孟坤[1]2016年在《柿脂氧合酶及其相关基因与果实成熟软化的关系研究》文中指出脂氧合酶(LOX,EC1.13.11.12)广泛存在植物体内,启动生物膜上不饱和脂肪酸(PUFAs)发生过氧化反应,生成一些列生物活性物质,在植物生长发育、果实成熟衰老和胁迫应答等方面发挥重要功能。柿(Diospyros kaki L.)果实富含营养物质且风味独特,是我国北方重要的园艺经济产品。但是柿果实采后易软化,影响其鲜果的运输,造成严重的经济损失。本研究以不同耐贮性柿品种果实为材料,分析了9-LOX与果实成熟软化的关系及其对采后胁迫的应答,探讨了13-LOX在果实成熟软化中的作用。主要获得了以下的研究结果:1、利用RACE技术,从‘干帽盔’柿果实克隆获得2个LOX基因,DkLOX3(KF035131)和DkLOX4(KF035132)。同源基因聚类分析表明DkLOX3/4均属于9-LOX。柿果实DkLOX3/4基因在大肠杆菌中表达,通过Western blotting鉴定和蛋白纯化,获得DkLOX3/4融合蛋白。体外酶促反应试验分析表明,DkLOX3/4具有脂氧合酶活性。2、利用qRT-PCR检测不同耐贮性柿品种(耐贮性弱的‘富平尖柿’、耐贮性中等的‘火柿’和耐贮性较好的‘干帽盔’)果实成熟软化过程中DkLOX3/4基因的表达模式,并对‘富平尖柿’和‘干帽盔’进行丙烯和1-MCP处理,来探讨DkLOX3/4与乙烯的关系。qRT-PCR分析发现,DkLOX3/4基因在不同柿品种果实成熟软化过程中大量表达,并且具有不同的表达模式。DkLOX3基因表达量显着高于DkLOX4。此外,与DkLOX4相比,DkLOX3基因表达被丙烯处理显着上调,被1-MCP处理显着下调。3、利用扫描电镜观察贮藏期间‘富平尖柿’和‘干帽盔’果皮结构变化特性。果皮表面电镜观察发现,2个柿品种果实的果皮表面均没有皮孔结构;采收当天果皮角质层上均没有明显的微裂纹特征,贮藏12 d后微裂纹数量明显增多且加深。‘富平尖柿’果皮的微裂纹要比‘干帽盔’上的深。4、利用免疫胶体金结合透射电镜,探讨‘富平尖柿’和‘干帽盔’果实成熟软化过程中DkLOX3/4与细胞超微结构变化的关系。结果发现,贮藏12 d后,与‘干帽盔’相比,大量的DkLOX3金颗粒在‘富平尖柿’果肉细胞中迅速积累;但在相同时期2个柿品种果肉细胞标记的DkLOX4金颗粒数目均无明显变化。此时‘富平尖柿’比‘干帽盔’成熟软化快。这些结果表明DkLOX3在细胞超微结构改变中发挥重要作用,从而促进柿果实的成熟软化。5、利用qRT-PCR分析‘富平尖柿’果实成熟软化过程中DkLOX3/4基因对不同物理和外源激素处理的响应模式。分析发现经不同处理后,DkLOX3基因的表达模式基本与乙烯释放量的变化趋势相一致。机械损伤和外源ABA处理显着诱导DkLOX3基因的表达;而低温、外源SA和GA处理抑制了DkLOX3基因的表达。但特别的是,外源MeJA处理后,DkLOX3基因的表达模式不同于乙烯释放量的变化趋势。而DkLOX4基因与DkLOX3不同,除外源ABA处理抑制DkLOX4基因的表达,其他处理都不同程度的诱导DkLOX4基因的表达。6、利用染色体步移法克隆获得DkLOX3/4基因启动子序列,命名为pDkLOX3和pDkLOX4,基因登录号分别为KX779272和KX792109。烟草瞬时转化试验证明,DkLOX3/4基因启动子具有转录活性。另外,构建DkLOX3/4基因启动子缺失体探讨启动子如何调控不同9-LOX基因对非生物胁迫的响应。GUS活性分析表明,不同非生物胁迫都能诱导DkLOX3/4基因启动子的活性。根据DkLOX3/4基因启动子缺失体对不同非生物胁迫的响应情况,推测TGACG motif可能在DkLOX3基因对MeJA响应中发挥重要作用;TCA element在SA对DkLOX3/4基因启动子的诱导中具有重要作用;TATC-box、P-box和GARE motif在GA对DkLOX4基因启动子的诱导中发挥重要作用。7、利用RNA-seq技术对丙烯和1-MCP处理的‘富平尖柿’果实进行转录组分析。在不同处理柿果实转录组对比分析中获得了41,301条差异表达基因,统计丙烯处理果中基因差异表达倍数在2以上的基因有1868个,1246个基因被乙烯显着上调,622个基因被显着下调。进一步根据KEGG富集分析,筛选出柿果实中与LOX pathway相关的关键基因。