刘蕊[1]2008年在《番茄和马铃薯晚疫病菌的遗传分化研究》文中研究表明致病疫霉[Phytophthora infestans(Mont.)De Bary]可引起马铃薯和番茄晚疫病的发生,而晚疫病也是马铃薯和番茄上对生产威胁最严重的病害。本研究对45个致病疫霉菌株(33个来自番茄,12个来自马铃薯)进行了寄生适合度、甲霜灵敏感性、嘧菌酯敏感性、交配型和SSR基因型的分析,以期从表现型和基因型两方面明确致病疫霉在番茄和马铃薯上的遗传分化。主要研究结果如下:(1)测定了采自中国马铃薯主产区12个马铃薯晚疫病菌株及来自番茄产区9个番茄晚疫病菌株对3个马铃薯品种和3个番茄品种的侵染率、病斑面积、产孢能力以及寄生适合度。结果表明马铃薯晚疫病菌株和番茄晚疫病菌株都是在原寄主上寄生适合度较高,马铃薯晚疫病菌株在马铃薯叶片上的寄生适合度为47832,在番茄叶片上的寄生适合度为1831;番茄晚疫病菌株在番茄叶片上的寄生适合度为53994,在马铃薯叶片上的寄生适合度为6300,说明番茄晚疫病菌和马铃薯晚疫病菌有明显的遗传分化。(2)对33个番茄晚疫病菌进行了对甲霜灵敏感性的测定,结果表明对甲霜灵产生高抗的菌株共有4个,其余29个菌株对甲霜灵均表现敏感,EC_(50)值为0.0001μg/mL—38.8997μg/mL。(3)对33个番茄晚疫病菌株进行了对嘧菌酯敏感性的测定,结果表明被测菌株对嘧菌酯均表现敏感,对嘧菌酯最敏感菌株和最不敏感菌株的EC_(50)值分别为0.0049μg/mL和0.4538μg/mL。(4)测定了采自河北保定、唐山和北京地区共22株番茄晚疫病菌的交配型,均为A1交配型,未发现A2交配型。(5)利用SSR分子标记分析了33株番茄晚疫病菌的基因型,共发现B-03和B-05两种基因型,其中B-03基因型菌株31个,占93.9%,B-05基因型菌株2个,占6.1%。
张鑫[2]2015年在《大豆疫霉G蛋白α亚基调控游动孢子趋化性的机制研究》文中认为大豆疫霉(Phytophthora sojae)侵染大豆引起的根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一。大豆疫霉的游动孢子释放后,可以特异地识别寄主分泌的异黄酮类物质,通过趋化性寻找寄主并启动侵染过程。因此趋化性是大豆疫霉完成侵染循环的关键环节。解释疫霉菌趋化性的分子机理对寻找新的杀菌剂靶标具有重要价值。本课题组前期研究发现PsGPA1编码的G蛋白α亚基参与调控游动孢子趋化性,但对其下游信号通路的了解还非常有限。因此,本研究综合利用亲和纯化、质谱鉴定及基因沉默等技术对大豆疫霉G蛋白α亚基调控游动孢子趋化性的机制进行了探索,鉴定到了一系列潜在的PsGPA1互作蛋白,并利用基因沉默的方法针对其中PsHint1的功能进行了研究。PsGPA1互作蛋白的筛选与鉴定:为了分析PsGPA1介导的信号转导通路及分子机制,本研究对PsGPA1的互作蛋白进行了筛选。本文在大豆疫霉中成功表达了融合FLAG标签的PsGPA1,并利用亲和纯化的方法来筛选大豆疫霉中与PsGPA1物理互作的蛋白。通过质谱分析,鉴定到了一系列候选蛋白,如HIT核苷酸结合蛋白PsHint1和谷氧还蛋白PsGrx1,并分别对其结构特点进行了分析。随后成功在原核中对候选蛋白及PsGPA1进行了表达,并利用GST pull-down的方法对亲和纯化的结果进行了验证。实验结果证实了PsHint1与PsGPA1的互作关系,但PsGrx1与空载体对照也存在互作,因此PsGrx1与PsGPA1的互作关系有待进一步验证。PsPGA1的互作蛋白PsHint1参与调控大豆疫霉的趋化性及致病性:在前文中鉴定到了一个PsGPA1的互作蛋白,PsHint1。其具有一个HIT结构域,且为人类HINT1的同源蛋白。为了对蛋白间的体内互作进行分析从而验证前一章的结果,本研究建立了疫霉蛋白共表达体系,成功构建了PsHint1与PsGPA1的共表达载体并进行了大豆疫霉转化,随后的co-IP实验证实了PsHint1与PsGPA1的互作。本研究同时利用体外GST pull-down的方法对二者的关系进行了验证。实验结果显示,PsHint1与GTP或GDP结合状态下的PsGPA1均可以发生互作。本文对PsHint1的转录模式、亚细胞定位及生物学功能进行了分析。结果显示,PsHint1在侵染阶段上调表达;其在大豆疫霉细胞核、细胞膜及细胞质内均检测到定位。利用基因沉默的方法对PsHint1进行功能分析发现,其参与调控游动孢子对大豆根毛及异黄酮类物质的趋化性。PsHint1沉默转化子的休止孢萌发异常,产生了高度分枝或末端膨大的芽管。在与大豆感病品种Hefeng 47互作过程中,PsHint1的沉默使得转化子对于寄主的致病力显着减弱,侵入菌丝在大豆表皮细胞内的扩增受到了显着抑制,并导致侵染点附近的大豆细胞出现了坏死反应。PsHint1沉默转化子与PsGPA1沉默转化子致病力减弱的原因并不相同。这些结果说明PsHint1不仅通过与PsGPA1互作来调控游动孢子趋化性,还参与了一条不依赖Gα的调控致病性的信号通路。致病相关蛋白PsHint1参与调控的下游信号通路分析:为了进一步分析PsHint1调控大豆疫霉致病过程的分子机制,本文对其沉默转化子致病力减弱的原因进行了进一步分析。实验结果证实转化子对氧化压力胁迫的敏感性显着上升。