王正丽[1]2004年在《免疫增强剂对牙鲆（Paralichthys Olivaceu）免疫力和抗病力的影响》文中研究说明本文选择具有代表性的营养素(维生素C、维生素E、n-3HUFA、铁和锌)及非营养型多糖作为研究对象，探讨饲料中添加不同含量的营养素及非营养型添加剂对牙鲆(ParaIichthys olivaceu)非特异性免疫力和抗病力的影响。研究内容主要包括：(1)饲料中维生素E和n-3HUFA对牙鲆非特异性免疫和抗爱德华氏菌能力的影响；(2)饲料中维生素C和β-葡聚糖对牙鲆非特异性免疫力和抗爱德华氏菌能力的影响；(3)饲料中不同水平的铁对牙鲆非特异性免疫力和抗爱德华氏菌抗病力的影响；(4)饲料中不同水平的锌对牙鲆非特异性免疫力的影响；(5)饲料中锌对牙鲆胁迫后血浆中葡萄糖浓度和血清中溶菌酶活力的影响。研究结果总结如下： (1) 以初始体重为40.5±1.0g的牙鲆为研究对象，采用2×3双因子实验设计，在基础饲料中分别添加0、80、200mg／kg维生素E(α-生育酚醋酸酯)，每种维生素E水平分别添加0％、0.5％、1.5％n-3 HUFA，共制成9种实验饲料，在室内循环系统中进行为期12周的生长实验，探讨饲料中添加不同水平维生素E和n-3 HUFA对牙鲆非特异性免疫力和抗爱德华氏菌的影响。养殖系统水温保持在18±1℃，盐度为30-32‰，pH7.8-8.2，溶解氧不低于6mg／l。生长实验结束时测定血清中溶菌酶活力和替代途径补体活力，头肾巨噬细胞的呼吸爆发活力。以爱德华氏菌对各处理组进行感染实验。结果表明，肌肉中维生素E和n-3 HUFA的含量随饲料中维生素E和n-3 HUFA含量的增加而增加。但肌肉中维生素E的含量随着饲料中n-3 HUFA含量的上升而显著下降(P＜0.05)。当饲料中添加0.5％ n-3 HUFA时，替代途径补体活力(ACH50)随饲料中维生素E含量的增加而升高(P＜0.05)；在添加了外源性维生素E的饲料中，饲料中的n-3 HUFA显著增强了ACH50(P＜0.05)；投喂含有最高量的维生素E和n-3 HUFA实验组牙鲆的ACH50最高(199.9U／ml)。与不添加n-3 HUFA或只添加80mg／kg维生素E饲料相比，投喂含有最高量的维生素E和n-3 HUFA实验组牙鲆的溶菌酶活力明显增加(131.7U／mg)(P＜0.05)。当饲料中n-3HUFA的添加量为0.5％时，维生素E的缺乏显著降低了呼吸爆发活力(P＜0.05)；当饲料中添加80mg／kg维生素E时，饲料中添免疫增强剂对牙衅(尸araZichthys olivaceu)免疫力和抗病力的影响初探加n一3HUFA实验组呼吸爆发活力(74.4和66.6)显著高于不添加n一3HUFA的实验组(31.6)(P<0.05)。在感染实验中，饲料中维生素E和n一3 HUFA的添加明显减缓了牙虾开始死亡的时间(P<0.05)，并显著降低了感染后7d内的累积死亡率 (P<0.05)。此外在本实验条件下，饲料中维生素E和n一3 HUFA对牙虾非特异性免疫力和对爱德华氏菌疾病抵抗力有明显的协同作用(P<0.05)。 (2)以初始体重为40.5士1 .09的牙坪为研究对象，采用2 x3双因子设计，在基础饲料中分别添加O、500、2000 mg/kg抗坏血酸(维生素C一2一磷酸酷)，每种抗坏血酸水平分别添加O%、0.3%、0.6%纯p一葡聚糖，共制成9种实验饲料，在室内循环系统中进行为期12周的生长实验，探讨饲料中添加不同水平维生素C和p一葡聚糖对牙坪非特异性免疫力和抗爱德华氏菌的影响。养殖系统水温保持在18士1℃，盐度为30一犯%0，pH 7.8一8.2，溶解氧不低于6 mg/l。实验结束时测定血清中溶菌酶活力和替代途径补体活力，头肾巨噬细胞的呼吸爆发活力。以爱德华氏菌对各处理组进行感染实验。结果表明，当饲料中不添加或添加0.3%p一葡聚糖时，饲料中维生素C的添加显著增强了替代途径补体活力(ACH50)(P<0.05)，而维生素C对溶菌酶、呼吸爆发活力和疾病抵抗力没有显著影响 (P>0.05)。饲料中不添加维生素C时，p一葡聚糖的添加显著增强了ACH50(P<0.05);当饲料中不添加或只添加500m叭g维生素C时，不添加p一葡聚糖实验组的呼吸爆发活力显著低于添加组(P<0 .05);血清中溶菌酶活力不受饲料中的p-葡聚糖的影响(P>0.05);当饲料中添加500 mg/kg维生素C时，添加高水平的p一葡聚糖(0.6%)显著延缓了牙娜感染爱德华氏菌后死亡时间，降低了累积死亡率 (P<0.05);而当饲料中添加Z000mg/kg维生素C时，0.6%p一葡聚糖实验组的累积死亡率明显低于不添加p一葡聚糖的实验组。 (3)以初始体重为31.9土0.59的牙虾为研究对象，在饲料中分别添加。、80、300、l000m叭g铁配制成4种实验饲料，在室内循环系统中进行为期8周的生长实验，探讨饲料中的铁对牙坪非特异性免疫力和对爱德华氏菌(五口wardsiella tarda)抗病力的影响。实验期间，养殖系统水温保持在19士1℃，盐度为30一32%。，pH7.5一8.2，溶解氧不低于 6 mg/l。分别在生长实验的第2、4、6和8周进行取样。对血清中溶菌酶活力、头肾巨噬细胞的呼吸爆发活力和吞噬活力进行测定。在8周的生长实验结束，以爱德华氏菌进行腹腔注射，进行感染实验。结果表明，在第免疫增强剂对牙鲜(尸aralichthys olivaceu)免疫力和抗病力的影响初探2周时饲料中添加高水平的铁(300和1000 mg/kg)显著降低了实验鱼溶菌酶活力，而在第4周时溶菌酶活力则随着饲料中铁含量的升高显著升高。第2周时，饲料中铁的缺乏显著降低了牙坪巨噬细胞呼吸爆发活力。而第6周时，饲料中缺铁实验组吞噬百分数?
