陈振海[1]2003年在《猪瘟病毒E0基因在原核与真核表达系中的表达》文中研究指明猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)EO糖蛋白既是包膜蛋白，又是一种核酸酶，其活性对病毒在宿主体内的持续感染有直接关系。鉴于EO蛋白在病毒感染，诱导机体免疫及与宿主细胞相互关系中的作用，本研究克隆了2株猪瘟病毒EO基因并将其与其它毒株EO基因进行了序列分析，揭示了我国猪瘟病毒流行株之间的遗传演化关系，为猪瘟病毒的流行病学研究提供依据。同时将兔化弱毒株EO基因分别置于原核与真核表达系中进行了表达，并对重组蛋白进行了初步的免疫学分析。 首先，采用RT-PCR和nest-PCR技术扩增了CSFV-JL株和CSFV-LN9912株EO基因，插入T easy载体后测序，应用DNAStar5.0和Bioedit软件将其与本实验室已测其它毒株和GeneBank中登录的CSFV代表毒株EO基因序列进行比较，绘制了遗传进化树并预测了EO蛋白的抗原表位、疏水性、等电点等特性。序列分析结果表明本实验室所测毒株可分为两群，15株CSFV EO基因RNase活性的两个氨基酸基序SLHGIWPE(或G)(28-36位)和EWNKHGWC(75-82位)高度保守，仅5个疫苗株SLHGIWPE基序中的E替换为G，基序中位于30和79位的H为RNase催化活性关键氨基酸残基，高度保守。 其次，将猪瘟兔化弱毒株(HCLV)EO基因分别插入pGEX4T，pET30，pMAL-p2X中，并分别构建了以BL21和BL21(DE3)codon plus,BL21(DE3)和BL21(DE3)codon plus,TB1和BL21(DE3)codon plus为宿主菌株的原核表达系。通过摸索IPTG诱导浓度，诱导温度，菌体收获时间等条件，确定了EO基因能在pGEX4T／BL21(DE3)codon plus和pMAL-p2X／BL21(DE3)codon plus中高效表达，表达产量分别占菌体总蛋白的15％和30％，表达的重组蛋白主要为包涵体。分别采用B-per试剂和超声波裂解配以曲通-尿素对包涵体进行洗涤两种方法在pGEX表达系中取得了较好的效果。使用分步透析法对变性的包涵体进行复性，将复性蛋白过GST亲和层析柱得到纯化的GST-EO融合蛋白。以GST-EO融合蛋白为诊断抗原，初步建立了用间接ELISA检测猪瘟血清EO抗体的方法。 此外，为了得到可溶性重组EO蛋白并便于观察重组蛋白的表达情况，我们将EGFP基因与EO基因相连插入昆虫杆状病毒转移载体中，与线性杆状病毒DNA共转染sf9细胞后通过噬斑纯化得到纯的重组杆状病毒，将其感染sf9细胞制备P1种子液，同时用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况剔除表达效果差的重组杆状病毒。再用P1种子液感染sf9细胞制备高效价的P2种子液。通过病毒液的梯度稀释和噬斑测定，确定P2种子液的病毒滴度达1.14×10~7pfu／ml。将P2种子液以MOI 5-10接种指数期sf9细胞，叁天后呈现出最强的荧光。 我们还将EGFP-EO融合基因插入哺乳动物细胞表达载体pCI-dhfr中，构建重组质粒pCI-dhfr-EGFPEO。将重组质粒转染CHO(dhfr~-)，通过一轮MTX加压筛选后，荧光显微镜下观查到少量细胞呈现绿色荧光。重组融合蛋白在昆虫细胞和CHO细胞中的初步表达为进一步大量制备可溶性的EO糖蛋白，研究其生物学功能奠定基础。