DAB染色试验表明PsHint1沉默转化子丧失了清除侵染点周围ROS的能力,而采用NADPH氧化酶抑制剂DPI清除大豆表皮细胞产生的ROS后,可以部分恢复PsHint1沉默转化子的侵入菌丝在大豆细胞中的扩展能力。此外,qRT-PCR结果证实,PsHint1的沉默导致部分RxLR效应分子转录模式异常。本研究对PsHint1沉默转化子侵染3小时阶段的样品进行了RNA-seq分析,所获得的数据与qRT-PCR结果相符。RNA-seq数据显示,在PsHint1沉默转化子中,大量激发子类似基因上调表达,PsHint1的沉默还影响了部分转录因子的转录。由此可以推测,PsHint1可能通过调控ROS的清除、RxLR效应分子的转录及激发子类似基因的表达来作用于大豆疫霉致病过程。本研究利用亲和纯化的方法对PsHint1的互作蛋白进行了筛选,鉴定到了HSP70、AGC蛋白激酶、核转运蛋白α及一系列蛋白翻译相关蛋白,它们与PsHint1的关系有待进一步验证。PsGPA1靶标蛋白的筛选及功能分析:大豆疫霉中编码G蛋白α亚基的基因PsGPA1在大豆疫霉趋化性及致病性进程中起着关键作用。在前期实验中,本研究对PsGPA1的互作蛋白进行了筛选,但所得到的结果尚未能解释PsGPA1行使复杂功能的分子机制。因此,本研究对原有的亲和纯化方法进行了优化,在大豆疫霉PsGPA1-FLAG转化子的蛋白裂解液中外源添加了GTP抗水解类似物GTPγS,从而人为地使Gα处于激活状态,旨在进一步寻找PsGPA1的下游靶标蛋白。通过该方法我们鉴定到了多个蛋白激酶(PsSNF1和PsYPK2)、一个蛋白磷酸酶(PsPPEF)及一个小G蛋白(PsRABB1)。GST pull-down也进一步证实了以上4个候选蛋白与PsGPA1的互作关系。对以上候选靶标的转录模式进行分析后发现,该四个基因均在大豆疫霉侵染阶段上调表达,暗示了它们可能参与调控大豆疫霉的致病过程,从而可为后期的基因功能验证提供线索。以上四个候选蛋白的生物学功能有待进一步研究。本研究利用亲和纯化的方法对PsGPA1的互作蛋白进行了鉴定,并在此基础上进行了体系优化,以期筛选PsGPA1的下游靶标蛋白。该实验体系有望为疫霉菌其它基因的互作蛋白筛选提供重要的参考。本研究在疫霉菌中对G蛋白下游信号通路进行了鉴定,并发现G蛋白α亚基的互作蛋白PsHint1同样参与调控游动孢子的趋化性,但其以与PsGPA1不同的方式作用于大豆疫霉的致病过程。本研究可为揭示疫霉菌中Gα调控趋化性的分子机制提供重要的线索,同时亦可增进对大豆疫霉早期致病机理的认识,从而为新的疫病控制策略的开发提供帮助。
盛玉婷[3]2015年在《大豆疫霉中参与氧化压力应答和致病过程的转录因子PsHSF1和PsBZPc32的功能分析》文中进行了进一步梳理疫霉菌隶属于茸鞭生物界卵菌门,与真菌的遗传距离相距甚远,大多数生化途径、侵染机制、结构特征都与真菌存在显着的差别,这导致许多传统杀真菌剂不能有效地用于疫霉病的防治。从分子水平上对疫霉菌的致病机制进行研究是寻找针对疫霉菌的新杀菌剂作用靶标和设计植物疫病控制策略的重要理论基础。转录因子是基因表达调控网络中的关键因子,参与病原菌生长发育、应答各种外界胁迫和致病等过程。随着越来越多的疫霉菌基因组测序完成,寻找疫霉菌特异的转录因子,解释其对疫霉菌生长发育和致病的作用机理,对认识这类独特的病原生物,筛选控制这类病原菌的新杀菌剂作用靶标具有重要意义。本研究以大豆疫霉为研究对象,期望通过挖掘大豆疫霉中调控致病过程和外界胁迫应答过程的关键转录因子,研究其调控机制,揭示卵菌发育与致病的分子机理,为新型卵菌杀菌剂的研发提供独特的分子靶标。主要研究内容如下:大豆疫霉热激转录因子HSF家族基因的鉴定及转录分析:热激转录因子(Heatshock transcriptional factors,HSFs)是细胞应答热激胁迫和多种化学刺激的信号传递链上的终端组分,它们通过识别热激元件(Heat shock element,HSE)特异调节靶标基因的转录水平,从而对逆境做出应答。通过生物信息学分析对大豆疫霉、橡树疫霉和致病疫霉的全基因组数据库中含有HSF DNA结合域的基因序列进行挖掘,从叁个疫霉种中鉴定到大量HSF编码基因(17～24个),发现其数目远远高于真菌中HSFs,而与绿色植物中的相近。本文首先对疫霉菌基因组中编码HSF转录因子的基因model进行了校正。通过序列、基因组结构和进化等分析,发现疫霉中HSFs在基因组上具有成簇排列的特征。不同疫霉种间的同源基因序列相似性高,而与动物、植物和真菌中的同源基因进化距离相距甚远,因此在进化树上自成一支。推测疫霉属的HSFs数量的扩增是由该分支共同的祖先基因在基因组中不断复制而来的。此外,还利用实时定量RT-PCR对大豆疫霉中所有HSF编码基因在无性生活史、侵染各个阶段以及氧化压力条件下的转录水平进行分析,发现HSFs存在多样化的转录模式。这为寻找压力应答相关的HSF转录因子提供方向,并为寻找潜在的大豆疫霉杀菌剂靶标提供了理论基础。HSFs参与调控大豆疫霉氧化压力应答和抑制植物防卫反应:活性氧在植物防卫反应中扮演着十分重要的角色,而疫霉菌适应这些植物产生的活性氧并进行应答的机制目前尚不清楚。在大豆疫霉全基因组数据库中搜索已报道的参与调控氧化应压力应答转录因子的同源序列,并进行相关基因的转录水平分析,发现一个热激转录因子PsHSF1在氧化压力条件下和休止孢萌发阶段显着上调表达。进一步研究发现大豆疫霉PsHSF尸沉默转化子对氧化压力耐受性降低,并且致病性受到严重影响。