王宏田[2]2000年在《牙鲆免疫系统和抗病力的研究》文中认为本文主要以一龄牙鲆为研究对象，研究了牙鲆免疫系统的组成，以初步探讨牙鲆的抗病机制，并为牙鲆生理状况的诊断建立快捷的方法；研究了牙鲆主要消化酶的活性，为牙鲆的营养强化进行基础性的研究；研究了含有大麻哈鱼生长激素基因的重组酵母菌对牙鲆的生长和非特异性免疫能力的影响；同时对牙鲆热激蛋白hsp70的cDNA进行了合成和扩增。 本论文共包括四个部分，由十个实验组成，每个实验的研究内容介绍如下： 实验1 利用姬姆萨染色技术观察了牙鲆血细胞的显微结构。结果表明，牙鲆的血细胞由红细胞和白细胞组成，两类细胞的显微结构具有明显的差异；红细胞有细胞核，在血细胞的组成中占较高比例；不同种类的白细胞其结构不同，实验中发现了血栓细胞、淋巴细胞、单核细胞；但是只凭借光学显微形态的差异难以对白细胞进行更确切的分类。 实验2 利用透射电镜技术对牙鲆外周血细胞的超显微结构进行了观察。牙鲆的血细胞可以分为红细胞和白细胞；白细胞包括淋巴细胞、血栓细胞、单核细胞、粒细胞；粒细胞包含两种类型；实验中还发现了类似巨噬细胞的一类细胞，但未发现浆细胞的存在。 实验3 利用区带毛细管电泳技术对牙鲆血清蛋白的组成进行了分析。实验条件下，牙鲆的血清蛋白主要包含三种类型，即P2.59，P1.60，P0.77。三种蛋白的分子量和稳定性各不相同，初步判断这三种蛋白主要为白蛋白、α球蛋白和β球蛋白。 实验4和实验5 对溶菌酶和抗蛋白酶物质在假雄牙鲆体内的分布以及不同在组织和器官中的比活性进行了研究。溶菌酶广泛分布于牙鲆的体表粘液、鳃、血清、消化组织和脾、肾等组织中；抗蛋白酶物质广泛分布于体表粘液、鳃、血清、肌肉中。在不同的组织和器官中，这两种酶的比活性不完全相同。体表粘液、血清、肝脏、前肠、肾、鳃中溶菌酶的比活性较高；胃、中肠、后肠、脾中溶菌酶的比活性较低；胆汁中溶菌酶的比活性最低。血清和体表粘液中抗蛋白酶物质的比活性较高，鳃和肌肉中抗蛋白酶物质的比活性较低。由实验结果可知，鳃和消化道在牙鲆抵抗病原微生物侵袭的过程中发挥着重要的作用。 实验6 对碱性磷酸酶在牙鲆体内不同消化器官中的分布进行了研究。碱性磷酸 牙稣免疫系统和抗病能力的研究 酶在牙蚜的胃、肝脏、肠中广泛分布。在前肠和中肠部位酶的比活性较其它部位的高。 胃中碱性磷酸酶的比活性随季节的不同没有显著变化，而肠和肝脏中酶的比活性随季 节的不同具有较显著的变化。 实验7 对牙鲜体内消化酶的比活性进行了研究。在牙鲫的胃、前肠、中肠、后 肠中可以检测出蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶的活性。胃中的蛋白酶主要为酸习 性蛋白酶，肠中的蛋白酶主要为碱性蛋白酶。肠中蛋白酶的比活性由前肠向后肠递减， 前肠与中肠酶的比活性没有显著差异：牙鲜肠中脂肪酶的比活性较胃中的高，在肠的 不同部位脂肪酶的比活性无显著差异；牙稣前肠中淀粉酶的比活性最高，胃中的次之， 中肠、后肠中淀粉酶的比活性较低；牙铃的胃及肠道不同部位处的纤维素酶的比活性 没有显著差异。随着牙鲜的生长，蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶的比活性增强，淀粉酶 的比活性减弱；其中胃和中肠内纤维素酶的比活性增强得较显著。七 实验8和实验9 研究了重组酵母菌对牙鲜的生长、血清中某些激素的含量、－！血清蛋白的含量，以及血清中溶菌酶和抗蛋白酶物质的比活性等生理指标的影响。通 过投喂重组酵母菌，可以提高牙钎血清中生长激素的含量，影响牙解血清中甲状腺 激素和三碘甲状腺原氨酸的含量，促进牙蚜的生长，同时能够增加牙时血清蛋白的含 量，增强牙洱血清中溶菌酶和抗蛋白酶物质的比活性。牙醉体内生长激素含量的增加 以及酵母酉细胞壁中的多糖成分都能够增强牙醉的非特异性兔疫能力。 实验10 对牙钞肝脏中热激蛋白hsp70的CDNA序列进行了合成和PCR扩增。在 实验条件下能够合成750hP左右的核酸序列，为进一步利用热激蛋白hPP70作为生理 指标来诊断牙醉的生理状态，以及研究热激蛋白在牙稣抵抗外界胁迫中所发挥的作用 提供了基础。
耿旭[3]2011年在《几种免疫增强剂对军曹鱼（Rachycentron canadum）生长、非特异免疫力和抗病力的影响》文中指出本文研究了饲料中添加复合免疫增强剂、复合微生态制剂及不同配比的壳聚糖和枯草芽孢杆菌对军曹鱼生长、非特异性免疫力和抗病力的影响。实验以鱼粉和豆粕为蛋白源，鱼油、豆油为脂肪源制成粗蛋白在43%左右，粗脂肪在8%左右的基础饲料（对照组饲料）。实验结果如下：1．本实验研究了饲料中添加复合免疫增强剂(β-葡聚糖、A3α-肽聚糖、维生素C和E等，专利号：中国，ZL03112114.4.)对军曹鱼生长、非特异免疫力和抗病力的影响。在基础饲料中分别添加0.0、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0gkg~(-1)的复合免疫增强剂，共制成6种饲料。每种饲料为一个处理，每处理3重复，每重复一个网箱，每个网箱中放30尾鱼。实验期56天。实验结果表明：军曹鱼存活率在81.1%-84.4%之间，各组间无显著差异(P>0.05)。饲料中添加复合免疫增强剂能够显著增强军曹鱼特定生长率、血清溶菌酶活性、替代补体活力、巨噬细胞的吞噬活性和呼吸爆发活力(P<0.05)。哈氏弧菌腹腔注射7天后的累计死亡率表明，最低的累计死亡率出现在3.0g kg~(-1)添加组，并且显著低于对照组(P<0.05)。为了提高军曹鱼生长和免疫力，基于本实验的特定生长率和攻毒后死亡率的结果，通过二次曲线回归分析得出饲料中复合免疫增强剂最适添加量分别为3.43和2.71gkg~(-1)。2．本实验研究了饲料中添加复合微生态制剂(枯草芽孢杆菌7.0×10~9CFU g~(-1),地衣芽孢杆菌3.0×10~9CFU g~(-1),乳酸杆菌5.0×10~8CFU g~(-1)和节杆菌1.0×10~8CFU g~(-1))对军曹鱼生长、非特异性免疫力和抗病力的影响。