何丹妮[2]2012年在《猪源Mx1蛋白的表达及其抗猪瘟病毒感染的研究》文中研究表明Mx(Myxovirus resistance)是一种由I型干扰素(IFNa/β)诱导的具有GTP酶活性的抗病毒蛋白,具有广谱抗病毒活性。对Mx蛋白多种多样抗病毒活性机制研究非常重要。作为Mx蛋白家族的一员,猪Mx1蛋白已经被证实对流感病毒和水疱性口炎病毒有强大的抗病毒能力,但目前国内外尚未报道对猪瘟病毒的抗病毒研究。猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的严重危害养猪业的传染性疾病,被国际兽医局(OIE)列为必须通报的传染病之一。本文对猪Mx1蛋白进行了原核表达和真核表达,制备鼠抗多克隆抗体,在细胞上研究猪Mx1蛋白的抗病毒活性。1.猪源Mx1基因的原核表达、鉴定及抗血清制备本研究通过设计一对特异性引物,从pT-poMx1中扩增出Mx1基因开放式阅读框(1992bp),并将其编码区插入到携带GST标签的原核表达载体PGEX-6p-1中,经酶切和序列测定后,构建了重组质粒PGEX-poMx1;将其转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白并分析表达效果。结果表明：经终浓度为0.8mmol/L IPTG诱导后4h, poMx1基因在BL21(DE3)中获得高效表达,表达量占菌体蛋白的32.6%,SDS-PAGE显示融合蛋白相对分子质量为99KDa。将目的蛋白切胶后免疫Balb/c小鼠,制备了特异性多抗血清,Western blot结果显示该抗血清与融合蛋白孵育反应后有明显的特异性条带,该研究为poMx1蛋白抗病毒的效果鉴定和机制研究奠定了基础。2.猪源Mx1蛋白的原核表达、纯化及抗病毒活性初步研究通过设计一对特异性引物扩增出poMx1全长基因并与蛋白转导域(PTD)基因串联。将PTD-poMx1克隆至原核表达载体pCold-I。鉴定正确的阳性克隆转化大肠杆菌Rosetta2并在0.1mmol/L IPTG诱导下进行表达。SDS-PAGE结果显示,融合蛋白主要以包涵体形式表达,相对分子质量为74.2KDa。融合蛋白经过纯化、变性、透析复性和浓缩后进行入胞试验,Western blot结果表明80μg/ml PTD-poMx1与Vero细胞孵育6h后能明显检测到融合蛋白成功转导进入细胞。Vero细胞感染100TCID50VSV后进行噬斑减少试验,160μg/mL、80μg/mL和20μg/mL PTD-poMx1蛋白处理组VSV滴度Log (PFU/mL)分别为8.05、8.10和8.31,而没有用融合蛋白处理的对照组VSV滴度Log(PFU/mL)是8.55。表明在PTD-poMx1蛋白的存在下,VSV在Vero上的增殖受到了抑制,抑制作用随着处理蛋白的浓度增加而增强,而160μg/mL组和80μg/mL组相比抑制作用增强幅度不大,所以选择80μg/mL作为融合蛋白抑制病毒复制试验的处理浓度。VSV接种Vero细胞检测其TCID50发现80μg/mL组VSV TCID50下降了101.1。SYBR Green I real-time PCR检测VSV在Vero细胞上增殖的mRNA水平,VSV感染24h、48和72h后,对照Vero细胞中增殖的病毒分别是融合蛋白处理组增殖病毒的43.1倍、9.4倍和4.1倍。一系列结果均表明转导进入Vero细胞的PTD-poMx1融合蛋白发挥了抗病毒效果。PK-15细胞感染猪瘟病毒石门株,用间接免疫荧光法测定病毒TCID50,发现用80μg/mL PTD-poMxl蛋白处理后病毒滴度从104.2/mL下降到了103.6/mL.200TCID50感染PK-15细胞24h、48h和72h后,对照组猪瘟病毒的mRNA水平分别是融合蛋白处理组的2.5倍、1.9倍和2.1倍。