通过对侵染过程进行细胞学观察,发现PsHSF沉默转化子在侵染大豆过程中不能抑制植物防卫反应所产生的活性氧的积累和侵染位点胼胝质的形成;而外源添加还原剂GSH可促使活性氧积累量明显减少,并且侵染菌丝在植物组织中扩展增加。通过对胞外酶活性检测,发现PsHSF1沉默转化子胞外氧化酶和漆酶的活性都明显低于野生型。进一步对PsHSF1沉默转化子中胞外氧化酶和漆酶编码基因的转录水平进行检测,发现多个基因转录水平受到影响。对其中一个漆酶编码基因PsLAC4进行瞬时沉默,发现其对PsHSF1沉默所产生的表型有所贡献。上述结果表明,PsHSF1可能通过调控胞外氧化酶相关编码基因的表达而在抑制活性氧介导的植物防卫反应中起重要作用。转录因子PsBZPc32在大豆疫霉生长发育及致病过程中的功能研究:bZIP(Basicleucine zipper)家族基因是一类在真核生物中普遍存在且极具序列多样性的转录因子,它们在动物、植物、真菌的生长发育和压力应答过程中起重要功能。基于本实验室之前对大豆疫霉bZIP转录因子的系统分析,从中筛选一个在侵染早期上调表达的基因PsBZPc32进行功能分析。PsBZPc32是大豆疫霉71个bZIP转录因子中唯一含有bZIP结构域外其他功能域——PAS结构域的蛋白。PsBZPc32沉默后导致大豆疫霉休止孢萌发率显着降低和萌发后产生的微菌丝形态异常率增加。休止孢萌发产生的微菌丝极性生长受到影响,呈现多分枝的树状形态,并且其细胞壁表面多糖组分分布异常。PsBZPc32突变体对大豆感病品种合丰47的致病力显着下降,通过显微观察发现其能穿透寄主表皮,但是侵入的菌丝不能进一步扩展,并发现在植物侵染位点有大量活性氧积累。此外,还发现PsBZPc32沉默转化子对过氧化氢的耐受性降低。上述结果表明,大豆疫霉PsBZPc32是一个参与侵染相关结构发育、氧化压力应答和致病过程关键因子。PsBZP32调控氧化压力应答和致病过程的分子机制研究:bZIP转录因子在真核生物生长发育过程和应答外界压力过程的基因表达调控网络中起着十分重要的功能。对大豆疫霉中参与侵染相关结构的发育、致病过程和氧化压力应答过程的关键转录因子PsBZPc32,从其自身翻译后水平调控和对下游基因的转录调控两层面对其进行分子调控机制探索。通过磷酸化位点预测,发现PsBZPc32有多个潜在的磷酸化位点,并在大豆疫霉侵染3小时阶段的磷酸化组数据中发现其中的2个位点被磷酸化。在氧化压力下条件下,PsBZPc32在细胞质中出现多个磷酸化状态,并且其定位趋于从细胞质中转移至细胞核中。对大豆疫霉侵染3小时阶段磷酸化组数据中发现两个位点进行突变后进行亚细胞定位观察,发现这两个位点与PsBZPc32定位于细胞核密切相关。在PsBZ/V32沉默转化子中,发现多个效应分子在侵染阶段的转录水平与野生型中相比显着降低。为了对PsBZPc32调控的下游基因有更全面的了解,将PsBZPc32沉默转化子、过表达转化子以及野生型菌株侵染3小时阶段的样品进行数字基因表达谱分析,发现有215个基因在沉默转化子和过表达突变中呈现出相反的转录变化模式,其中多组基因与只sBZ/V32沉默转化子表型密切相关。上述研究结果表明,PsBZPc32通过磷酸化状态和亚细胞定位改变等自身翻译后水平的调控实现对氧化压力应答;通过调控效应分子、细胞骨架蛋白和氧化还原蛋白、信号传递途径蛋白等相关编码基因的转录实现其在致病过程、氧化压力应答过程和休止孢萌发过程中的功能。
陈小霞[4]2008年在《丁吡吗啉对致病疫霉的生物活性及其室内抗性风险初探》文中进行了进一步梳理丁吡吗啉(pyrimorph)是我国具有自主知识产权的一种新型杀菌剂,化学名为(E)-3-(2-氯吡啶-4-基)-3-(4-叔丁基苯基)-丙烯酰吗啉。在离体条件下,丁吡吗啉对致病疫霉Phytophthora infestans、辣椒疫霉Phytophthora capsici、古巴假霜霉Pseudoperonospora cubensis等卵菌均有很好的抑制活性,在对卵菌病害的防治中具有广泛的市场潜力。致病疫霉是马铃薯和番茄生产上最严重的病害之一。由于传统杀卵菌药剂的长期大量使用,田间已经产生了广泛的抗药性,寻找新型杀菌剂来控制晚疫病的流行已经成为化学防治工作者的目标。所以研究丁吡吗啉对致病疫霉的生物活性及其抗药性有重要的现实意义。盆栽试验表明,丁吡吗啉在防治番茄晚疫病时具有良好的保护效果,但治疗效果较差。用浓度为400和800mg/L的丁吡吗啉对番茄植株喷雾,自然风干后接种致病疫霉的孢子悬浮液,其保护效果分别为94.1%和100%。番茄植株前期接菌处理,24h后用浓度为400、800和1000mg/L的丁吡吗啉对番茄植株喷雾,其治疗效果分别是39.3%、64.9%和84.7%。表明丁吡吗啉在防治番茄晚疫病时的保护效果优于其治疗效果。用浓度为400mg/L的丁吡吗啉喷雾番茄植株,施药后1、3和8d分别接种致病疫霉的孢子悬浮液,其防治效果分别为94.1%、90.8%和78.1%;用浓度为800mg/L的丁吡吗啉喷雾,施药后1、3和8d接菌,其防治效果分别为100%、98.4%和100%。初步说明丁吡吗啉在防治番茄晚疫病时持效期长于8天。丁吡吗啉在2000mg/L的高浓度下处理番茄植株根部,施药48h后接种致病疫霉孢子悬浮液,其对番茄晚疫病的防治效果仅为36.1%。初步说明番茄根系对丁吡吗啉有一定的内吸性,但内吸输导性较差。