在基础饲料中分别添加0.0、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0g kg~(-1)的复合微生态制剂，共制成6种实验饲料。每种饲料为一个处理，每处理3重复，每重复一个网箱，每个网箱中放30尾鱼，实验期56天。实验结果表明：军曹鱼存活率在81.1%-84.4%之间，各组间无显著差异(P>0.05)。饲料中添加复合微生态制剂能够显著提高军曹鱼特定生长率、血清溶菌酶活性、替代补体活力、巨噬细胞的吞噬活性和呼吸爆发活力(P<0.05)。哈氏弧菌腹腔注射7天后的累计死亡率表明，添加复合微生态制剂组的攻毒后死亡率显著低于对照组(P<0.05)，且各组之间无显著差异(P>0.05)。为了提高军曹鱼的生长和免疫力，基于本实验的特定生长率和攻毒后死亡率的结果，通过二次曲线回归分析可以得出饲料中复合微生态制剂最适添加量为3.3gkg~(-1)。3．本实验研究了饲料中添加枯草芽孢杆菌和壳聚糖对军曹鱼生长、非特异性免疫力和抗病力的影响。在基础饲料中分别添加0.0、1.0、2.0gkg~(-1)的枯草芽孢杆菌（菌粉为2×1010CFU g~(-1)），每个枯草芽孢杆菌水平上分别添加3.0和6.0g kg~(-1)壳聚糖，共制成6种实验饲料，加上基础饲料，共7个处理，每处理3重复，每重复一个网箱，每个网箱放25尾鱼，实验期56天。实验结果表明，军曹鱼存活率在81.3%-84.0%之间，各组间无显著差异(P>0.05)。除了饲料中添加2.0gkg~(-1)枯草芽孢杆菌和3.0gkg~(-1)壳聚糖组外，各处理组特定生长率显著高于对照组(P<0.05)，最大值出现在饲料添加1.0g kg~(-1)枯草芽孢杆菌和6.0gkg~(-1)壳聚糖组（2.57）。与3.0gkg~(-1)壳聚糖添加组和对照组相比，6.0g kg~(-1)壳聚糖添加组有更高的溶菌酶活性(P<0.05)；而在相同壳聚糖水平下，枯草芽孢杆菌各添加水平之间溶菌酶活性无显著差异(P>0.05)。在0.0和1.0gkg~(-1)枯草芽孢杆菌添加水平下，饲料中添加3.0gkg~(-1)壳聚糖组有更高的替代补体活性(P<0.05)；在3.0g kg~(-1)壳聚糖添加水平下，饲料中添加1.0gkg~(-1)枯草芽孢杆菌有更高替代补体活性(P<0.05)，但在6.0gkg~(-1)壳聚糖添加水平下，饲料中添加2.0gkg~(-1)枯草芽孢杆菌有更高替代补体活性(P<0.05)。与1.0gkg~(-1)枯草芽孢杆菌添加组相比，2.0gkg~(-1)枯草芽孢杆菌添加组的吞噬活性更高(P<0.05)，而呼吸爆发活力则更低。在相同枯草芽孢杆菌添加水平下，3.0gkg~(-1)壳聚糖添加组的吞噬活性和呼吸爆发活性都高于6.0g kg~(-1)壳聚糖添加组(P<0.05)，但2.0gkg~(-1)枯草芽孢杆菌添加水平组的趋势相反。攻毒实验则表明饲料添加2.0g kg~(-1)枯草芽孢杆菌和6.0g kg~(-1)壳聚糖组在进行哈氏弧菌腹腔注射第7天有显著最高的攻毒后存活率，并且表现出壳聚糖和枯草芽孢杆菌有明显的交互作用。基于这些实验结果可以看出，饲料中添加1.0g kg~(-1)的枯草芽孢杆菌和6.0g kg~(-1)的壳聚糖最适合军曹鱼的生长，并且能够提高军曹鱼的非特异免疫力和抗病力。可以考虑用添加枯草芽孢杆菌和壳聚糖的饲料长期投喂军曹鱼。
张玉喜[4]2006年在《重要海水养殖鱼类MHCⅡ基因克隆、表达及多态性分析》文中研究表明主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)是脊椎动物中发现的编码免疫球蛋白样受体的高度多态的基因群,并且其某些基因型与生物体抗病能力存在一定的关联关系。本研究以我国重要海水经济养殖鱼类真鲷、大菱鲆和牙鲆为实验材料,利用PCR、RT-PCR、RACE、Southern blot等技术研究了MHCⅡ基因的克隆、表达、等位基因的多态性以及等位基因的多态性与鱼体抗病力之间的关系,为筛选抗病相关MHCⅡB基因标记,建立基因标记辅助选育技术提供基础。(1)根据本实验室建立的真鲷cDNA文库中EST序列测序,得到全长为1191bp的MHCⅡBcDNA序列(Genbank accession NO.: AY848956),经BLAST分析为MHCⅡB基因。和其它脊椎动物的全长基因组序列比较,设计特异性引物进行内含子的PCR扩增,得到2494bp的基因组全序列。以rsbMHC2bIn1N和rsbMHC2bIn4C为引物进行PCR扩增,扩增产物包括完整开放阅读框序列,有7个真鲷个体被用于分析真鲷MHCⅡB的多态性,结果得到6个不同的等位基因。为了研究真鲷MHCⅡB的位点数量,用同一对引物对同一真鲷个体的开放阅读框的cDNA序列进行了PCR扩增。在所测序的11个不同的阳性克隆中,有4个不同的cDNA序列被鉴定出。另外,利用rsbMHC2b3’UTRN和rsbMHC2b3’UTRC为引物,扩增同一真鲷个体的3’UTR,有12个阳性克隆被测序,测序结果中有2个不同的序列被鉴定出,表明MHCⅡB基因至少存在两种不同的位点。用Southern blot方法进一步验证真鲷MHCⅡB基因的位点数。用MEGA3.0构建系统进化树,结果发现真鲷MHCⅡB基因的7种不同的序列聚类到一簇,另外与鲈鱼的亲缘关系较近,与丽鱼、虹鳟、大西洋鲑的亲缘关系次之,与小鼠和人类的最远。以正常鱼和鳗弧菌感染后真鲷组织为材料,以反转录合成的第一链cDNA为模板,应用RT-PCR半定量检测方法对真鲷的MHCⅡB基因组织表达特点进行了研究,结果表明,在正常真鲷组织中,其中较强的表达于鳃、脾、头肾、肾、胃、小肠和心脏中,在肌肉和血中表达最弱。在鳗弧菌感染后的肝脏、脾脏、小肠和头肾组织中,卡方检验表明,MHCⅡB基因表现为具有极显著差异的表达(χ2=103.79,248.19,19.44和87.38,P<0.01)。