结果说明PTD-poMx1蛋白的存在对猪瘟病毒的复制产生了抑制作用。3.稳定表达猪源Mx1蛋白PK-15细胞系的建立及其抗猪瘟病毒的初步研究根据GenBank所收录的poMxl基因序列设计一对特异性引物,从pT-poMx1亚克隆出目的基因片段,双酶切纯化后克隆至真核表达载体pEGFP-C1,构建重组质粒pEGFP-poMx1,经PCR扩增、酶切和测序分析该重组质粒；脂质体转染猪肾细胞(PK-15)后,经G418抗性筛选,通过RT-PCR、Western blot和荧光观察,鉴定表达的融合蛋白；结果表明：建立了能稳定表达poMx1蛋白的PK-15细胞系(PK-15/EGFP-poMx1), RT-PCR能够检测到转录产生的EGFP-poMxl mRNA、Western blot鉴定到99KDa的融合蛋白,直接荧光观察到融合蛋白主要在胞浆中呈现颗粒性表达。将猪瘟病毒石门株接种建立的细胞系PK-15/EGFP-poMx1后,TCID50测定、间接免疫荧光和SYBR Green I real-time PCR检测结果表明：与对照组PK-15相比,细胞系感染猪瘟病毒24h、48h和72h后的收获的上清病毒液滴度都有所下降,随着时间的增加下降幅度有所减小；细胞系中病毒荧光斑明显减少,病毒mRNA水平明显降低。说明在PK-15细胞系中稳定表达的融合蛋白EGFP-poMx1能够抑制猪瘟病毒的复制,降低子代病毒含量。通过激光共聚焦显微镜的观察研究猪瘟病毒E2蛋白和EGFP-poMx1融合蛋白的亚细胞定位,发现两个蛋白共定位在细胞核周围。该研究结果为猪源Mx1蛋白抗猪瘟病毒的机制研究奠定了基础。
廖迅[3]2016年在《猪瘟病毒C株重组标记疫苗候选株免疫原性与鉴别检测》文中提出猪瘟(Classical swine fever, CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一类能在家猪和野猪中流行,具有高度传染性的传染病,严重威胁养猪业发展。CSFV是一种含有囊膜的单股正链RNA病毒,属于黄病毒科瘟病毒属成员,基因组长约12.3kb。病毒蛋白中,结构蛋白E2、Erns以及非结构蛋白NS3为主要免疫原性蛋白,其中E2诱导中和抗体,与病毒入侵和致病性紧密相关。我国对于猪瘟防控的主要策略为猪瘟兔化弱毒苗群体免疫,但无法通过血清学方法区分疫苗免疫和自然感染动物。研究表明,CSFV流行毒株也已经从之前的group 1转向group2,新基因亚型毒株不断出现。CSF呈现地方性流行,症状非典型化,甚至在免疫猪群中也有发病。因此,开发新型猪瘟分子标记弱毒疫苗仍然是当今研究热点。本课题主要研究目标：(1)利用特异性单克隆抗体探明猪瘟病毒1型和2型E2抗原区的差异；(2)构建基于疫苗C株、携带流行毒株E2基因的嵌合重组病毒,评估其安全性和免疫原性；(3)探索猪瘟病毒Erns核心抗原区氨基酸变异对病毒复制和病毒粒子形成的影响；(4)构建以C株为骨架、携带牛病毒性腹泻病毒Erns基因的嵌合重组病毒,评估其安全性和免疫原性。1.针对猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备与表位鉴定为探究猪瘟病毒疫苗株C-strain与强毒株和流行毒株囊膜糖蛋白E2抗原差异性,我们利用原核表达的SM株和HZ1-08株E2-AD抗原区蛋白免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术结合ELISA和IFA筛选,获得了两株稳定分泌抗E2的单克隆抗体的杂交瘤细胞株2B10和4F4。