广东省汕头市汕头大学医学院第一附属医院康复医学科 广东 汕头 515041
【摘要】 目的 本研究测量脑缺血-再灌注组大鼠缺血半暗带及海马区Caspase-9的表达情况，探索其可能的损伤机制并为以后研究调控其表达而阻断脑细胞凋亡提供实验依据。方法 采用大脑中动脉线栓闭塞法(线栓法)制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，缺血120min后恢复再灌注24h。36只健康成年雄性SD大鼠(250±10)g，随机分为对照组（n=6）、假手术组(n=6)、缺血再灌注组(n=12)。依据Zealonga神经功能评分判断造模是否成功，用HE染色观察脑组织病理学改变，免疫组化法检测Caspase-9表达。结果 假手术组大鼠未出现任何神经缺失症状；缺血再灌注组大鼠出现不同程度的神经功能缺损。HE染色：对照组和假手术组神经元形态结构正常；缺血再灌注组缺血半暗带(部分额叶皮层及纹状体内侧区)及海马CA1区脑组织结构变疏松，间质水肿有空腔形成，神经元数量减少，体积缩小，排列紊乱疏松，神经元核固缩，染色质边集。免疫组化：假手术组Caspase-9蛋白微量表达；缺血再灌注组表达明显增强(P<0.05)。
结论：假手术组Caspase-9微量表达，缺血再灌注组凋亡细胞及Caspase-9表达有显著增加。
【关键词】Caspase-9，缺血再灌注，凋亡。
随着社会老年化进程，急性脑梗死的发病率呈明显上升趋势，占脑卒中患者的50％～80％，致残、致死率高，严重危害人民的身心健康。脑缺血再灌注损伤是指脑组织经历一定时间的缺血后恢复血流供应，使缺血性损伤进一步加重的现象。研究表明脑缺血-再灌注损伤后能启动脑细胞调亡，造成脑细胞不可逆的死亡，国内外学者大量研究表明，主动的细胞凋亡在缺血性尤其在缺血-再灌注损伤中发挥重要作用，直接针对凋亡过程的治疗方法，有助于保护半暗带区的神经细胞，对于脑缺血的治疗有着十分重要的意义。
细胞调亡是受多基因多因素调控的级联反应过程，包括缺血缺氧、细胞膜破坏、葡萄糖/营养物质缺乏、酸中毒、ATP耗竭、自由基蓄积、Ca离子稳态破坏、二硫键形成抑制等等。细胞凋亡有多条途径，涉及许多蛋白及调控程序。找到其中关键的起始开关至关重要。 Caspase（天冬氨酸半胱氨酸蛋白激酶）级联激活反应是凋亡的主要参与者和执行者[1]。一般认为Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，几乎是所有凋亡途径的最终产物，它直接导致细胞的凋亡，同时也是细胞毒性T淋巴细胞杀伤机制的重要组成部分[2]，而Caspase-9是级联瀑布反应的启动蛋白酶，在细胞凋亡调控中起重要作用。研究显示当细胞受到凋亡刺激时，可以诱导线粒体释放细胞色素c（Cyt c），激活Caspase-9，进而激活Caspase-3，启动整个Caspase级联反应，研究也证实，Caspase-9在脑卒中、神经系统退行性变或脑缺氧等多种神经系统疾病中具有重要作用，并可以通过抑制Caspase-9活性来治疗这些疾病。
本实验通过建立大鼠脑缺血再灌注模型（MCAO），探讨大鼠脑缺血再灌注后Caspase-9的表达情况，探索其可能的损伤机制并为以后研究调控其表达而阻断脑细胞凋亡提供实验依据。
材料与方法
一、实验动物及分组
健康成年SD大鼠36只，体重(250±10)g，随机分为对照组（n=6，未做处理）、假手术组(n=6，只分离颈总、颈外动脉，不做插线处理)，缺血再灌注组(n=12，拔线后腹腔注射5ml生理盐水，随后每12h注射5ml生理盐水一次)；所有动物均于术后72小时处死。取对照组、假手术组4只，缺血再灌注组8只，用于神经功能评分、HE染色、免疫组化。
二、免疫组化检测Caspase-9蛋白表达
采用二步法进行免疫组织化学实验，观察细胞质棕黄色颗粒为Caspase-9阳性表达。每张切片于400倍光镜下随机测量缺血半暗带区5个非重复视野的神经元胞浆阳性表达的吸光度值（OD值），计算其平均数。
三、统计学处理
采用SPSS17.0统计软件，所有检测数据用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。以P<0.05表示差异有统计学意义。
实验结果
一、神经功能缺失体征