8、探讨了柿果实LOX途径中13-LOX pathway在非生物胁迫应答中的作用。根据转录组测序结果,克隆获得13-LOX pathway相关关键基因DkLOX5/6、DkHPL和DkAOS。同源基因聚类分析表明DkLOX5/6均属于13-LOX;DkHPL属于13-HPL,DkAOS属于13-AOS。qRT-PCR分析发现,机械损伤和外源MeJA处理可以显着诱导DkLOX5/6、DkHPL和DkAOS基因表达升高;低温处理抑制DkLOX5/6基因的表达,诱导DkAOS、DkHPL和DkERF22基因表达升高;另外,外源ABA处理诱导DkLOX5/6、DkAOS、DkHPL和DkERF26基因表达升高。
山蓝[2]2002年在《柿果实成熟期间差异表达基因的研究》文中研究说明果实成熟是一个复杂的发育过程，涉及到基因表达和细胞代谢的改变。成熟导致果实呼吸作用上升、乙烯合成增加、色泽转变、风味形成以及软化。成熟过程可以受到许多因素的调节，如发育时期、环境信号以及内源激素等。有关成熟相关基因的分离及其表达调控的研究不仅对阐明果实成熟的分子生物学机制具有重要的理论意义，而且也为实践中人为控制果实的成熟进程提供可靠的理论依据。目前，DDRT-PCR(差异显示反转录聚合酶链式反应)技术已成为克隆差异表达基因的有效手段之一，其在生物学领域中应用的广泛性不断扩大。本实验探讨DDRT-PCR技术研究柿果实成熟差异表达基因的可行性，并以期获悉有关柿果实成熟的可能的分子生物学机制。 柿(Diospyros kaki L.f)营养丰富，并且具有药用保健功效，柿对乙烯敏感，采后易软化，不适于长途运输销售。目前，柿采后生理学研究报道较多，但对柿成熟的分子生物学研究报道还很少。 本研究成功地从富含多糖、多酚的柿果实组织中提取到具转录活性的总RNA，首次采用DDRT-PCR技术对柿果实成熟过程中差异表达的基因进行了研究，实验采用测序胶电泳银染色方法分离差异片段，采用反向Northern杂交法鉴定真实差异片段，实验最终鉴定得到了15条真实差异片段，对测序结果的同源性分析表明，编号为T4的差异片段与公认的GTP结合蛋白基因家族成员具有高度的序列同源性。由此推测，柿果实的成熟启动很可能是通过加强乙烯的信号转导途径而实现的，由此进一步调节成熟相关基因的表达。对本研究取得的结果概括如下： 1．采集不同成熟期柿树果实(品种为硙壳郎，kekelang)，进行果实硬度和乙烯释放量的测定．果实硬度测定采用GY-1型果实硬度计；乙烯测定采用抽气取气、气相色谱法。结果表明，伴随果实成熟其硬度迅速降低，在果实转黄时硬度已降到2.0kg·cm~(-2)以下；乙烯释放先呈缓慢上升的趋势，在果实完全软化变红后出现乙烯释放高峰，峰值过后乙烯释放速率迅速回落。 2．通过吸光比值分析和非变性凝胶电泳实验比较了TRIzoL法、Tris-硼酸法、异硫氰酸胍法、市售经典总RNA抽提试剂盒、Flash UNIQ-10柱离心总RNA抽提试剂盒以及改进的CTAB法提取柿果实组织总RNA的可行性，结果表明：改进的CTAB法获得的总RNA纯度高，完整性好，其吸光比值A260／A230在1.5～2.0之间，A260／A280在1.7～1.9之间；其它方法 柿果实成熟期间差异表达基因的研究 获得的总RNA吸光比值A26mA230均小于o．4，A26WA280多小于1．5， 说明产物中不同程度的含有多糖、多酚及蛋白质的污染。3．利用 DDRTPCR技术，对硬度（kg·cm”2）为 9石的绿色柿果和硬度为 5．3 的黄绿色柿果进行了基因表达差异性的研究。实验分别以硬度为9石 和5．3 的柿果实组织总RNA为模板，利用四种OligO（dT）12MN简并引 物作为锚定引物，先反转录出cDNA的第一链，随即将锚定引物和26种 随机弓I物配成104种弓I物对，利用其进一步对反转录产物实行PCR扩增， 最后通过变性聚丙烯酞胺凝胶电泳显示扩增结果，实验通过筛选分离出 差异表达的片段共66条，其中46条来自子黄绿色柿果，20条来自于绿 色柿果。4．分别以 66条差异片段为模板，在各自第一次PCR扩增相同的条件下进行 ＝次PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳显示扩增结果，采用 Concert Rapid Gel Extraction System对扩增产物实行纯化回收。