于海洋[5]2010年在《牙鲆微卫星标记的筛选和美洲牡蛎抗病相关基因SNP的初步分析》文中研究表明Ⅰ.牙鲆微卫星分子标记的筛选和鉴定本研究利用基因组文库—菌落原位杂交法、构建微卫星富集文库法和利用公共数据库EST序列分析法筛选牙鲆微卫星标记。1.文库构建法筛选微卫星构建了牙鲆基因组文库,通过菌落原位杂交和测序获得牙鲆微卫星序列20个筛选出具有多态性的微卫星标记8个。通过构建微卫星富集文库和菌落原位杂交法获得阳性克隆350个,测序结果显示其中253个克隆含299个微卫星序列,其中设计了173对引物,有131对引物能扩增出预期产物,有60对引物的扩增产物呈现多态性。选取从基因组文库中获得的8个多态性微卫星标记和从富集文库获得的38个多态性微卫星标记,利用30个野生牙鲆个体对其进行多态性评价,结果显示,46个微卫星的扩增等位基因数目从4到22个不等,平均等位基因数目为14.3,观测杂合度和期望杂合度的范围分别为0.3285～0.9655和0.3854～0.9732,多态信息含量PIC平均值为0.79。2.数据库分析法筛选微卫星利用公共数据库分析从牙鲆EST库筛查含有微卫星的序列,分析了GenBank数据库中包含的牙鲆EST序列(截止2010年2月达11111个),其中751EST序列含有微卫星序列882个,占分析EST总数的6.76%,其中,二碱基、三碱基、四碱基、五碱基、和六碱基重复序列分别为444条、254条、53条、95条和40条。选择了10条含有二碱基重复且侧翼序列合适的微卫星序列设计引物,并进行引物的优化和多态性的检测,有8个位点具有多态性,其等位基因数目为6-12,平均为8.88,观测和期望杂合度分别为0.3103-0.8346和0.7272-0.8736,多态信息含量PIC平均值为0.8。在这微卫星筛选方法中,EST库筛查法是最简便,而且最省人力物力的,另外,构建微卫星富集文库法由于其富集率较高达到80%,相比较基因组文库法其效率有很大的提高,是大量标记中实现高效低耗的较好选择。Ⅱ.美洲牡蛎抗病相关候选基因的单核苷酸多态性分析选用美洲牡蛎免疫相关的大防御素基因(CvBD)和丝氨酸蛋白酶抑制因子1(CvSerpinl),通过重测序的方法,在两个基因中探寻单核苷酸多态(SNP)位点,同时选取部分SNP位点,利用高分辨率溶解曲线技术在美洲牡蛎不同地理群体和感染疾病死亡前后选育家系中进行检测,分析CvBD, CvSerpinl基因的SNP位点与美洲牡蛎感染帕金虫和尼氏单孢子虫的死亡相关性。1.CvSerpinl基因的单核苷酸多态性分析为鉴定牡蛎CvSerpinl基因(丝氨酸蛋白酶抑制因子1基因)与美洲牡蛎感染疾病死亡相关的SNP标记,我们使用来自不同地理群体的30个牡蛎样本,PCR扩增基因全长并重测序其cDNA外显子,利用软件对其序列进行分析,获得了14个SNP位点,均位于编码区,其中同义突变5个,非同义突变9个。同时利用不同地理群体和死亡前后选育家系样本,选择3个SNP位点,使用高分辨率溶解曲线技术进行SNP检测和分型,结果显示只有一个SNP位点CvSPI224(A-C)在群体和家系内均具多态性,且符合哈迪温伯格平衡。检测结果在美国北方(马塞诸塞州、新泽西州)和南方群体(佛罗里达州、德克萨斯州)之间具有显著差异,推测差异来源于地理隔离。同时在德克萨斯州和佛罗里达州群体之间检测结果也存在明显差异,推测存在差异的原因可能与两地疾病严重程度不同有关。家系间的分析结果表明此位点在死亡前后家系间存在显著差异,这意味着CvSPI224位点多态性可能同美洲牡蛎抵抗夏季MSX、Dermo病原感染有着一定的相关性。此结果同La Peyre等人利用CvSerpinl基因进行的基因表达和感染实验相一致。2. CvBD基因的单核苷酸多态性分析为鉴定牡蛎CvBD基因(大防御素基因)与美洲牡蛎感染疾病死亡有关的SNP标记,本实验使用来自不同地理群体的25个牡蛎样本,PCR扩增基因全长并重测序其CDNA外显子,对其序列进行分析,获得了25个SNP位点,除一个一个位于5’非翻译区外,其余均均位于编码区。在所有SNP位点中,同义突变只有2个,非同义突变达到了23个。SNP位点中极高的NS/S比率揭示此基因可能在进化中受到了强烈的阳性选择。利用与前文一致的样本,同样使用高分辨率溶解曲线技术对其中的3个非同义突变的SNP位点进行SNP检测和分型,其中2个位点结果在群体和家系内均具有多态性,并有一定的差异。不同地理群体结果中SNP CvBD378(T-G)仅在南方与北方群体中显示出显著的差异,而SNP CvBD90(T-G)位点显示佛罗里达群体与其他群体存在明显差异,同时两位点在群体中对于哈迪温伯格平衡存在一定的偏离(P<0.05)。在感染前后家系分析中没有观察到明显的差异,但在XG3家系中两位点均发生了偏离孟德尔遗传比的情况。推测原因可能与该基因中存在拷贝数变异(Copy Numbers Variant,CNV)有关,该变异可能影响邻近的SNP检测结果,并使出现连锁不平衡现象。对于该现象的验证,需要通过测序和更多的SNP分析来进行。本论文对于海洋生物的分子标记筛选以及其在抗病育种中的作用进行了初步研究,在牙鲆中利用不同方法获得了较多的分子标记,并对其多态性进行了检测,为下一步构建连锁图谱奠定了基础。对美洲牡蛎疾病候选基因SNP分子标记的研究表明,美洲牡蛎丝氨酸蛋白酶抑制因子1基因中的SNP位点CvSPI224 C基因型与美洲牡蛎对夏季大规模死亡相关疾病的抗性具有相关性,提示其可作为与美洲牡蛎抗病相关的候选分子标记应用于其抗病育种中,同时为贝类的标记辅助育种提供参考。而大防御素基因的抗病相关分子标记需要进一步研究验证。