免疫印迹、IFA和ELISA鉴定表明,2B10仅能与SM株反应,不能与C株和2型毒株反应；4F4能与2型流行毒株反应,与C株无反应性。已知第737位Cys突变的重组E2会破坏B/C区构象,从而影响相应单抗对该区域的识别。我们通过真核表达携带该位点突变的E2以鉴定不同单抗的识别区域,发现2B10识别线性表位,不受二级结构的影响；4F4识别构象表位,位于E2抗原区域B/C中。差异氨基酸反应性鉴定证实了2B10识别的线性表位仅存在于SM株E2,丙氨酸定点突变分析进一步证实其识别表位为707IXPXGXGG714。4F4识别构象表位位于流行毒株E2的N端高变区1(HAR1), Glu713为关键氨基酸。二株单抗均具备潜在鉴别诊断价值。2.携带流行毒株E2的嵌合重组猪瘟病毒疫苗C株的鉴定与免疫原性鉴于CSFV流行毒株的E2蛋白的抗原多样性,特别是它们与疫苗毒株之间的较大差异,可能影响疫苗的免疫保护效力。因此,在本实验室之前建立的CSFV-C株反向遗传学操作系统的基础上,构建了基于C株、携带流行毒株HZ1-08的E2主要抗原区域(870bp)和N端抗原高变区1(HAR1,90bp)的感染性克隆,拯救获得了2株嵌合重组病毒RecC-HZ-E2和RecC-HARl;HAR1缺失的感染性克隆无法拯救获得子代病毒。两株嵌合重组病毒与亲本病毒RecC在体外生长没有差异,能在兔体内复制,并诱导产生定型热反应和特异性抗体。嵌合重组病毒免疫猪后没有出现体温变化和临床症状：免疫后第14天RecC-HZ-E2免疫猪能够检测到低水平的病毒血症。免疫后第7-10天血清中能够检测到特异性E2和Erns抗体,嵌合重组病毒诱导产生的免疫血清与流行毒株E2的反应性和体外中和能力都明显高于亲本株RecC;免疫猪能够抵御强毒SM株以及流行毒株QZ14攻击,表明改造后的嵌合重组病毒可能比亲本株更有效提供对流行毒株的保护力。3.猪瘟病毒Erns核心抗原区氨基酸变异对病毒复制的影响猪瘟病毒Erns也能够诱导动物产生特异性抗体,我们证实核心抗原区AR2蛋白(aa84-160)占优势,其中aa117-125为关键氨基酸,单一突变这些氨基酸在体外能影响抗体的结合。我们试图在C株Erns上找到影响抗体结合而不影响病毒复制的关键氨基酸或抗原区,为开发“负筛选标记”弱毒疫苗奠定基础。结果表明,在C株全长感染性克隆上,核心抗原区AR2中aa117-125任一氨基酸单点或者连续缺失都无法拯救获得子代病毒粒子；而在SM株全长感染性克隆上,上述突变却都能够拯救获得病毒粒子,最长甚至可以将117-125全部缺失。我们推测Erns该区域在SM和C株之间作用有所差异,为探寻这一差异,我们以C株结构蛋白嵌合SM非结构蛋白的重组病毒(C和G)和SM结构蛋白嵌合C株非结构蛋白的重组病毒(D和E)的全长感染性克隆为骨架进行突变,能够获得117-118突变(缺失和Ala替换)的子代病毒,但其他位点氨基酸突变也无法拯救重组病毒。说明C株和SM株之间在Erns核心抗原区缺失对子代病毒产生的影响有差异,结构蛋白和非结构蛋白在其中均发挥作用。但由于以上重组病毒都无法在兔体内复制,也未能诱导特异性抗体,无法进行血清学分析。4.携带牛病毒性腹泻病毒Erns的嵌合重组猪瘟病毒C株的拯救及其生物学特性鉴定为开发能够区分野毒感染动物和疫苗免疫动物(Differentiation of infected and vaccinated animals, DIVA)的新型弱毒疫苗,我们构建了以C株为骨架,携带牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)基因型1b分离株Erns基因的嵌合重组病毒(RecC-B-Erns)作为候选疫苗株。