66条差异片段中有6条没 能获得扩增产物，纯化回收后得到60个差异片段，二次PCR扩增效率为 引％．5．分别将60条纯It回收的差异片段与pMD181载体进行连接，获得的重 组子进一步对感受态大肠杆菌 DHS a菌株进行转化，通过菌落的蓝白鉴 定筛选，最终共获得转化菌落49个．6．对筛选得到的49个白色克隆进行质粒的快速提取，琼脂糖凝胶电泳检测 提取结果，进一步采用 UNIQ—10＃离心式质粒小量抽提试剂盒从48个 含有质粒条带的克隆中纯化质粒。以同位素标记的mRNA反转录产物 cDNA作为探针，对纯化质粒进行反向 Northern杂交，结果共获得 18个 真实差异片段。在这 18个真实差异片段中，5个来自子硬度（kg·。m刁） 为9石的绿色果实，门个来自于硬度为5．3 的黄绿色果实。对15个有效 测序结果分析表明：编号为T4的差异片段与公认的GTP结合蛋白基因 家族的成员具有很高的序列同源性。
山蓝, 王葆利, 张继澍[3]2003年在《柿果实成熟期间差异表达基因的研究》文中进行了进一步梳理目前,肺(Diospyros kaki L.f)采后生理学研究报道较多,但对柿成熟的分子生物学研究报道还很少。本实验探讨DD RT-PCR(差异显示反转录聚合酶链式反应)技术研究柿果实成熟差异表达基因的可行性,并以期获悉有关柿果实成熟的可能的分子生物学机制。通过研究取得如下结果: 1.成功地从富含多糖、多酚的柿果实组织中提取到具转录活性的总RNA。通过吸光度比值分析和非变性凝胶电泳实验比较了TRIzoL法、Tris-硼酸法、异硫氰酸胍法、市售经典总RNA
徐家玉[4]2017年在《羽裂山楂中软肉资源果实的软化机理研究》文中认为果实成熟软化现象是一个复杂的与遗传有关的生物学过程,既影响果实的硬度,又影响果实的其它品质。目前我们对山楂果实的成熟软化现象了解较少。软肉3号与秋金星均保存于国家果树种质资源沈阳山楂圃,软肉3号果实随着生长发育果实变软,而秋金星果实在生长发育过程中一直保持着较硬的状态,并且软肉类型果实成熟时的抗虫性要远远高于硬肉类型果实,因此,我们选择这两种山楂资源为试材。本试验研究了软肉3号和秋金星生长发育过程中果实的超微结构、相关水解酶活性(PG、Gns、β-GAL等)、转录组测序与分析等方面的差异,为不同质地山楂果实的形成原因提供了证据。本研究主要结果如下:1.山楂果实果肉细胞的超微结构观察发现,果实发育中期Ⅱ软肉3号和秋金星果肉细胞的细胞壁结构比较完整,呈现明-暗-明结构,细胞质紧贴在细胞壁上,并且微纤丝排列紧密且颜色较深,中胶层颜色也较深;果实成熟时,软肉3号与秋金星果肉细胞的中胶层均发生显着的降解,秋金星果肉细胞的微纤丝排列紧密且颜色较深,而软肉3号果肉细胞的微纤丝排列松弛,部分已经降解且颜色较浅。认为山楂果实不同质地的形成是由微纤丝的降解程度不同引起的。2.对山楂果实的转录组测序结果进行分析,共获得46.72 Gb的clean data,2,182,914 contigs,199,204transcripts 以及 72,837 unigenes。共有 12,143、27,411、8,280、20,603、22,628、22,240 和 39,248 分别注释到 NR,Swiss-Prot,GO,COG,KOG,KEGG 和 Pfam数据库。共获得85条与细胞壁代谢相关的unigenes,并获得了半乳糖代谢等与果实软化相关的代谢途径。转录组测序所获得的数据可以为山楂果实成熟软化的深入研究提供数据支撑。3.对软肉3号与秋金星果实β-GAL(CpBGAL1)基因CDS进行克隆及相关生物信息学分析发现,两种资源的CpBGAL1基因CDS全长均为2196 bp,编码731个氨基酸,氨基酸序列均有信号肽,属于糖基水解酶第35家族中的一员,含有两个保守结构域—半乳糖凝集素以及糖基水解酶35;分析发现秋金星CpBGAL1保守区域第52和302位氨基酸发生突变。推测可能是由于秋金星果实CpBGAL1基因所编码的氨基酸序列的保守区域发生了氨基酸突变,导致蛋白质的结构与功能发生了改变。4.