杜民[6]2011年在《三种海水鱼类MHC基因多态性及半滑舌鳎家系构建与选育》文中提出本研究中,我们用一个感染性很强的细菌感染大菱鲆(Scophthalmus maximus),来研究它的主要组织相溶性复合体(MHC)IIB类基因的遗传变异情况。从6个大菱鲆家系中每个家系取100尾鱼苗用来注射爱德华氏菌悬液,家系的死亡率范围为28%到83.33%。每个家系选取5个存活个体和5个死亡个体,利用克隆和直接测序的方法来扩增大菱鲆MHCⅡB基因的第二外显子和第一内含子。从60个体中获得37个序列代表37个等位基因,其中25个等位基因是本研究中第一次发现,25个等位基因属于16个等位基因主型,选择8个等位基因来进行等位基因与抗病性/易感性间的关联性研究。在研究的每一个体中存在5个等位基因表明在大菱鲆中至少存在有3个位点或者拷贝的MHCⅡB基因。在全部家系数据中多肽结合区的非同义替换率是同义替换率的2.298倍,而在非多肽结合区非同义替换率是同义替换率的1.58倍,这些研究结果表明平衡选择在大菱鲆MHCⅡB基因的第二外显子中起作用。Scma-DBB1*02等位基因在存活个体中出现的频率要显著高于死亡个体中出现的频率(P=0.001<0.05),表明这个等位基因与大菱鲆抗爱德华氏菌病有关;而Scma-DBB1*10等位基因在死亡个体中出现的频率要显著高于存活个体中出现的频率(P=0.021<0.05),表明这个等位基因与大菱鲆对爱德华氏菌敏感相关。在脊椎动物细胞表面糖蛋白的Ⅰ类和Ⅱ类分子上的MHC基因以高水平的多态性著称。先前的研究发现,在牙鲆(Paralichthys olivaceus)中Paol-DAB*4301等位基因与抗鳗弧菌病相关,并且在牙鲆G1代中抗病家系0768和0751中出现的频率很高。为了研究Paol-DAB*4301等位基因在牙鲆后代个体中的遗传变异情况,利用鳗弧菌液对7个牙鲆家系的700个体进行感染实验,发现在这些家系中有不同的死亡率。从7个牙鲆家系的每个家系中各选取5-10个存活及死亡个体通过多聚酶链式反应(PCR)和直接测序的方法来研究它们的MHCⅡB类基因的外显子2序列。发现116个不同的外显子2序列并且代表116个不同的等位基因,显示出在牙鲆的MHCⅡB类基因的外显子2至少存在4个位点。14个等位基因在同一个家系中的存活个体和死亡个体出现的频率不同但不具有显著性。在MHC基因的多肽结合区(PBR)的非同义替换与同义替换的(dN/dS)比率是6.234,表明平衡选择在MHCⅡB类基因中起作用。Paol-DAB*4301等位基因在家系101、家系104、家系92、家系102中都出现,而另一个等位基因Paol-DAB*0101也在家系101、家系104、家系41、家系102中出现。家系5是在G2代中最抗病的家系并且在MHCⅡB基因上具有最低的杂合度。在家系101中,等位基因Paol-DAB*4301在存活个体中出现的频率是11.2%而在死亡个体中出现的频率是4.8%并且两个频率间具有显著性差异(p=0.001<0.05);在家系104中,等位基因Paol-DAB*4601在本研究中首次发现并且在存活个体中出现的频率(13.6%)要显著高于在死亡个体中出现的频率(6.5%, p=0.001);在家系41中,等位基因Paol-DAB*3803在存活个体中出现的频率(26%)要显著高于死亡个体中的频率(8%、p=0.01)。研究结果表明Paol-DAB*4301、Paol-DAB*4601、Paol-DAB*4302、Paol-DAB*3803、Paol-DAB*4101等位基因与牙鲆抗鳗弧菌病相关而Paol-DAB*2201、Paol-DAB*0301等位基因与牙鲆易感鳗弧菌病相关。利用多聚酶链式反应(PCR)和直接测序的方法对10个半滑舌鳎家系中MHC基因位点遗传变异和平衡选择情况进行了研究。通过PCR方法扩增了半滑舌鳎MHCⅡB基因大约397 bp片段,这部分包含第一外显子的一部分,第一内含子的全部和第二外显子的全部。在10个半滑舌鳎家系中,每个家系中选取5个个体,每个体中选取5个克隆进行MHCⅡB基因序列分析。在50个体中发现60个不同序列代表60个等位基因,其中有28个序列是新发现的并递交到GenBank。同源分析表明60个序列相似性为89.36%。在6个个体中每个体发现有5个不同的序列,表明在半滑舌鳎个体中至少存在3个位点或者拷贝;在9个家系的个体中MHCⅡB序列多肽结合区(PBR)的错义替换(dN)显著高于同义替换(dS)。组织相容性复合体(MHC)基因产物参与呈递外源多肽给T细胞从而在先天性免疫和适应性免疫中具有重要的作用。我们研究了经过鳗弧菌感染后的半滑舌鳎MHC classⅡB基因的遗传变异情况。来自于12个半滑舌鳎家系的2400尾鱼苗用来进行鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染。为了研究等位基因和抗性/易感爱德华氏菌病间的相关性,从4个抗病家系(HR,<40.55%死亡率)和易感家系(LR,>73.27%死亡率)中选出160尾个体进行MHCⅡB基因的exon2序列分析。半滑舌鳎MHCⅡB基因的exon2序列间显示出高度的多态性并且发现至少存在有4个位点。同时,多肽结合区的dN/dS值(非同义替换与同义替换的比值)要高于非多肽结合区的dN/dS值。在160个体中发现有88个等位基因,其中的13个等位基因用于抗病家系和易感家系中进行分布模式分析。特定的等位基因在抗病家系和易感家系中出现的频率是不同的,或者是只在抗病家系或者只在易感家系中出现。5个等位基因Cyse-DBB*6501、Cyse-DBB*4002、Cyse-DBB*6102、Cyse-DBB*5601和Cyse-DBB*2801发现与半滑舌鳎易感鳗弧菌病相关并且在抗病家系中出现的频率分别为1.25%、1.25%、1.25%、1.25%和2.5%,在易感家系中出现的频率分别为35%、33.75%、27.5%、16.25%、15%(p=0.000、0.000、0.000、0.001、0.009)。4个等位基因Cyse-DBB*3301、Cyse-DBB*4701、Cyse-DBB*6801和Cyse-DBB*5901发现与半滑舌鳎抗鳗弧菌病相关,这4个等位基因在抗病家系中出现的频率分别为13.75%、11.25%、11.25%、8.75%并且在易感家系中出现的频率分别为1.25%、1.25%、1.25%、1.25%和1.25%(p=0.005、0.018、0.018和0.064)。本研究阐明MHCⅡB基因的作用将有助于半滑舌鳎分子标记辅助选择育种的深入发展。以半滑舌鳎渤海野生群体和人工养殖群体为基础群体,建立了半滑舌鳎家系18个。