚型的慢性乙型肝炎患者各30例,分别用重组HBcAg、HBsAg、混合肽段诱导CHB患者PBMC体外增殖。用酶联免疫斑点(ELISPOT)法检测抗原或肽段诱导后CD8+T细胞分泌IFN-y数量反映CTL应答水平。结果：HBcAg分别与HBsAg及混合肽段诱导慢乙肝患者PBMC产生IFN-y量相比较均有显着性差异(P<0.05),HBsAg与混合肽段之间比较无显着性差异(P>0.05)。无论在HBcAg、HBsAg还是混合肽段刺激下,湿热中阻组同肝郁脾虚组患者PBMC产生IFN-γ量之间比较均有显著性差异(P<0.05)。结论：①HBcAg诱导慢性乙型肝炎患者CTL应答较HBsAg及混合肽段强。②无论在HBcAg、HBsAg还是混合肽段诱导下,湿热中阻组均较肝郁脾虚组CTL应答强。
汪颖[9]2013年在《含有TLR7/8受体激活物的乙肝病毒治疗性疫苗的作用及机制研究》文中研究指明慢性持续性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是我国肝癌发生的主要病因,清除HBV感染性肝细胞有可能阻断肝癌的发生进程。抗病毒疗法是现阶段临床治疗HBV感染的主要手段,并已在部分患者中证明能有效控制病毒复制,但却不能完全清除病毒。含有HBV抗原的治疗性疫苗可打破慢性感染者体内对病原体的免疫耐受,增强或重建机体针对HBV抗原的免疫应答反应,有望成为治愈慢性HBV感染的有效手段。Toll样受体(TLRs)配体能通过与相应TLRs结合而激活免疫细胞,调节适应性免疫反应的强度或改变反应的类型,现已用于抵御人类疾病疫苗的佐剂研发中。我们已有的工作表明：HBV表面抗原(HBsAg)与TLR7/8受体激动剂CL097的偶联可促进外周血单核细胞(Mo)在组织中成熟分化为树突状细胞(DC),相对于铝盐佐剂,在小鼠体内可诱导出更强的抗HBsAg应答。乙肝核心抗原(HBcAg)是乙肝治疗性疫苗研发过程中的一个重要抗原,其特异性T细胞的存在和慢性HBV感染的清除有关。TLR7/8激动剂与目的抗原的偶联能更好的进行抗原交叉提呈,诱导抗原特异性的Th1型免疫应答及CD8+T细胞的产生。本研究中,采用氢氧化铝盐吸附制备了含有5μgTLR7/8激动剂CL097和5μ.gHBsAg及5μg HBcAg的含有TLR7/8受体激动剂CL097的HBV抗原疫苗(HBV-Ag+Alum+CL097),采用UPLC-Q-TOF-MS高分辨串联质谱分析证实：TLR7/8激动剂CL097通过表面电荷效应能有效被铝盐吸附,与共同吸附的HBsAg及HBcAg抗原抗原形成物理性连接的颗粒性抗原。将抗原进行FITC荧光标记后,通过铝盐吸附,注射到C57BL/6J小鼠皮内,48小时后收集局部引流淋巴结发现：加入CL097后,引流淋巴结中含有更多的标记抗原,表明在疫苗中加入CL097可以促进更多携带外周抗原信息的DC回巢到淋巴结中。进而,我们分离分析了摄取标记抗原的细胞群体,结果显示：摄取疫苗性抗原的细胞主要是CDllb阳性细胞(≥90%),而非CD11c阳性细胞(<10%)；CL097加入后,摄取抗原的CD11c阳性细胞比例有所增加,但主要仍是CDllb阳性细胞。在CDllb阳性细胞群体中,其中一大部分细胞高表达Ly6c,一部分低表达或不表达Ly6c分子。免疫分选上述两群细胞后转输到小鼠皮内,结果发现这两群细胞在体内均可分化成为能够回巢到局部引流淋巴结的CDllc+细胞。随后,我们分离小鼠脾脏Ly6c+细胞,用该疫苗进行刺激,发现与单纯采用铝佐剂的疫苗抗原相比,其能显着促进Mo向DC分化成熟,上调CCR7表达,促进细胞产生和分泌IL-6和TNF-α。上述刺激分化后的Mo在与初始T (naive T)细胞共培养后,能促进这种T细胞表达更高水平的BCL-6和T-beta转录因子,表现为滤泡辅助性T细胞的表型特征,细胞表面高表达CXCR5,分泌产生IL-21、IFN-γ及TNF-α。为此,我们采用2株不同来源的HBV转基因小鼠模拟人体的慢性HBV感染状态,进行疫苗的皮下免疫注射,观察含有CL097的HBV疫苗的治疗作用,每2周免疫1次,共4次。结果发现：含有CL097通过铝盐吸附的HBV抗原在4次免疫后,54.5%(6/11)的小鼠中可检测到HBsAg特异性抗体(抗HBs),抗体含量为85.88mIU/ml;抗体在第4次免疫20周后仍可检测到,并且在加强免疫一周后迅速升高。ELISPOT检测结果显示免疫小鼠体内产生了HBsAg特异性B细胞。流式分析发现小鼠脾脏淋巴细胞中有CD4+IFN-γ+T、CD8+IFN-γ+T及IL-21+T细胞生成。以上结果提示：该疫苗免疫在HBV转基因小鼠体内可有效诱导针对HBsAg的体液及细胞免疫应答。