对山楂果实进行酶活性测定发现,在果实成熟软化初期,软肉果实β-Gal活性远远高于硬肉果实,并且在果实软化过程中软肉果实中β-Gal活性均高于硬肉果实,与荧光定量PCR结果相一致,由此认为β-Gal在山楂果实成熟软化初期起重要的作用;山楂果实成熟软化过程中硬肉果实PG活性高于软肉果实;软肉果实PL活性与硬肉果实差异较小,并且PL活性在软肉山楂果实中呈下降趋势,与荧光定量PCR结果相一致,由此认为PG和PL与不同质地山楂果实的形成原因无关;在山楂果实成熟软化过程中软肉果实Ffase与Gns活性远远高于硬肉果实,并且软肉山楂果实软化过程中Ffase与Gns活性迅速升高,与荧光定量PCR结果相一致,由此认为Ffase与Gns在山楂果实成熟软化过程中起重要作用。荧光定量PCR分析表明,在山楂果实成熟软化初期,软肉果实PE4表达量远远高于硬肉果实,并且在果实软化过程中软肉果实PE4表达量也高于硬肉果实,表明PE4在果实软化早期起作用;在山楂果实成熟软化过程中,软肉果实α-G4L,PE63与XTH表达量高于硬肉果实,而且它们的表达量在软肉山楂果实软化过程中呈上升趋势,由此认为α-GAL,PEA3,XT 参与山楂果实的成熟软化现象。
刘超超[5]2011年在《早熟苹果品种软化机理的初步研究》文中提出果实软化是果实发育、成熟的生理生化过程,除了使色、香、味等品质发生变化外,果实的硬度、松实、脆韧、腻粗等都与果实的软化有关。同时,软化的果实容易受到机械伤害和病菌侵染,还牵涉到采收时机、贮存寿命等问题。因此,果实软化问题一直受到园艺学家和生理学家的重视。探明影响果实软化的因素,提出调控措施,是目前果品生产上急需解决的问题。果实软化受到相关酶的调控,但不同果树及同一果树的不同品种之间控制果实软化的关键酶存在差异。本研究中以‘泰山早霞’等3个早熟苹果品种为试材,采用液相色谱,气相色谱-质谱联用(GC-MS)等技术,探讨了果实发育过程中果实硬度、乙烯释放量及果实软化相关酶活性的变化,在此基础上又研究了乙烯释放抑制剂对早熟苹果品种果实耐贮性及其主要风味品质的影响,旨在为探讨果实软化机理提供基本资料,并为早熟苹果品种软化的调控奠定基础。主要研究结果如下:1.‘泰山早霞’、‘极早红’与‘辽伏’3个参试早熟苹果品种果实发育过程中果实硬度均呈下降趋势,但品种间下降的幅度存在明显差异,其中‘辽伏’品种花后75 d硬度的下降幅度为35%,‘泰山早霞’50%,‘极早红’53%;其中‘极早红’品种的快速下降期比‘泰山早霞’早大约10 d左右。2.‘泰山早霞’、‘极早红’与‘辽伏’3个参试早熟苹果品种果实发育过程中果胶甲酯酶(PE)和淀粉酶(Amylase)活性差异不明显,但‘泰山早霞’、‘极早红’的多聚半乳糖醛酸酶(PG)、纤维素酶(Cx)活性明显高于‘辽伏’, 3个品种PG酶、Cx酶活性变化与其果实硬度变化呈显着负相关;3.‘泰山早霞’、‘极早红’与‘辽伏’3个参试早熟苹果品种果实发育过程中,乙烯释放量与PG酶、Cx酶活性呈显着正相关。4.运用荧光定量PCR的方法检测了PG基因在‘泰山早霞’和‘辽伏’两品种在不同采样时期的表达情况。荧光定量数据显示: PG酶基因从花后40天开始,其表达量渐进式上升,而且两者趋势基本一致。直到花后75天,两者出现明显差异,‘泰山早霞’品种在此时达到峰值,此后其表达量呈下降趋势,而‘辽伏’品种则是一直延续上升态势。5. 1-MCP处理果实能较好的延缓‘泰山早霞’果实硬度的下降,但不同处理间下降的幅度及快速下降期存在明显差异,‘1-MCP熏蒸处理’果实硬度在整个贮藏过程中下降幅度比较平缓,而对照果实及‘1-MCP喷果处理’果实在贮藏的第四天果实硬度既有一较大幅度的下降;6.1-MCP在本试验中对‘泰山早霞’果实的乙烯释放表现出了明显的抑制作用,但是不同处理之间乙烯释放量变化差异显着;果实的多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性都受到了明显的抑制而且升高变缓,其他3种酶在整个贮藏过程中活性变化不大;7.1-MCP熏蒸和1-MCP喷果两种处理有效抑制了‘泰山早霞’苹果果实贮藏期间醛类和醇类物质总量的下降及总酯含量的增加,各香气成分受两种处理的影响存在一定差异。