对照组、假手术组大鼠未出现任何神经缺失症状；缺血再灌注组大鼠出现不同程度的神经功能缺损，如活动减少，左前肢不能完全伸展，行走时向左侧转圈出现追尾现象、向左跌倒，可伴有右侧Horner征，主要表现为眼裂变小。
二 HE染色
对照组、假手术组神经元密度大，轮廓清晰，多呈锥形，细胞核大而圆，位于细胞中央，胞浆丰富；缺血再灌注组缺血半暗带及海马CA1区脑组织结构疏松淡染，水肿有空腔形成，神经元排列紊乱，数目减少，体积缩小，胞质浓缩，胞核固缩。
三 免疫组化
阳性表达呈棕黄色，位于细胞胞浆。对照组及假手术组神经元Caspase-9存在少量表达；缺血再灌注组神经元Caspase-9表达明显；差异有统计学意义(P<0.05)(表1.1，表1.2)。
讨论
一、MCAO模型目前被认为是一种较为理想的研究人类脑梗死的动物模型，上世纪八十年代Koizumi，Longa等开创了线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，其后不断改进和完善渐趋成熟[3]，成为该模型制备的经典方法。制备合适的线栓是保证制模成功、梗死体积稳定的关键，不然会导致非MCA供血区，如海马、下丘脑、丘脑梨状皮质和内囊等结构的缺血，致脑梗死体积不稳定[4]。本实验对缺血半暗带、海马CA1区的标本神经元凋亡都做了初步统计对比，对于造模的效果有更全面的反映。但动物与人类卒中仍存在明显差异，因此需要合理分析实验结果。
二、本次研究中我们发现，caspase-9的表达与细胞凋亡的表达规律基本一致，这提示caspase-9在细胞凋亡中存在重要作用。有研究显示其上升幅度与细胞线粒体的损伤密切相关，线粒体损伤及caspase-9的表达呈正相关且互相促进，造成恶性循环，导致神经元进一步凋亡。这可能是缺血缺氧后神经细胞凋亡的早期特征，也是鉴别凋亡与坏死的重要依据之一。有研究显示大鼠全脑缺血再灌注后caspase-9 mRNA表达上调可促进神经元凋亡发生，在全脑及局灶性脑缺血动物模型的海马、皮质等缺血敏感区，caspase-9mRNA和蛋白及其靶蛋白的裂解产物水平均明显增加，并伴神经元DNA片段化[5]，caspase-9的活化与神经元凋亡呈时间依赖性关系，重度脑缺血1~2小时或轻度脑缺血9~12小时后，caspase-9开始活化，紧随其后caspase-3活化，继而caspase-3的靶蛋白PARP裂解，数小时后出现神经元DNA梯带、神经元TUNEL染色阳性及凋亡的形态学变化，caspase-3的表达比caspase-9更显著，说明该通路还具有级联放大作用。有的研究则表明调节某些能影响caspase-9表达或是改变caspase-9结构的物质能起到保护神经细胞减少细胞凋亡数量的目的，这也从侧面验证了caspase-9表达水平与细胞凋亡有着密切联系。因此寻找抑制caspase-9活性的药物可能是减轻脑缺血再灌注损伤的靶点之一，这也为治疗其他存在细胞凋亡的神经系统疾病如老年性痴呆、帕金森病等提供另一途径。
参考文献：
[1]Nieholson DW，Thornberry NA。Caspases:killerProteases。Trends Biochem。Sci，1997，22:299一306。
[2]Thornberry NA，Lazebnik Y。Caspases: enemies within。Seienee，1998，281:1312一1314。
[3]刘郁，刘瑞珍。线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型的实验研究。临床医药实践杂志，2008，17（3）180-182。
[4]包新民，舒斯云。 大鼠脑立体定位图谱[M] 。北京:人民卫生出版社，1995。 27。
[5] Namura S，Zhu J，Fink K，et al。Activation and cleavage of caspase-3 in apoptosis induced by experimental cerebral ischemia。J Neurosci，2006，18(10):3659-3668。
论文作者:陈雄姿
论文发表刊物:《医师在线》2017年6月下第12期
论文发表时间:2017/8/30
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