RecC-B-Erns在体外培养细胞中生长特性与RecC一致；体内试验证明,它保持了亲本毒株RecC在兔体内复制并诱导产生定型热反应和特异性抗体的能力。猪免疫后第7-10天能够检测到与RecC相当水平的针对E2的特异性抗体,而针对Erns抗体生成时间较E2迟1-3天。重组病毒RecC-B-Erns的兔和猪全血清与BVDV 1b型Erns截短蛋白B-tErns-X反应性良好,而与C株截短蛋白C-Erns-Y没有反应性；相反RecC诱导产生血清或流行毒株感染血清与C-tErns反应性良好,而与B-tErns较差。受试猪未呈现任何临床症状,但能有效诱导体液免疫应答,并能抵御强毒株和流行毒株的攻毒,证明其良好的安全性和保护力,能够作为猪瘟标记弱毒疫苗的候选。此外,我们制备了分别针对C株Erns和BVDV 1b型Erns的单克隆抗体3E8和4D6,这两个单抗识别的均为线性表位,并且3E8只与猪瘟病毒Erns核心抗原区有反应,4D6只与BVDV 1b型Erns蛋白反应,二者识别抗原表位可用于下一步鉴别诊断试剂盒的开发。综上所述,本研究利用单克隆抗体探明了流行毒株与疫苗C株在E2部分区域抗原结构的差异,探明了E2高变区HAR1与中和抗体的形成密切相关；携带流行毒株E2或HAR1的嵌合重组病毒诱导针对2型的中和抗体能力高于亲本株RecC,免疫猪能够抵御强毒的攻击；携带BVDV Erns的嵌合重组C株猪瘟病毒对猪安全,具有良好的免疫原性。上述研究为新型分子标记弱毒疫苗的开发奠定了良好基础。
李素[4]2007年在《猪瘟病毒E2蛋白及其重复抗原表位的原核表达和特异抗血清制备》文中指出CSFV是黄病毒科瘟病毒属成员,基因组编码4个结构蛋白(C、E0、E1、E2)以及至少7个非结构蛋白(Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。其中E2蛋白为重要的免疫保护性蛋白,能刺激机体产生中和抗体。许多诊断方法以及标记疫苗的研究大都是围绕E2开展的。E2蛋白的828-842抗原表位(氨基酸序列为QTAVSPTTLRTEVVK)是中和抗原表位,该表位在CSFV高度保守,而同属的BVDV和BDV却不存在这一表位。本实验克隆了CSFV石门株E2基因和E2的抗原表位的4个重复(4P),分别插入pGEX-6P-1、pMAL-P2X表达载体中,构建了4个原核重组表达质粒,诱导后4个重组表达质粒均得到表达。将表达蛋白的上清MBP-4P、GST-4P、MBP-E2,以及复性和变性后的包涵体GST-E2应用亲和层析的方法进行了纯化,纯化后的蛋白经ELISA和Western-blotting检测具有反应性,能与猪瘟病毒阳性血清发生反应。MBP-4P、GST-4P不与兔抗BVDV E2血清发生反应,因此,可以作为一个潜在的鉴别CSFV的抗原。应用表达的融合蛋白MBP-E2、MBP-4P以及实验室制备的昆虫细胞sf9杆状病毒表达系统表达的真核E2蛋白联合免疫家兔,制备了较高滴度的多克隆血清。ELISA、Western-blotting,IFA试验证明所制备的多克隆血清具有良好的反应性和特异性。本研究为建立猪瘟病毒组合抗原的抗体检测方法和猪瘟鉴别诊断以及大量表达CSFV E2蛋白研究其结构和功能打下基础。