奚宇[6]2017年在《绿原酸对油桃和苹果果实采后成熟衰老的调控作用》文中研究说明酚类物质是植物体中重要的次级代谢产物,其在人体中的抗氧化、抗衰老、预防心血管疾病以及改善认知等作用已广泛获得研究者的关注,但是有关酚类物质对果实采后成熟衰老进程是否以及如何产生影响的研究还比较少。本文主要研究果实内源酚类物质如何对果实成熟衰老相关蛋白质的表达以及相应酶活性产生影响从而影响果实成熟衰老进程。研究内容与结果如下:实验发现相比于新绿原酸(油桃果实果肉组织中另一种主要酚类物质),绿原酸可以更显着地减少油桃果肉切片乙烯释放量、延缓切片硬度和可溶性固形物含量下降。绿原酸可以显着降低油桃果实在贮藏期间的乙烯释放量、呼吸速率、软化程度、腐烂率和丙二醛含量。同时,绿原酸处理也延缓了贮藏期间油桃果实果皮颜色的转红、可滴定酸含量下降和可溶性固形物上升。研究还发现,绿原酸处理显着增强了果实的抗氧化活性、自由基清除能力和还原能力。实验利用双向电泳以及基质辅助激光解析电离飞行二级质谱(MALDI-TOF-TOF/MS)技术成功分离鉴定了油桃果实中74个与成熟衰老相关并受到绿原酸影响的蛋白质。其中参与果实呼吸作用的蛋白质NADP-苹果酸酶(NADP-ME)、苹果酸脱氢酶和NAD-依赖型苹果酸脱氢酶,其蛋白表达量都由于绿原酸处理出现明显下调;绿原酸处理使超氧化物歧化酶,过敏蛋白Prup1和病程相关蛋白10等具有防御性功能的蛋白表达量出现上调,;碳水化合物代谢相关蛋白质,包括α-淀粉酶,蔗糖合成酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、UDP-糖基转移酶和α-半乳糖苷酶在油桃果实成熟过程中的表达量也明显受到绿原酸影响而有所下调。绿原酸还可以显着抑制1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)在油桃果实采后成熟过程的蛋白表达量上升。使用iTRAQ定量蛋白组学技术分析苹果果肉组织中与苹果内源多酚具有亲和作用的蛋白质。分析得到157个目标蛋白质,其中包括与果实成熟衰老相关的脂氧合酶、糖基转移酶、αα-淀粉酶、淀粉支链酶、纤维素合成酶、蔗糖磷酸酶、β-半乳糖苷酶、1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(ACS)、ACO和乙烯受体蛋白等。实验以苹果果肉切片作为模型来研究绿原酸对苹果果实衰老的影响。与对照组相比,绿原酸处理显着降低了苹果果肉切片乙烯释放量和呼吸速率,减缓果肉切片硬度和可溶性固形物含量的下降。十二烷基苯磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和MALDI-TOF/TOF分析显示,绿原酸处理显着降低了苹果果肉切片中脂肪氧合酶、β-半乳糖苷酶、NADP-ME、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶等蛋白的表达量,提高了类甜蛋白的蛋白表达量。在体外实验中发现,苹果多酚和绿原酸均可抑制ACS、ACO、α-淀粉酶、脂氧合酶、β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷糖、聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶甲酯酶(PME)、NADP-ME、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)的酶活性,并且绿原酸对这些酶活性的抑制效果与苹果多酚相比没有显着差异。进一步实验发现,当苹果果肉切片经过绿原酸处理后,其中ACO、ACS、α-淀粉酶、脂氧合酶、β-葡糖糖苷酶、β-半乳糖苷酶、NADP-苹果酸酶、POD、PPO的酶活性在切片孵育观察过程中会显着下降,而PG和PME酶活性没有受到明显的影响。
刘思敏[7]2018年在《柿果实采后乙烯生物合成启动及相关基因表达研究》文中指出柿采后贮运过程中乙烯可诱导其果实软化,控制乙烯生物合成对于延长果实货架期具有重要意义。目前关于柿果实乙烯生物合成的启动机制还未见报道。本研究以广西特色品种'恭城月柿'为实验材料,研究柿果实采后贮藏期间氧化还原电位与乙烯生物合成启动的关系。同时,将乙烯利处理和对照的果实材料进行比较转录组测序,通过生物信息学分析,初步筛选出启动乙烯生物合成的相关基因,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对相关候选基因进行表达验证,探讨了乙烯合成启动机制,为建立乙烯合成启动的生物模型提供理论依据。研究结果表明:1、柿果实采后乙烯合成启动与氧化还原电位和相关酶活性的关系密切。