对不同家系鱼苗进行荧光标记后放在同池进行生长比较,表明不同家系鱼苗生长速度差异显著,筛选出生长快速的家系2个(家系15和16号),生长较快的家系4个(家系6号、7号、16号和30号),生长速度一般的家系12个(家系1号、3号、4号、10号、12号、14号、19号、24号、27号、28号、33号和34号)。利用鳗弧菌感染其中12个家系,结果显示,2号家系感染后的成活率为79.25±45.19,被认作抗病力强家系;2个家系(12号和14号)感染后的成活率为50%-60%,被认作抗病力较强家系;6个家系(3号,6号,7号,10号,16号和19号)成活率为35%-50%,被认作抗病力一般的家系;3个家系(15号、27号和30号)的成活率在35%以下,被认作抗病力差的家系。本研究结果表明通过家系选育方法可以筛选出生长速度快、抗病力强的半滑舌鳎优良家系,从而为半滑舌鳎高产、抗病优良品种培育提供了物质基础。
倪静[7]2008年在《牙鲆和大黄鱼经济性状候选基因的DNA分子标记研究》文中指出本文利用不同的分子标记方法,分别对牙鲆及大黄鱼不同养殖群体的生长、抗病等经济性状的候选基因进行了序列多态性研究,检测到了几个SNP位点和微卫星的多态性位点,并分析了它们与经济性状之间的相关性;同时,利用微卫星的多态性位点对牙鲆2个养殖群体的遗传变异进行了分析,这些均为海水鱼类遗传育种及标记辅助选育工作提供了基础数据。在牙鲆胶南养殖群体中,以100个个体为实验材料,根据其生长激素(GH)基因的6个外显子序列设计引物,通过SSCP分析技术显示该群体GH基因的第4外显子存在多态性,检测到2种基因型,AA型和AB型。DNA测序结果表明,AB型在第1763位发生碱基突变,c→t,与AA型同源性达到99%。连锁分析结果表明:这2种基因型的个体在体重和头长上表现出显著的差异,AB型个体的体重和头长都明显大于AA型个体(P<0.05),由此推测等位基因B是一个对牙鲆体重和头长都有利的等位基因;这2种基因型个体之间在其体型性状上也存在显著差异(P<0.05);同时,该多态位点的Hardy-Weinberg平衡性检验结果表明,该群体处于Hardy-Weinberg平衡状态。在牙鲆GH基因第1外显子区域还发现了一个微卫星位点,对该位点进行多态性分析,检测到5种基因型、3种等位基因,one-way ANOVA统计结果显示,基因型AC个体的体重、头长和体高明显大于其它基因型个体(P<0.05),C是一个对体重、头长和体高有利的等位基因。对2个大黄鱼养殖群体的GH基因进行SSCP分析后发现,浙江群体大黄鱼GH基因在第196位存在1个SNP(g→a)位点,检测到2种基因型,AA和AB。t检验结果表明,AA型个体的体高比AB型个体的高(P≤0.05),但AB型个体在体长/体高上占优势(P≤0.05),提示该突变位点可以作为大黄鱼体型性状的候选标记。福建群体大黄鱼GH基因在第692位有1个SNP位点(t→c),共检测到2种基因型,CC型和CD型,其中,CD基因型个体的体重和全长显著大于CC基因型个体(P≤0.01),提示该位点可以作为大黄鱼体重和头长性状的候选标记。在牙鲆胶南和日照2个养殖群体中,采用牙鲆GHR基因5’端Promoter区的一个微卫星标记,进行了群体遗传变异的研究,并探索了该基因多态性位点与牙鲆生长性状之间的相关性。结果表明,2个群体在该位点检测到的等位基因数为12和9个,有效等位基因数为6.26和5.04个。两个群体该位点的Hardy-Weinberg遗传偏离指数均为正值,并没有显示出杂合子缺失,但各基因型分布频率都在一定程度上偏离Hardy-Weinberg平衡(P<0.01)。连锁分析发现,在胶南群体中,IM基因型对应的个体在全重、全长、体长、头长、体高和眼径形态学数据中均是最大的,但仅在体重上极其显著的大于全部其它基因型个体;在日照群体中,BC基因型对应的个体在全重、全长、体高、尾柄高、尾柄长和眼径数据中均是最大的;而CJ基因型对应的个体在体长和头长这两组数据中是最大的。由此认为,该位点IM基因型可以作为牙鲆体重性状的潜在标记。在进行牙鲆抗病性状标记的筛选时,利用迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)LSE40对牙鲆鱼进行攻毒感染实验,得到死亡群体和未死亡群体。选择Toll样受体基因中的TLR2、TLR3和TLR9基因作为候选基因,分别对这3个基因中的部分序列共设计7对引物进行扩增,同时对扩增产物进行RFLP多态性分析,目前只在TLR3基因内检测到一个EcoRI的酶切多态性位点,测序后发现,这是由于在TLR3基因第3806位的EcoRI酶切位点在某些个体中缺失所致。酶切产物共呈现出3种基因型,分别定义为AA,AB和BB。χ~2检验证明该多态性位点与牙鲆抗迟缓爱德华氏菌LSE40的能力有一定关系。利用多因素非条件Logistic回归分析对死亡组和存活组牙鲆的各种形态学数据以及不同基因型之间进行了分析,发现体长、头长和体高均具有显著的相关性(P<0.05),而这几个因素与体重的相关性不显著(P>0.05)。多因素非条件Logistic分析后发现:AA基因型对死亡率具有显著的影响(P<0.05),是主要的危险因素,而AB基因型的作用不显著(P>0.05);头长是主要的保护因素(P<0.05),体重对死亡率的影响很小。χ~2检验证明,等位基因A是对死亡的主要危险等位基因,B是对存活有利的主要等位基因。推测该位点可以作为牙鲆抗迟缓爱德华氏菌的潜在标记。