番茄叶片内横向输导性的研究发现,用2000mg/L的高浓度丁吡吗啉涂抹番茄叶片,其对叶片处理部位(即中部)的防治效果高达95.3%,但对处理部位上部的防治效果仅为65.3%,对处理部位下部的防治效果仅为31.8%。其它低浓度的丁吡吗啉处理结果与此相似。初步说明丁吡吗啉在叶片内有一定的横向输导性,丁吡吗啉在番茄叶片上具有向叶片顶端的输导性,对叶片基部的输导能力较差。从扫描电镜图看出,丁吡吗啉对致病疫霉菌菌丝形态有一定的影响,细胞壁局部形成皱缩、畸形。由此推测,其原因可能是菌丝内含物的减少,或是对菌丝细胞壁合成、组装的影响。经过含药培养基驯化10代,获得了2株致病疫霉的抗丁吡吗啉的突变体菌株F5和F8,对突变菌株敏感性进行测定,抗性菌株的抗性倍数分别是1.96和5.17。经过紫外线辐射新生菌丝的方法,获得了5株致病疫霉的抗丁吡吗啉的突变体菌株,对突变菌株敏感性进行测定,最高抗性菌株UV15的抗性倍数是7.66,最低抗性菌株UV11的抗性倍数为1.53。对突变体菌株的生物学性质进行分析发现,突变体菌株的抗性上升速度较慢,抗性突变体菌株在培养基平板上的菌丝生长速率和产孢能力较亲本菌株有明显的下降。发现抗性菌株抗性倍数越高,其菌丝生长速率越慢,产生的孢子囊的量也越少。在4、17和35℃下分别保存30d后,致病疫霉的抗丁吡吗啉突变体菌株和其亲本菌株的菌丝生长速率都没有受到影响,说明抗药突变体菌株也能抵抗低温或高温等逆境,正常完成越冬或越夏过程。在继代培养10代后,抗性突变体菌株对丁吡吗啉的菌丝生长速率EC50值没有显着变化,说明抗性是由遗传基因的突变引起的,而非对药剂的一种暂时性的适应。综上所述,在室内通过药剂驯化和紫外线辐射新生菌丝的方法,均能获得致病疫霉病菌对丁吡吗啉的抗药性突变体菌株,证明了丁吡吗啉存在一定的抗性风险。但是抗性突变体菌株的总体适合度较敏感亲本菌株有所下降,不利于抗药群体的发展,致病疫霉对丁吡吗啉的抗性风险可能较低。但是由于致病疫霉病菌属于高抗性风险性病菌,因此在尚未获得足够的田间试验数据前,为了延缓抗性的发生,应与其他无交互抗性的农药交替使用,尽量减少药剂的施用频率,并加强开发更多的混剂配方。同时加强监测田间及保护地多次施用该药剂后真菌群体中抗性菌株频率的变化,以便更全面、准确的评估目标真菌对药剂的抗性风险性。
宋天巧[5]2015年在《大豆疫霉叁个效应子调控植物免疫反应的功能与机制研究》文中研究说明大豆疫霉引起的大豆根腐病是世界范围内大豆生产上的一种毁灭性病害。大豆疫霉隶属于卵菌,该类病原菌虽然在形态上与真菌相似,但在进化上却和硅藻及蓝藻关系较近,为茸鞭生物界,因此一般真菌杀菌剂往往对大豆疫霉和其它卵菌无效;同时在自然界中由效应子介导的病原菌快速进化使得抗病品种很快就会被新病原菌克服,因此防治该病害是大豆生产中的一个重要难题。植物与病原菌互作过程中,植物通过先天免疫系统能够抵抗大部分病原菌的侵染,同时病原菌为了成功侵染植物,会分泌许多效应子来调控植物的免疫。效应子可以抑制植物的免疫促进病原菌的侵染,发挥毒性功能,同时有些效应子也可能被植物的抗病蛋白识别诱发植物的免疫,这些效应子表现出无毒功能。通过效应子研究病原菌的致病及与植物的互作机制在理论上有助于理解病原菌的致病成灾规律,在实践上有助于抗病品种的开发和布局。因此本文对大豆疫霉中的叁个胞内效应子PsCRN108、PsIsc1、Avr1k在病原菌侵染过程中的功能进行了分析,并探究了其可能的分子机制,获得的主要结果与结论如下:效应子PsCRN108通过结合寄主DNA来抑制植物HSP基因的诱导表达和植物的免疫反应。本文通过对效应子序列预测鉴定到叁个具有Helix-hairpin-Helix结构域的CRN效应子,其中只有PsCRN108基因在侵染阶段上调表达且为真基因,表明其可能与毒性相关。PsCRN108的信号肽能够将转化酵素分泌到酵母细胞外,表明其为分泌蛋白。它的全长蛋白能够将Avr1b效应子的C端功能域转运到寄主细胞,说明它是一个在植物细胞中起作用的效应子。定位实验显示,在侵染过程中它定位在吸器,在植物细胞中它定位在细胞核。上述实验证明PsCRN108效应子在侵染时通过病原菌吸器分泌并转运到寄主细胞核中起作用。该效应子编码基因沉默后,病原菌致病力下降,并且不能抑制大豆胼胝质的沉积。在拟南齐和烟草中表达PsCRN108能显着降低植物对辣椒疫霉P.capsici的抗性,表明它是一个能抑制植物免疫反应的毒性效应子。对转基因拟南芥进行DGE测序分析发现,PSCRN108转基因植株中大量HSP基因的转录水平下降,在烟草和大豆中PsCRN108也能抑制HSP基因的诱导表达。烟草中沉默Hsp90降低了植物对辣椒疫霉的抗性,表明烟草中的Hsp90对植物抵抗疫霉菌起到非常重要的作用。进一步的研究表明,PsCRN108能够结合P基因的启动子及其保守元件,结合后能抑制植物内源转录因子AtHsfA1a与HSP启动子的结合及其介导的基因转录。突变体分析显示,PsCRN108的HhH结构域和核定位信号对于其毒性功能和HSP基因的转录抑制具有重要作用,而HhH结构域对于DNA结合为必需。综合上述结果,我们认为大豆疫霉效应子PsCRN108能结合寄主的HSP基因启动子,抑制植物内源转录因子与启动子的结合和HSP基因的转录,从而干扰HSP蛋白介导的植物免疫反应,该发现为卵菌中首次鉴定到的能靶向寄主DNA的效应子。一个非典型分泌大豆疫霉效应子PsIsc1水解植物水杨酸的合成前体。植物产生的水杨酸在植物抵抗病原菌中起重要作用,该化合物在植物中通过两条途径合成,其中一条经由异分支酸。