乙烯利处理柿果实发现,贮藏第1d果实的氧化还原电(ORP)由8.29 mV·g-1快速降低至5.44 mV·g-1,同时乙烯生物合成量0.028μL·kg-1·h-1快速增加至0.529μL·kg-1·h-1。贮藏第2d,果实的硬度快速下降,总色差快速上升。整个贮藏期间,对照组果实ORP相对稳定,乙烯利处理组ORP呈现先下降后上升变化趋势。而果实的乙烯生物合成量在贮藏后期乙烯保持在0.576 μL·kg-1·h-1的高水平状态,远大于对照组。采后过程中,果实的抗氧化酶SOD、POD、GR、APX活性的变化与乙烯生成量呈极显着正相关,抗氧化剂类黄酮、总酚、花青素、谷胱甘肽、抗坏血酸的含量均大量消耗低于对照组,且总酚的含量与乙烯生成量呈显着负相关。说明柿果实采后乙烯合成启动与ORP的稳定状态密切相关,果实内抗氧化剂(类黄酮、总酚、花青素)和抗氧化酶(SOD、POD)以及AsA-GSH循环系统通过协同作用,共同调控果实的ORP稳定状态。外源乙烯利的刺激,导致果实ORP失衡,乙烯合成启动,进而促进果实的后熟软化。2、柿果实乙烯启动的相关基因的发掘与分析。通过对乙烯利处理(DK_ETH1)和对照(DK_CK0、DK_CK1)的果实材料进行比较转录组测序,共获得了 28.49 G的转录本信息,转录本组装后注释138177个Unigene。通过在叁个转录组文库中的差异表达比较分析,共获得1082个DEGs,其中DK_ETH1 vs DK_CK1比对组中筛选出的DEGs最多(929个)。将乙烯利处理与对照样品的DEGs进行Pathway显着富集分析,确定在 DK_ETH1 vs DK_CK0 和 DK_ETH1 vs DK_CK1 比对组中,最富集的是植物激素信号转导通路,分别有19和27个Unigene被富集到上调表达,其次是半胱氨酸和蛋氨酸代谢,分别有14和16个Unigene被富集到上调表达。同时还富集到类胡萝卜素生物合成、谷胱甘肽代谢、烟酸和烟酰胺代谢等抗氧化剂合成代谢相关通路中部分Unigene上调表达。说明大量的基因参与柿果实乙烯合成的启动,并证明抗氧化剂合成和代谢与乙烯合成启动关系密切。3、柿果实采后贮藏期乙烯合成启动相关基因的表达验证。通过乙烯利处理柿果实,贮藏第1d,两个蛋氨酸合成的关键酶基因metE的表达量均急剧升高,分别由起始的0.915和0.708上升至17.85和23.8,远大于对照组及乙烯利处理组果实贮藏后期的表达量。乙烯信号转导途径中F-box蛋白基因EBF1和呼吸爆发氧化酶基因RBOH在果实贮藏期间的表达模式和基因metE相似。叁个细胞色素P450基因中,CYP72A219在乙烯利处理组果实中表达量明显高于对照组。说明外源乙烯刺激,激活了RBOH基因和CYP72A219基因,促进果实内活性氧ROS的大量生成来打破果实内部的氧化还原平衡,同时激活基因metE,果实快速积累蛋氨酸,进而启动乙烯的生物合成。乙烯受体ETR通过增强乙烯合成启动过程中对乙烯的感受作用调控果实成熟的启动。同时,基因EBF1通过过量表达表现出对乙烯的不敏感来抵抗外界刺激对果实成熟的促进作用。综上所述,对乙烯生物合成的启动机制提出猜想:当外源乙烯刺激柿果实时,果实细胞内氧化系统和还原系统失衡,使得机体的ORP平衡状态被打破。ORP平衡状态一旦被打破,就会导致果实内发生应激反应,同时激活metE基因,使得蛋氨酸快速积累,进而激活乙烯合成通路,启动乙烯的生物合成,激活乙烯受体ETR基因,启动果实成熟,加快果实衰老。
林星谷[8]2013年在《利用SSH技术筛选冬枣果实衰老软化相关基因》文中进行了进一步梳理冬枣(Ziziphus jujuba Mill. cv. Dongzao)是中国特有的晚熟枣品种,也是目前公认的品质较好的鲜食枣品种,具有较高的营养价值和食疗功能。但鲜枣的贮藏期较短,采摘之后的鲜脆状态在自然条件下只能维持几天时间,难以保持其鲜食价值。研究冬枣果实贮藏过程中的差异表达基因,可有助于了解冬枣果实衰老软化的分子机制,并为将来针对性地进行冬枣品质改良提供依据。为此,本论文采用抑制性差减杂交技术对贮藏过程中冬枣半红期和全红期果实进行研究,成功构建了冬枣贮藏过程中的正向文库(半红期果实cDNA为tester,全红期果实cDNA为driver)和反向文库(半红期果实cDNA为driver,全红期果实cDNA为tester),经过斑点杂交验证和基因功能注释,最终获得154个unigene,其中包含淀粉酶、延伸因子、细胞壁水解酶、半乳糖氧化酶、乙醛脱氢酶、过氧化氢酶、ACC合成酶等衰老软化相关基因。