张栋[8]2018年在《尼罗罗非鱼MHC基因多态性及其与无乳链球菌抗性的关联分析》文中指出罗非鱼作为我国重要的淡水养殖及出口品种,但是近几年链球菌病的暴发引起的高死亡率,已经严重影响到罗非鱼养殖产业的健康发展。因此培育抗病品系,可有效控制链球菌病的暴发。本研究以与免疫功能密切相关的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)基因为研究对象,通过分析MHC基因的多态性及其与链球菌病之间的关系以及不同群体中MHCⅡA基因多态性和遗传特性;以期为尼罗罗非鱼(Oreochromis niloicus)抗病基因筛选及抗病品种的选育奠定基础。取得主要研究结果如下:1.尼罗罗非鱼MHC ⅡA基因多态性与无乳链球菌抗性的关联分析本研究利用尼罗罗非鱼40尾易感个体和40尾抗病个体进行MHCⅡA基因多态性与无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)抗性的关联分析。结果显示,扩增获得的片段长度为647-775 bp。从80尾尼罗罗非鱼个体中共检测到25个等位基因,隶属于22个等位基因主型。尼罗罗非鱼中的MHC ⅡA基因的第二外显子区域具有高度多态性,并且该基因中至少存在两个基因座。在抗原识别区域(PBR)和非抗原识别区域(Non-PBR)区域的非同义突变率和同义突变率的比值为1.294(>1)和1.240(>1),表明尼罗罗非鱼MHC ⅡA基因的第二外显子区域在进化过程中受正向选择作用影响。在第一次感染实验中发现等位基因Orni-DAA*0501与无乳链球菌抗性性状显著相关,等位基因Orni-DAA*1/01,Orni-DAA*1301,Orni-DAA*1401和Orni-DA4*1201与无乳链球菌易感性状显著相关。本实验为了证实MHC ⅡA特定等位基因与无乳链球菌抗性的相关性,利用惠州尼罗罗非鱼群体进行第二次感染实验。结果发现,等位基因Orni-DAA*1101在惠州易感群体(HZ-SG)中的频率显著高于惠州抗病群体(HZ-RG)的频率(P<0.05)。然而,等位基因 Orni-DA4*0501 在 HZ-SG 和 HZ-RG 中并不存在,并且Orni-DA*1201,Orni-DAA*1301和Orni-DAA*140 等位基因的分布频率在HZ-RG高于HZ-SG。由此表明,等位基因Orni-DAA*1101在尼罗罗非鱼的分子辅助育种计划中,可作为与疾病易感相关的分子标记。2.尼罗罗非鱼MHC ⅡB基因多态性与无乳链球菌抗性的关联分析本研究通过对20个家系1800尾尼罗罗非鱼(F1)进行无乳链球菌的感染实验,每个家系具有不同的存活率。根据每个家系的抗病能力,本实验从20个家系中挑选12个家系(从P0代亲本的每个家系中挑选20尾尼罗罗非鱼)进行研究。结果显示,扩增获得的片段长度为770-797 bp,从240个个体的1423条序列中共发现22个不同的等位基因,9个等位基因主型。其中核苷酸位点变异百分比为63.58%,氨基酸变异百分百为63.58%。β1和β2结构域整体的非同义突变率和同义突变率的比值为1.4595,由此说明尼罗罗非鱼MHCⅡB基因在进化过程中受正向选择作用的影响。根据12个家系(F1)在感染无乳链球菌后的存活率,由此判定,等位基因 Orni-DAB*0107,Orni-DAB*0201 和 Orni-DAB*0302 与无乳链球菌抗性性状显著相关,等位基因Orni-DAB*0701与无乳链球菌易感性状显著相关。然而本实验团队前期发现等位基因Orni-DAB*0201与无乳链球菌抗性性状相关,因此,在尼罗罗非鱼的抗病品种选育过程中,可将等位基因Orni-DAB*0201用作抗病相关分子标记。3.尼罗罗非鱼β2m基因单核苷酸多态性与无乳链球菌抗性的关联分析β2-微球蛋白(β2-microglobulin,β2m)作为MHCⅠ类分子的重要组成部分,在鱼类的免疫系统中发挥重要作用。本实验采用直接测序法从P0代尼罗罗非鱼的β2m基因序列中筛选到30个SNPs,21个SNPs位于外显子区域(其中1个SNP位于5'UTR,4个SNPs位于3'UTR,16个非同义突变位点,1个同义突变位点),9个SNPs位于内含子区域。利用Snapshot分型法对F1代的102尾易感个体和102尾抗病个体进行基因分型,并通过Popgen32和PIC-CALC软件统计分析尼罗罗非鱼β2m基因序列的SNPs的He、Ho、Ne和PIC等遗传参数,表明易感群体中7个SNPs为中度多态水平(0.25<PIC<0.5),抗病群体中25个SNPs为中度多态水平(0.25<PIC<0.5)。采用SPSS 23.0软件分析了 30个SNPs在F1代两个群体中的基因型频率和等位基因频率,分析其与链球菌抗性或易感性状之间的关系。结果表明:24个SNPs的基因型和等位基因频率与无乳链球菌抗性/易感性状密切相关(P<O.05)。通过Haploview软件分析发现30个SNPs构成4个单倍块和14种单倍型。其中,4个单倍型与无乳链球菌抗性性状密切相关(P<0.05),4个单倍型与易感性状密切相关(P<0.05)。标签SNP分析发现,单倍块2的4个SNPs和单倍块3中的13个SNPs彼此之间高度连锁(r2>0.9),这意味着我们在β2m基因中发现2个htSNPs。本研究筛选到的与链球菌抗性/易感性状相关的SNP位点及单倍型具有辅助尼罗罗非鱼抗链球菌病品种选育的潜力。4.3个不同尼罗罗非鱼群体MHC ⅡA基因多态性和遗传分化本研究从广东省3个不同养殖地区的91尾尼罗罗非鱼的个体中获得了MHCⅡA的第二外显子区域序列共501条,长度为647～742 bp。对该序列进行分析,共发现12个MHCⅡA等位基因。三个群体中核苷酸序列变异比例为34.73%～60.78%,氨基酸变异比例为68.24%～78.82%,其中惠州群体的变异比例最高(60.78%和78.82%)。遗传多样性分析表明:三个群体中惠州群体的遗传多样性参数最高。群体间分化指数(Fst)、中性检测(Tajima检测)、平均基因流、平均K2-P遗传距离和AMOVA分析的各项数据表明MHC ⅡA基因的第二外显子区域在3个不同群体间遗传分化不显著,存在一定的基因交流。本研究发现的MHCⅡA基因的高度多态性及遗传结果,为尼罗罗非鱼抗病品种的选育以及种质资源的保护奠定了重要的基础资料。