本文从大豆疫霉中鉴定到1个编码异分支酸水解酶的基因PsIsc1,该基因编码的酶能水解异分支酸生成2,3-二氢-2,3-二羟基苯甲酸甲酯(DDHB)和丙酮酸盐,推测它有可能在植物细胞中降解水杨酸的合成前体异分支酸,来抑制水杨酸的合成及其介导的抗性。本文对该推测进行了系统的验证和研究。PsIsc1在侵染阶段上调表达,沉默该基因后病原菌致病能力下降,表明它在大豆疫霉的致病过程中起重要作用。同时发现该基因沉默后,侵染大豆组织中水杨酸含量增加并且PR1基因转录上调,表明PsIsc1可能影响植物水杨酸含量。定位实验表明,PsIsc1效应子在侵染时通过病原菌吸器分泌,能转运到寄主细胞中起作用。在植物中表达PsIsc1后,植物水杨酸含量降低、PR1基因的转录下降、植物抗病力也随之减弱。结合体外生化实验和突变体实验,发现PsIsc1具有水解异分支酸的活性,并且该活性与其抑制植物防卫反应功能相关。更重要的是,我们发现该蛋白不具有信号肽,但能分泌到胞外,且具有非典型分泌特征,因此我们将其定义为非典型分泌效应子。上述结果表明,大豆疫霉的效应子PsIsc1可以在寄主细胞中分解植物水杨酸合成的前体,降低植物水杨酸的含量;该效应子通过非典型分泌系统分泌,为植物病原菌中一类新型效应子。大豆疫霉中两个无毒基因Avr1b-1和Avr1k能同时被寄主的Rs1kk基因识别。Rps1k是大豆生产上应用最为广泛的一个抗病基因,本文在大豆疫霉中发现两个效应子Avr1b-1和Avr1k都能够被大豆的抗病基因Rps1k识别。在大豆中瞬时表达Avr1b-1以及在Avr1b-1的毒性大豆疫霉菌株中稳定表达Avr1b-1,都能够使Avr1b-1被Rps1k识别而触发Rps1k介导的抗性;而Avr1b-1的无毒菌株中沉默Avr1b-1,则使该菌株不能被Rps1k识别,也不能触发Rps1k介导的抗性;这就说明Avr1b-1可以被Rps1k识别从而触发Rps1k介导的抗性。我们在一些不表达Avr1b-1却仍然对Rps1k无毒的菌株中鉴定到另一个RxLR效应子Avr1k,它与Avr1b-1在基因组中的位置仅相距5kb。在Avr1k的毒性菌株中表达Avr1k基因,能使该菌株触发Rps1k介导的抗性;而在Avr1k的无毒菌株中沉默Avr1k基因,则使该菌株丧失诱导Rps1k介导的抗性的能力。上述结果表明,大豆疫霉中的两个RxLR无毒基因都能够被寄主的Rps1k基因识别产生抗性;这两个效应子在进化上很难同时丢失,这从理论上解释了大豆Rps1k基因在生产上广泛应用的原因。效应子进入寄主细胞通过复杂的机制调控植物的免疫,而效应子调控寄主免疫的机制的探究将为研发抗病策略提供理论基础。
崔海辰[6]2018年在《致病疫霉PiGK5基因功能的研究及α1性激素诱导下致病疫霉有性生殖的磷酸化蛋白质组学分析》文中进行了进一步梳理由致病疫霉引起的马铃薯晚疫病被认为是最具破坏性的植物病害之一。致病疫霉可以侵染马铃薯的叶、茎和薯块,迅速摧毁植物,甚至可以在几小时内导致植物死亡,严重危害马铃薯产业的发展。疫霉菌的有性生殖对其物种的演化和延续起着重要作用。疫霉菌的有性生殖是由性激素调控的。A1、A2交配型菌株分别产生α1和α2性激素,当A1和A2交配型菌株共同配对培养时,它们产生的α1和α2性激素分别诱导对方分化出雌、雄配子体,从而完成有性生殖,产生卵孢子。尽管目前α1和α2性激素已经被分离鉴定,然而,关于疫霉菌有性生殖的机理仍未被揭示。本研究以致病疫霉为研究材料,建立了致病疫霉菌株的长期保存方法,绘制了不同菌株的生长曲线以确定其最佳培养时间,并通过不同方法检测了致病疫霉菌株的交配型;克隆了A1交配型菌株HQK8-3 Pi GK5 c DNA蛋白编码区,并进行了序列分析,通过荧光蛋白融合表达技术对Pi GK5蛋白进行了亚细胞定位,通过RNA干扰技术对Pi GK5在致病疫霉无性生殖、有性生殖、致病性等方面的功能进行了研究;通过i TRAQ技术研究α1性激素诱导下致病疫霉A2交配型菌株在不同时间点的差异磷酸化蛋白表达谱,并对差异蛋白表达谱进行了系统的生物信息学分析,筛选出一批潜在地可能与致病疫霉有性生殖密切相关的蛋白。结果表明,本研究中所使用的四种保存方法均能高度保持被测致病疫霉菌株的生存能力,且对菌株的生长和形态特征没有显着影响,但四种保存方法对菌株致病性的影响具有菌株特异性。致病疫霉菌株HQK8-3的最佳培养时间为12天,YF3的为13天,2PO-D的为11天,2PO82001的为9天,USA1的为18天,P7723的为7天。菌株HQK8-3、2PO-D、USA1为A1交配型菌株,菌株2PO82001、P7723为A2交配型菌株,菌株YF3为A1自育型菌株。这些工作为接下来的研究奠定了基础。致病疫霉A1交配型菌株HQK8-3的Pi GK5 c DNA蛋白编码区序列全长2763bp,编码920个氨基酸,与NCBI公布的c DNA序列相似性为99.07%,氨基酸序列相似性为93.42%,菌株HQK8-3的Pi GK5的结构预测结果与NCBI公布的Pi GK5的结构预测结果一致,说明其功能也一致。A1交配型菌株HQK8-3中,Pi GK5在游动孢子中相对表达量最高,其次在休止孢,在营养菌丝、孢子囊和萌发的孢囊中表达量均相对较少。Pi GK5定位于原生质体膜上及细胞内的一些囊泡状结构中。