从中挑选17个基因进行荧光定量PCR实验分析发现,在冬枣果实贮藏过程的不同成熟期,被挑选基因根据不同表达模式分为五类。由文库中筛选得到与桃树CAT1基因相似性高达88%的基因片段,通过5’-和3'-RACE扩增,拼接得到1586bp序列,该序列包含了1479bp的完整开放阅读框,编码492个氨基酸,具有CAT因家族的保守功能域。将其命名为ZjCAT,其GenBank登录号为JN831452。ZjCAT的氨基酸序列与桃树、陆地棉等多种植物的过氧化氢酶有很高的相似性,并属于类型Ⅲ过氧化氢酶。实时PCR结果显示该基因在冬枣不同组织和果实成熟期差异性表达,其中在冬枣半红期果实中表达量最高,表明在冬枣果实成熟衰老过程中可能具有重要的调控作用。
胡芳[9]2010年在《甜柿果实采后生理变化对1-MCP处理的响应机制及电学特性变化的研究》文中研究指明论文主要以我国甜柿主栽品种之一的‘富有’(Diospyros kaki.L.cv.‘Fuyu’)果实为材料,以结构与功能统一的观点,从活性氧代谢、乙烯代谢、果实品质变化、细胞壁组分和细胞超微结构变化等方面,系统研究了甜柿果实采后软化过程中不同贮藏温度对1-MCP处理的响应机制,并将LCR电子测试仪应用于甜柿果实发育后期和采后贮藏过程中电学特性变化的研究。得到以下主要结果:1.低温贮藏可显着抑制采后贮藏期间‘富有’甜柿果实的呼吸速率、乙烯代谢、活性氧代谢、膜质过氧化,延缓果实的软化进程;但低温易导致果实冷害的发生,使果实总酚含量和褐变度增加。1-MCP处理可不同程度地抑制甜柿贮藏期间的呼吸速率和乙烯释放速率,显着降低甜柿果实冷害发生。2. 1-MCP处理通过抑制果实乙烯合成中关键酶ACS的活性,减少关键酶ACO催化的底物ACC的产量,同时降低ACO活性,抑制了乙烯的生物合成;低温下外源乙烯处理后果实的ACS和ACO活性迅速升高及ACC含量增加,是果实乙烯生成量增加的主要原因。3. 1-MCP处理通过抑制了‘富有’甜柿果实活性氧清除酶(SOD、POD、CAT和APX)的活性下降、LOX的活性的上升和MDA含量的积累,降低了果实内O 2?生成速率和H2O2含量,从而抑制了由膜脂过氧化引发的乙烯生物合成,从而延缓甜柿果实衰老。低温下乙烯利处理导致O 2?和H2O2含量的增加,使得果实内活性氧清除系统失调,加速了果实的衰老。1-MCP处理还通过推迟果实总酚含量下降及PPO活性的上升,维持细胞的区室化结构,减轻果实的褐变冷害。4.甜柿果实采后在室温(20±2℃)贮藏过程中,初期木聚糖酶(Xyl)首先水解半纤维素,随后果胶甲酯酶(PE)使果胶去甲酯化,催化果胶酯酸转化为果胶酸,生成适合于多聚半乳糖醛酸酶(PG )作用的底物,结合态果胶质转变为水溶性果胶质,即水溶性果胶质(WSP)不断增加,螯合剂可溶性果胶(CSP)、碳酸钠可溶性果胶(SSP)和碱溶性果胶(ASP)含量相应减少;同时纤维素酶(Cx)水解纤维素使得细胞壁纤维素长链的水解变短,导致果实最终软化。1-MCP处理显着抑制了Xyl的活性,明显推迟了甜柿果实PE、PG和Cx活性的增加,阻止了半纤维素、原果胶和纤维素的降解,从而延缓了甜柿果实的软化。5.甜柿果实采后贮藏过程中,伴随生理生化的变化细胞超微结构发生下述相应变化:刚采收时细胞壁结构完整,中胶层与初生壁结合紧密;随着果实的软化进程中胶层逐渐降解消失,细胞壁微纤丝结构紊乱呈絮状,细胞发生质壁分离现象;叶绿体逐渐解体,嗜锇颗粒逐渐数目增多,体积变大;线粒体的嵴模糊不见;随后细胞质降解,细胞间质结构破坏,液泡破裂,细胞壁部分破损。而1-MCP处理后果肉组织细胞壁结构衰退程度相对滞后,细胞壁、中胶层、叶绿体和线粒体结构基本完整。6.利用LCR电子测试仪对‘富有’甜柿果实11个电学参数的测定表明,不同发育成熟度和采后新鲜度的果实各电学参数具有相同的电激励频率特性;随着电激励频率的增加,复阻抗(Z)、并联等效电阻(Rp)、电抗(X)和并联等效电感(Lp)不断减小,电导(G)、电纳(B)和导纳(Y)不断增加,并联等效电容(Cp)、阻抗相角(θ)、损耗系数(D)和Q因子(Q)呈不规则变化。