随后,我们分选到经上述疫苗免疫后的HBV转基因小鼠体内的CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)和Treg清除后脾细胞,转输到未处理的正常C57BL/6J小鼠体内,采用5μg HBsAg免疫3天后即可检测到特异性的抗HBs产生,表明该疫苗在HBV转基因小鼠中有效诱导出抗原特异性的记忆性B淋巴细胞；在转输CD4+CD25+的Treg细胞后,采用5μg HBsAg免疫12天后可检测有特异性抗体产生。而在未免疫的正常C57BL/6J小鼠体内转输未免疫的HBV转基因小鼠的CD4+CD25-细胞和CD4+CD25+调节性T细胞后,采用5μgHBsAg免疫后均未检测到有抗HBs产生。由此表明,含有TLR7/8激动剂的HBV抗原疫苗能打破机体特异性免疫耐受状态,促进抗原特异性免疫应答的产生。同时,我们也考察了该疫苗联合使用外源性Ⅰ型干扰素IFN-α-2b在HBV转基因小鼠中的治疗效果,结果发现两者联合使用后抗HBs的产生提前,这为慢性HBV感染的治疗提供了一种新疗法。此外,我们利用高成瘤性黑色素瘤细胞系B16建立了表达HBV相关抗原的种植性肝脏肿瘤小鼠模型,采用上述疫苗免疫3次后,肝脏原位接种上述肿瘤细胞。结果发现该疫苗免疫后能在正常C57BL/6J小鼠中有效诱导出较强的体液及T细胞免疫应答。接种肿瘤细胞后,荷瘤小鼠中位生存时间相对于常规预防性乙肝疫苗免疫组延长了5天,同时1/7小鼠实现了治愈,并可在体内检测到大量抗原特异性的IFN-γ分泌型T细胞。通过上述研究,我们获得如下结果：1、TLR7/8激动剂CL097通过表面电荷效应能有效被铝盐吸附,与共同吸附的HBsAg及HBcAg抗原形成物理性连接的颗粒性抗原；该疫苗抗原在皮下注射后,主要被CD11b阳性的单核吞噬细胞所摄取,并能促进其分化成熟,携带相应的抗原信息回巢到局部引流淋巴结。2、经含有TLR7/8受体激动剂CL097的HBV抗原疫苗作用后的单核细胞源性的树突状细胞能促进初始T细胞分化为表达CXCR5, IL-21产生型的滤泡性辅助T细胞。3、含有TLR7/8受体激动剂CL097的HBV抗原疫苗能在HBV转基因小鼠(模拟人类慢性乙型肝炎感染状态)中能打破机体特异性免疫耐受状态,促进抗原特异性免疫应答的产生。联合使用外源性Ⅰ型干扰素IFN-α-2b使用后抗HBs的产生提前,为慢性HBV感染的治疗提供了一种新疗法。4、含有TLR7/8受体激动剂CL097的HBV抗原疫苗在正常C57BL/6J小鼠中有效诱导出较强的体液及T细胞免疫应答,并能减缓表达HBV抗原的肿瘤细胞在肝脏上的生长。
陈华标[10]2005年在《SARS冠状病毒特异性细胞毒T淋巴细胞免疫应答的研究》文中进行了进一步梳理本课题首先以热灭活SARS病毒为抗原,研究其体内体外诱导CTL应答的能力。以热灭活SARS病毒致敏的树突状细胞免疫HLA-A2.1/K~b转基因小鼠和刺激HLA-A~*0201~+健康人外周血单个核细胞均能诱导出病毒抗原肽特异性的CTL。课题还研究了SARS康复者和健康人群针对SARS病毒的记忆性T细胞免疫应答,结果表明,SARS病毒感染可在自限性病人体内产生有效的保护性CTL应答并产生免疫记忆:而记忆T细胞经热灭活SARS病毒活化产生的CTL呈现终末分化的效应CTL细胞表型CD45RA~+CCR7~-CD62L~-,并表达CCR5和CD44分子。同时发现在未接触过SARS病毒的部分健康人T细胞库中存在SARS病毒交叉反应性CD8~+记忆T细胞,活化产生的CTL功能低下。上述研究结果有助于阐明SARS病毒致病的免疫病理机制,为SARS疫苗的研制和防治措施的制定提供了重要的实验数据和理论依据。
参考文献：
[1]. 乙肝病毒感染的特异性CTL应答机制研究[D]. 陈瑜. 浙江大学. 2004
[2]. HBV感染：宿主细胞免疫应答与临床转归[D]. 田瑛. 中国协和医科大学. 2006
[3]. 小鼠LIGHT真核表达载体的构建及其与乙肝核酸疫苗的联合免疫研究[D]. 张亚丽. 华东师范大学. 2008
[4]. CTLA-4胞外段与HBsAg融合DNA疫苗增强抗HBV免疫的研究[D]. 周承. 浙江大学. 2008
[5]. HLA等位基因和MHC-多肽特异性CTL在乙型病毒性肝炎的作用机制[D]. 孙成刚. 山东大学. 2005
[6]. 乙型肝炎免疫模型与仿真[D]. 龙长江. 华中科技大学. 2007
[7]. 乙肝病毒感染的特异性CTL细胞免疫应答研究进展[C]. 陈瑜. 2004年浙江省检验医学学术会议论文汇编. 2004
[8]. 慢性乙型肝炎湿热中阻证和肝郁脾虚证患者HBV特异性CTL应答研究[D]. 陈德良. 福建中医药大学. 2014
[9]. 含有TLR7/8受体激活物的乙肝病毒治疗性疫苗的作用及机制研究[D]. 汪颖. 北京协和医学院. 2013
[10]. SARS冠状病毒特异性细胞毒T淋巴细胞免疫应答的研究[D]. 陈华标. 第二军医大学. 2005
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