Pi GK5基因参与了A1交配型致病疫霉游动孢子的形成和卵孢子的形成,因此是一个对致病疫霉无性生殖和有性生殖均非常重要的基因,Pi GK5可能是α2性激素的受体。Pi GK5基因参与了A1交配型致病疫霉的致病性,可能是致病疫霉的重要致病因子。通过对α1性激素诱导致病疫霉A2交配型菌株的磷酸化蛋白质组学分析,共得到磷酸化的肽段6355个,鉴定到的蛋白质2508个。One way anova分析显示,在α1性激素组筛选到453个差异磷酸化蛋白质,与对照相比,只在α1性激素组存在的差异磷酸化蛋白有249个。经过在level2水平的GO功能注释及KEGG通路分析,筛选到8个具有显着差异的磷酸化蛋白,包括PITG_01203T0、PITG_06415T0、PITG_07286T0、PITG_07289T0、PITG_10062T0、PITG_19213T0、PITG_19890T0和PITG_22434T0。T Test分析显示,α1性激素处理A2交配型致病疫霉1h、3h、8h、24h,分别筛选到185、43、189、43个差异蛋白质。经过level2水平的GO功能注释及KEGG通路分析,筛选到10个具有显着差异的磷酸化蛋白,包括PITG_00397T0、PITG_00845T0、PITG_01947T0、PITG_04443T0、PITG_04663T0、PITG_07567T0、PITG_10083T0、PITG_12100T0、PITG_16183T0和PITG_17706T0。这18个蛋白极有可能参与致病疫霉有性生殖过程,其功能需要在今后的工作中进一步验证。本研究首次对致病疫霉Pi GK5基因在无性生殖、有性生殖及致病性中的作用进行了研究,并通过磷酸化蛋白质组学方法分析了α1性激素诱导下致病疫霉A2交配型菌株的差异磷酸化蛋白质表达谱,筛选出一批与致病疫霉有性生殖密切相关的蛋白,该工作的完成对未来疫霉菌有性生殖分子机理的揭示及马铃薯晚疫病等植物疫病的有效防治具有比较重要的意义。
邵铁梅[7]2002年在《致病疫霉（Phytophthora infestans）的寄主特异性研究》文中进行了进一步梳理对77个致病疫霉Phytophthora infestans (Mont．)De Bary菌株(58个采自番茄，19个采自马铃薯)进行了交配型、甲霜灵抗性、菌落直径、产孢能力、寄生适合度及同工酶酶谱等方面的分析。研究结果表明，(1)在58个采自河北(保定、唐山、秦皇岛)、北京、四川、内蒙、黑龙江、吉林的番茄晚疫病菌株中只发现A1交配型，未发现A2交配型。(2)我国番茄晚疫病菌中有甲霜灵抗性菌株，抗性频率为8.7％。(3)番茄晚疫病菌株和马铃薯晚疫病菌株在黑麦培养基上18℃黑暗条件下培养11天，不同菌株菌落直径和产孢能力均有显着差异，但这两个指标的差异与菌株的原寄主无相关性。(4)对番茄晚疫病菌株和马铃薯晚疫病菌株在番茄叶片和马铃薯叶片上的寄生适合度进行比较，说明番茄晚疫病菌和马铃薯晚疫病菌都在原寄主上寄生适合度较高。番茄晚疫病菌在番茄叶片和马铃薯叶片上的寄生适合度分别为61237和15057；马铃薯晚疫病菌在马铃薯叶片和番茄上的寄生适合度分别为41992和1436。只有少数致病疫霉菌株可同时侵染两种寄主。(5)对致病疫霉单病斑分离物及其单游动孢子分离物进行同工酶分析的结果表明，单病斑分离物及其单游动孢子分离物的同工酶酶谱相同。(6)对致病疫霉菌株的同工酶酶谱测定表明，番茄晚疫病菌有叁种同功酶基因型：11100／111，00100／111，0011I／001，分别占被测番茄晚疫病菌菌株总数的60.5％，34.9％，4.6％；马铃薯晚疫病菌只有一种同工酶基因型：00100／001。表明番茄晚疫病菌株和马铃薯晚疫病菌株分别属于不同的基因型种群。
吕新[8]2007年在《福建省致病疫霉群体遗传结构研究》文中进行了进一步梳理由致病疫霉(Phytophthora infestans (Mont.) de Bary)侵染马铃薯引起的晚疫病是严重危害全球马铃薯生产的第一大真菌病害。致病疫霉群体结构及其演替规律的变化直接影响着该病害的发生与流行。自上世纪80年代初开始,全球各马铃薯主产国家晚疫病发生和爆发性流行的报道迅速增加,有关病原菌群体结构变化研究再次成为人们关注的焦点。本文通过对2001-2006年采自福建省不同地区108个致病疫霉菌株表型(交配型和抗药性)和基因型(同工酶基因型和线粒体DNA单倍型)结构研究,系统地揭示了福建省致病疫霉群体的遗传多样性,为福建省致病疫霉的抗病育种及晚疫病综合防治提供了理论依据。主要研究结果如下:1.对福建省不同地区108个致病疫霉菌株甲霜灵抗药性测定结果表明:高度抗性、中度抗性和敏感菌株的数量分别为103个、4个和1个,分别占被测菌株总数的95.4%、3.7%和0.9%。不同年份的致病疫霉菌株对甲霜灵的抗药性水平存在明显差异。2.对108个致病疫霉菌株交配型测定结果如下:A1型菌株、A2型菌株、交配型(NK)未知菌株分别为101个、1个、6个,分别占被测菌株的93.5%、0.9%和5.6%,未发现自育型交配型菌株。福建省致病疫霉群体存在有性生殖情况,并且不同地区交配型分布存在明显差异。3.对108个致病疫霉菌株葡萄糖-6-磷酸异构酶(Gpi)、肽酶(Pep)两种同工酶基因型分析,发现Gpi、Pep同工酶基因型为100/100/111、100/100;100/100、100/100;100/111、100/100;90/90、92/92四种类型,分别占被测菌株的81.5%、16.7%、0.9%和0.9%。