通过数据统计软件分析,筛选出判别甜柿果实发育成熟度和采后新鲜度的最佳电激励频率为100kHz。7.以筛选出的电激励频率100 kHz对不同发育天数果实各电学参数与果实重量、果实横径、硬度和可溶性固形物含量进行相关性分析,可以根据果实电容(Cp)的变化来判别其果实发育成熟度以及发育过程中的品质鉴定,电导(G)、电纳(B)和导纳(Y)可作为鉴定的辅助指标。8.通过对100 kHz电激励频率下果实贮藏过程中各电学参数与果实细胞壁相关水解酶的活性、硬度、可溶性固形物含量和乙烯释放速率的相关性分析,筛选出电阻(Rp)、电容(Cp)、电导(G)、电纳(B)和导纳(Y)可作为标志果实采后贮藏过程中硬度(FF)的敏感电参数指标,损耗系数(D)、阻抗相角(θ)和Q因子(Q)标志可溶性固形物含量(SSC)的敏感电参数指标。
孙振营[10]2014年在《丙烯和1-MCP对不同耐贮性柿果实采后生理及EXP基因表达的影响》文中认为柿果实采收后极易软化，不利于贮藏与流通，且不同品种间存在差异。论文以‘富平尖柿’和‘干帽盔’两种不同耐贮性的柿果实为试材，分别于八成熟采收后经丙烯和1-甲基环丙烯（1-methylcyclopropene,1-MCP）处理，定期测定果实硬度、呼吸速率、乙烯释放速率、ACC合成酶（ACS）和ACC氧化酶（ACO）的活性，探讨丙烯和1-MCP对不同耐贮性柿果实采后生理变化影响的差异，为不同品种柿果实采后贮藏保鲜提供理论依据；采用实时荧光定量PCR技术检测柿果实中扩展蛋白（Expansin, EXP）基因表达量的变化，进一步探讨EXP在柿果实采后软化过程中的作用。主要研究结果如下：1.两品种柿果实在贮藏期间硬度不断下降，最终硬度降至2kg· cm-2‘富平尖柿’早于‘干帽盔’，呼吸高峰和乙烯释放高峰‘富平尖柿’比‘干帽盔’出现早且峰值更高，ACS、ACO活性均呈现先上升后下降的趋势，‘富平尖柿’的ACS、ACO酶活性高峰均显着高于‘干帽盔’。1-MCP显着减缓果实硬度的下降，但品种间差异不大，并显着降低呼吸强度和乙烯释放速率，抑制ACS、ACO的活性。丙烯显着加速软化，对呼吸速率、乙烯释放速率和两种酶活性的促进作用在‘富平尖柿’上作用更强。表明‘富平尖柿’对乙烯响应更为敏感；1-MCP处理抑制软化的效果在‘富平尖柿’优于‘干帽盔’。2.随着贮藏时间的延长和柿果实逐渐软化，对照果实DkEXP3(CDK-EXP3)和DkEXP4(CDK-EXP4)的相对表达量变化均表现为先上升后下降的趋势。丙烯处理促进了DkEXP3和DkEXP4的表达，使表达高峰升高且提前到来；1-MCP处理抑制了DkEXP3和DkEXP4的表达，推迟且降低了表达高峰。对照和1-MCP处理的果实的DkEXP3和DkEXP4的相对表达量高峰均较乙烯释放高峰早。表明EXP可能在采后柿果实成熟软化前期起作用，且受到乙烯的调控。3. DkEXP3和DkEXP4在果皮、果肉、果心中表达水平不同。表明DkEXP3和DkEXP4表达有组织特异性。
参考文献：
[1]. 柿脂氧合酶及其相关基因与果实成熟软化的关系研究[D]. 孟坤. 西北农林科技大学. 2016
[2]. 柿果实成熟期间差异表达基因的研究[D]. 山蓝. 西北农林科技大学. 2002
[3]. 柿果实成熟期间差异表达基因的研究[C]. 山蓝, 王葆利, 张继澍. 中国植物学会七十周年年会论文摘要汇编（1933—2003）. 2003
[4]. 羽裂山楂中软肉资源果实的软化机理研究[D]. 徐家玉. 沈阳农业大学. 2017
[5]. 早熟苹果品种软化机理的初步研究[D]. 刘超超. 山东农业大学. 2011
[6]. 绿原酸对油桃和苹果果实采后成熟衰老的调控作用[D]. 奚宇. 中国农业大学. 2017
[7]. 柿果实采后乙烯生物合成启动及相关基因表达研究[D]. 刘思敏. 广西大学. 2018
[8]. 利用SSH技术筛选冬枣果实衰老软化相关基因[D]. 林星谷. 北京林业大学. 2013
[9]. 甜柿果实采后生理变化对1-MCP处理的响应机制及电学特性变化的研究[D]. 胡芳. 西北农林科技大学. 2010
[10]. 丙烯和1-MCP对不同耐贮性柿果实采后生理及EXP基因表达的影响[D]. 孙振营. 西北农林科技大学. 2014
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