范玉顶[9]2007年在《鳗弧菌感染相关的牙鲆差异表达基因的克隆与分析》文中提出本研究以我国重要海水经济养殖鱼类牙鲆(Paralichthys olivaceus)为实验材料,利用mRNA差异显示技术(mRNA differential display,DD)研究了鳗弧菌感染前后差异基因的表达,通过RACE(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆得到了两个差异片段的全长cDNA,利用生物软件对基因的生物信息学进行了预测分析,并借助于半定量RT-PCR技术对基因的时空表达进行了较为详细的研究,现将主要的研究结果分述如下:1. DD-PCR分离鳗弧菌感染前后差异表达的牙鲆cDNA采用DD-PCR对鳗弧菌感染前后差异基因的表达进行了研究,共得到20个感染前后在牙鲆肝脏、肾脏和脾脏中差异表达的cDNA片段。通过对差异片段的回收、再扩增、克隆、测序、序列比对以及验证分析后,最终得到9个阳性片段,其中两个片段与已知基因高度同源:一个与牙鲆C3补体(Complement component 3)同源;另一个与牙鲆TEGT(testis-enhanced gene transcript)基因同源。其余7个为新的cDNA片段。半定量RT-PCR结果表明,在检测的7种组织中,C3补体只在对照组的肝脏中微量表达,注射鳗弧菌6h后在小肠中开始了表达,而且随着时间的延长,在肝脏和小肠中的表达量呈逐渐增加的趋势,推测C3补体在牙鲆鳗弧菌中起着重要的免疫调节作用。组织表达分析表明,TEGT基因在所检测的对照组7个组织中均为组成型表达,鳗弧菌感染后的6h,在各个组织中的表达量均增加,其中脾脏增加的最明显,是对照组的2倍,此后TEGT基因在脾脏中的表达随时间延长而呈下降的趋势;注射后的24h时,TEGT基因在肝脏和肾脏中的表达量达到最大,此后也随时间延长而呈下降的趋势。这说明TEGT基因存在组成型和诱导型两种表达机制,在防御病原菌的侵染过程中可能发挥着重要的作用。2.牙鲆IL-1RII基因全长cDNA的克隆及分析通过DD-PCR和RACE技术克隆得到了牙鲆白介素1受体类型II(IL-1RII)基因的全长cDNA。序列全长1793bp,包括一个100bp的5’末端非翻译区(Untranslated region,UTR)、430bp的3’UTR和长度为1263bp的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)。其中在3’UTR区还发现了3个重复的AU (ATTTA)序列。其ORF编码的蛋白含有420个氨基酸,其中含有一个16个氨基组成的信号肽,该蛋白预测的分子量为46.65KD,等电点为7.19。生物软件分析表明,该蛋白具有IL-R家族的典型结构特征:含有两个Ig样的结构和一个跨膜区;二级结构分析表明它属于混合型蛋白,空间结构和人IL-1RI晶体结构模型非常相似。通过和真鲷等鱼类以及鼠、人等哺乳动物IL-1RII基因的序列比对,发现了3个脯氨酸残基的保守位点(第155、263、268位);同源性分析表明该序列和真鲷、虹鳟的相似性比较高,分别为60.0%和47.4%,在构建的系统进化树中首先聚在了一起,然后再和小鼠、猴、人等哺乳动物聚集在一起。半定量RT-PCR检测表明,IL-1RII在正常牙鲆的大多数组织中均表达,注射鳗弧菌6小时后在肾脏和脾脏的表达量显著增加,分别是对照组的1.9倍和2.0倍。初步分析表明它具有信号转导功能,在防御细菌侵染的过程中发挥重要的免疫调节作用。3.牙鲆TM4SF4基因全长cDNA的克隆及分析借助于DD-PCR和RACE克隆得到了牙鲆四跨膜超家族成员4(TM4SF4)基因的全长cDNA。该cDNA全长1257bp,其中5’UTR为174bp,3’UTR为489bp,ORF为594bp,可编码197个氨基酸,蛋白质预测的分子量约为20.58KD,等电点为4.48。它具有四个疏水性跨膜区和三个保守的CCG(Cys-Cys-Gly)骨架等TM4家族的典型特征结构,同时还发现一段27个氨基酸组成的序列(53GSGVLMIFPALVFL GLKNNDCCGCCGN79)在所比较的9个物种中高度保守。同源性分析表明该基因的蛋白序列与鱼类以及哺乳动物类具有高度的相似性,与河豚的同源性最高为80.2%,与斑马鱼、爪蟾、鼠、猴、人、狗、牛的同源性分别为:68.5%、64.5%、68.0%、65.5%,66.5%、66.5%、66.5%。组织表达分析表明,牙鲆TM4SF4基因在对照组的脾脏和肾脏中都只有极其微弱的表达,但鳗弧菌感染以后的6h在脾脏中的表达量急剧增加,达到对照组的5.2倍,注射后的24h在肾脏中的表达量也急剧增加,是对照组的4.2倍;同时基因在肝脏中的表达呈现出随注射后时间的延长表达量逐渐增加的趋势,所以该基因表现出了明显的诱导型表达的特点,它可能也在牙鲆抵抗病原菌侵染的过程中发挥重要的免疫调节作用。
参考文献：
[1]. 免疫增强剂对牙鲆（Paralichthys Olivaceu）免疫力和抗病力的影响[D]. 王正丽. 中国海洋大学. 2004
[2]. 牙鲆免疫系统和抗病力的研究[D]. 王宏田. 中国科学院海洋研究所. 2000
[3]. 几种免疫增强剂对军曹鱼（Rachycentron canadum）生长、非特异免疫力和抗病力的影响[D]. 耿旭. 广东海洋大学. 2011
[4]. 重要海水养殖鱼类MHCⅡ基因克隆、表达及多态性分析[D]. 张玉喜. 中国海洋大学. 2006
[5]. 牙鲆微卫星标记的筛选和美洲牡蛎抗病相关基因SNP的初步分析[D]. 于海洋. 中国海洋大学. 2010
[6]. 三种海水鱼类MHC基因多态性及半滑舌鳎家系构建与选育[D]. 杜民. 上海海洋大学. 2011
[7]. 牙鲆和大黄鱼经济性状候选基因的DNA分子标记研究[D]. 倪静. 中国科学院研究生院（海洋研究所）. 2008
[8]. 尼罗罗非鱼MHC基因多态性及其与无乳链球菌抗性的关联分析[D]. 张栋. 上海海洋大学. 2018
[9]. 鳗弧菌感染相关的牙鲆差异表达基因的克隆与分析[D]. 范玉顶. 中国海洋大学. 2007
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