研究发现Gpi、Pep同工酶基因型为100/100/111、100/100的群体取代其它叁种同工酶基因型群体。说明福建省致病疫霉群体已经出现新的同工酶基因型分化。4.对108个致病疫霉菌株线粒体DNA(mtDNA)单倍型组成分析,发现除Ia单倍型外,其余Ib、IIa、IIb叁种单倍型均被检测到,分别为1个、4个和103个,占所有被测菌株的0.9%、3.7%、95.4%。mtDNA单倍型为IIb群体取代了mtDNA单倍型为Ib、IIa两种类型的群体,说明福建省致病疫霉群体已经出现新的mtDNA单倍型分化。5.从150条RAPD随机引物中筛选出扩增多态性丰富的12条引物,对寄主来源不同的63个致病疫霉菌株进行基因组DNA遗传变异分析。用筛选出的12条引物对供试菌株进行RAPD-PCR扩增,共产生92条RAPD条带,其中85条为多态性条带,多态检测率为92.4%。利用NTSYSpc Version 2.1软件对供试菌株间的遗传距离进行聚类分析并构建系统树状图,供试63个菌株被划分为11个遗传聚类组,不同菌株间具有丰富的遗传变异,不同地区的菌株之间的亲缘关系相近,同一地区的菌株之间的亲缘关系又较远,病原菌随病果运输迁移可能是导致这种现象的原因之一。上述研究结果表明,福建省致病疫霉群体的表型和基因型结构具有非常复杂的多样性。同时也表现出明显的群体结构特点:(1)表型结构中,甲霜灵抗性水平不同年份存在明显差异,交配型以Al交配型为主,但有A2交配型存在;(2)基因型结构中,均出现新的同工酶基因型及mtDNA单倍型,不同菌株间具有丰富的遗传变异。
桂春爽[9]2010年在《北方四省致病疫霉致病型及拮抗菌复合发酵抑菌作用的研究》文中进行了进一步梳理马铃薯晚疫病是世界马铃薯产区最重要的病害之一。致病疫霉(Phytophthora infestans (Mont.) de Bary)是引起马铃薯晚疫病的病原菌,对马铃薯危害非常严重,给世界上种植马铃薯的国家带来了巨大的经济损失。目前,各国对晚疫病研究的焦点已经集中在病原菌的群体遗传结构及如何利用生物手段对其进行防治,尤其是如何提高其防治效果的稳定性方面。本文对黑龙江、辽宁、吉林和河北四省致病疫霉的致病型(生理小种)及其分布、群体遗传结构、SSR基因型进行了较为深入系统地研究,同时,对致病疫霉的两株拮抗菌——LH-03(梨黑斑病菌)和NB-8(放线菌)复合发酵的可行性、单独发酵后将发酵液复配后的防效、复配发酵液的稳定性、理化性质以及其中主要的抗菌物质等进行了研究。获得的主要研究结果如下:1. 2009年于黑龙江省、吉林省、辽宁省和河北省共采集到370个马铃薯晚疫病病样,并从中成功分离出255个致病疫霉菌株,平均分离成功率为68.9%。2.从2008-2009年采集于北方四省的150株致病疫霉中共鉴定出20个生理小种,其中1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11是优势生理小种,占总数的34.00%。3.北方四省存在所有已知可鉴别的毒性基因,其中,R11已经可以被99%以上的测试菌株所克服。4.利用Pi4B和Pi4G两对SSR引物从200株致病疫霉中共鉴定出了12个SSR基因型,其中F-01为主导基因型,占所测菌株的72.00%;而A-09、F-07、F-08、I-01、J-01、K-01和L-01等基因型均为国内外首次发现的基因型。5.尝试利用15对引物对134株菌进行了基因型鉴定,共鉴定出40种基因型,其Genotype-III基因型的菌株最多,占所测菌株的37.31%。6. SSR扩增结果的聚类分析表明134株菌的聚类与地理来源没有相关性,通过POPGENE32软件对四省之间的群体遗传多样性分析显示它们之间的遗传差异很小。7.对致病疫霉具有显着抑制作用的两株拮抗菌LH-03(梨黑斑病菌)和NB-8(放线菌)不能进行复合发酵,但将其单独发酵再以不同比例配制成的复配发酵液,在直接抑制致病疫霉生长以及在马铃薯离体组织上对晚疫病的防效均明显优于单一发酵液(均能提高10-20%左右)。8.对复配发酵液的稳定性测定结果显示:复配发酵液对光照、紫外线、温度、盐离子、蛋白酶K、中性和碱性pH值以及蛋白酶K都具有很好的稳定性,但是在极端酸性的条件下,其抑菌率下降很多。9.复配发酵液中的抑菌活性物质能溶于氯仿和乙酸乙酯,而部分溶于石油醚。复配发酵液经85%饱和硫酸铵沉淀后,沉淀部分具有抑菌活性,而经乙醇沉淀后则上清具有抑菌活性,抑菌成分中可能有一类具有极性的蛋白质、糖类等大分子物质。
赵冬梅[10]2014年在《致病疫霉NPP1-like和PcF/SCR-like基因家族系统发育及致坏死功能研究》文中进行了进一步梳理由卵菌致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的马铃薯晚疫病是当前马铃薯生产中第一大病害，严重时可造成绝收。病菌可通过分泌效应蛋白作用于寄主植物从而造成寄主被侵染部分快速坏死。致病疫霉基因组的破译和生物信息学的发展为研究该病原菌坏死基因家族的系统演化和致坏死功能分析提供了机会。本研究在致病疫霉基因组学分析的基础上，选择了NPP1-like与PcF/SCR-like坏死基因家族对其系统发育和致坏死功能进行研究，为揭示致病疫霉高度的变异能力和致病机理提供依据。本研究主要结果如下：1. PcF/SCR-like与NPP1-like家族中绝大多数基因以基因簇的形式存在。系统发育分析表明不同来源的131条NPP1序列可以分为6个分支，绝大多数的真菌与卵菌均可单独聚类，但其中也有个别基因交织在一起，其中大豆疫霉EGZ20282和EGZ20288基因聚在了真菌的分支中，而真菌基因（EPQ27597）也聚在了卵菌的分支中，这说明在卵菌与真菌中，NPP1基因家族基本上是随病菌类群在演化，但个别基因在演化的过程中有趋同进化的现象。卵菌中41个PcF-like和SCR74家族基因可以分为2大分支，其中致病疫霉SCR74家族基因，以及1个PcF/SCR-like基因归为一类，其余卵菌中不同来源的PcF-like基因归为另一类，说明SCR74家族基因虽然与PcF-like家族基因序列非常相似，但是在进化中仍属于不同的两类。2. NPP1-like与PcF/SCR-like基因家族中不同基因对植物的致坏死能力不同。通过RT-PCR获得基因cDNA全长序列，利用农杆菌介导的瞬时表达体系在本生烟（Nicotiana benthamiana）中对所选基因进行致坏死功能分析。在被选的6个NPP1-like基因中，PiNLP17、PiNLP29和PiNLP36可引起本生烟急剧皱缩和坏死，而PiNLP24、PiNLP39和PiNLP35这3个基因仅可导致叶片黄化。在PcF/SCR-like家族中，不同基因的致坏死功能与该基因所编码蛋白中的二硫键密切相关，所编码蛋白含有3-4个二硫键的基因（PcF/SCR.6、PcF/SCR.10和PcF/SCR.1）可引起本生烟坏死，但不含二硫键的基因PcF/SCR.8仅可导致接种叶片黄化。3.以PiNLP17为研究对象，分析了潜在活性位点在NPP1-like家族基因致坏死功能中的作用。利用over-lap PCR方法定点突变基因PiNLP17的潜在活性位点，同时构建活性位点突变后的重组表达质粒，并通过农杆菌注射接种本生烟研究各预期活性位点在基因致坏死功能中所起的作用。结果发现D9A、E22A和D20A等3个氨基酸位点的突变可破坏基因PiNLP17所编码蛋白的致坏死功能，接种叶片仅出现轻微的黄化现象，然而H17A位点氨基酸的突变对该基因的致坏死功能没有任何影响，注射接种7d后，本生烟叶片仍表现出皱缩坏死的症状。这表明NPP1-like家族中所编码蛋白特定的活性位点对于其致坏死功能的发挥着非常重要的作用。4.在PcF/SCR-like家族基因中，基因所编码蛋白的二硫键数量在基因的致坏死功能中具有重要作用。选取具有4个二硫键的PcF/SCR.1为研究对象，点突变该基因编码蛋白的第99、100、104和110位上的半胱氨酸，将相应的半胱氨酸（C）突变为丙氨酸（A），构建缺失二硫键突变体的重组质粒，并在本生烟中进行瞬时表达。当仅突变110位半胱氨酸，或者同时突变99位和110位两个位点的半胱氨酸时，PcF/SCR.1基因的致坏死功能并没有受到影响。但当半胱氨酸的突变个数增加到3个（C99/100/110A）或者4个（C99/100/104/110A）时，接种烟草叶片没有出现坏死症状。5. NPP1-like和PcF/SCR-like家族基因在致病疫霉侵染马铃薯过程中具有不同的表达模式，可分为3种类型。基因PiNLP17、PiNLP29、PiNLP36和PcF/SCR.1在营养阶段及侵染前期表达量上调不明显，而到了侵染后期的某一阶段（IF48及IF60）基因的表达量急剧上升，出现一个表达峰值，其中PiNLP17的上调趋势尤为突出；PiNLP35和PcF/SCR.8在营养阶段及整个侵染期基因的表达量均有上调，但并没有特定阶段表达峰值的出现；PiNLP24表达量上调幅度小，并且表达峰值出现在游动孢子阶段。家族的基因具有不同的表达模式，说明这些基因在病原菌侵染寄主的过程中发挥着不同的作用。同样，基因的致坏死能力与表达量有关。对于不具有致坏死功能的基因（PiNLP24、PiNLP35和PcF/SCR.8）而言，其表达量上调的水平明显低于有致坏死功能的基因，说明基因在植物体内的表达量与功能之间有密切联系。
参考文献：
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[2]. 大豆疫霉G蛋白α亚基调控游动孢子趋化性的机制研究[D]. 张鑫. 南京农业大学. 2015
[3]. 大豆疫霉中参与氧化压力应答和致病过程的转录因子PsHSF1和PsBZPc32的功能分析[D]. 盛玉婷. 南京农业大学. 2015
[4]. 丁吡吗啉对致病疫霉的生物活性及其室内抗性风险初探[D]. 陈小霞. 中国农业科学院. 2008
[5]. 大豆疫霉叁个效应子调控植物免疫反应的功能与机制研究[D]. 宋天巧. 南京农业大学. 2015
[6]. 致病疫霉PiGK5基因功能的研究及α1性激素诱导下致病疫霉有性生殖的磷酸化蛋白质组学分析[D]. 崔海辰. 内蒙古农业大学. 2018
[7]. 致病疫霉（Phytophthora infestans）的寄主特异性研究[D]. 邵铁梅. 河北农业大学. 2002
[8]. 福建省致病疫霉群体遗传结构研究[D]. 吕新. 河北师范大学. 2007
[9]. 北方四省致病疫霉致病型及拮抗菌复合发酵抑菌作用的研究[D]. 桂春爽. 河北大学. 2010
[10]. 致病疫霉NPP1-like和PcF/SCR-like基因家族系统发育及致坏死功能研究[D]. 赵冬梅. 河北农业大学. 2014