马思杰[5]2008年在《猪瘟病毒囊膜蛋白E0基因的表达及鼠抗E0多抗血清的制备》文中进行了进一步梳理猪瘟(Hog cholera,HC或Swine Fever,SF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的猪的一种以高热稽留、小血管变性引起出血、梗死、坏死和高死亡率为主要特征的高度接触性传染病。根据Genbank发表的猪瘟病毒CSFV HCLV-GD株E0序列,设计并合成引物,用逆转录聚合酶链式反应技术扩增CSFV兔化弱毒疫苗株C株的囊膜基因E0,结果获得大小约为700bp的片段。将该片段克隆到PGEM-T-easy载体上进行序列测定,与标准株序列同源性为99.9%。从PGEM-T-E0重组质粒中用BamHI和XhoI双酶切获得测序正确的E0基因片段,克隆入pET32a(+)中,转化BL21感受态细胞。阳性菌酶切鉴定正确后,按1:100比例接种2mL LB液体培养基,过夜培养,再以1:100比例接种2mL 2×YT液体培养基,37℃200rpm摇4 h后,加1.0mM IPTG;37℃诱导5 h后,终止培养,将菌体蛋白超声波裂解处理后进行SDS-PAGE。结果发现,E0能够得到高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在。降低温度诱导表达的结果表明,当25℃诱导时表达产物呈可溶性。Westen-blot分析结果证明,该表达产物具有反应原性。将E0基因片段与杆状病毒转座载体pFastBac1连接,筛选出重组转座载体pFastBac1-E0,转座含有杆状病毒穿梭质粒的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞后,获得重组穿梭质粒rBacmid-E0;将重组质粒DNA转染Sf9昆虫细胞,获得了含有CSFV HCLV株E0基因的重组杆状病毒rBac-E0。重组病毒感染Sf9细胞后,用E0的原核表达产物免疫小鼠的阳性血清和Western blot方法对真核细胞表达产物进行检测,结果表明:构建的重组杆状病毒能够在昆虫细胞中表达CSFV的E0蛋白,为建立E0单抗荧光筛选筛选方法和E0功能研究奠定了基础。
周斌[6]2010年在《假型猪瘟病毒体系构建及衣壳蛋白靶向灭活策略抗猪瘟病毒感染研究》文中研究说明猪瘟(Classical Swine Fever, CSF)是一种由猪瘟病毒(Classical Swine Fever virus, CSFV)引起的急性、热性和高度接触性的传染病,流行广泛,发病率高、死亡率高,危害极大,给世界和我国的养猪业造成严重经济损失。其特征为发病急,高热稽留和微血管壁变性、引起全身泛发性小点出血、脾梗死等。世界动物卫生组织(OIE)将本病列入A类法定的传染病,并规定为国际重点检疫对象。在我国制定的《家畜家禽防疫条例实施细则》中也被列为一类传染病。在进行对于猪瘟等致病性和传染性很强的病毒,操作活毒都会面临着高风险,假病毒技术是一种非常有效的研究手段。假病毒是指一种反转录病毒的囊膜糖蛋白被另外一种病毒的囊膜蛋白所置换,而基因组仍保持反转录病毒本身的特性。因为其仅能引起单循环感染(复制缺陷型),作为研究病毒的侵入模型是非常安全的,便于研究病毒的侵入机制、组织嗜性、中和抗体分析以及受体的鉴定等。另外,虽然世界上多采用疫苗免疫来控制猪瘟的流行,但是免疫失败或免疫无效现象常有发生,因此探索新的行之有效的抗病毒策略已经成为当务之急。衣壳蛋白靶向性抗病毒灭活(capsid-targeted antiviral inactivation; CTVI)是近年来兴起的基于胞内免疫的抗病毒策略,其基本原理是在病毒的组装过程中将特定的核酸酶引入到病毒颗粒内部,破坏病毒基因组,从而达到灭活子代病毒的目的。因此本研究构建了猪瘟病毒囊膜糖蛋白的假病毒体系,应用该体系研究了囊膜蛋白对猪瘟病毒侵入细胞的重要性,鉴定了病毒感染的宿主细胞谱；并建立了可替代活病毒在操作上更安全的猪瘟病毒中和试验技术平台,利用该技术平台对临床免疫囊膜糖蛋白E2的B细胞表位亚单位疫苗免疫猪群进行了中和抗体检测。同时,利用CTVI原理,构建了猪瘟病毒衣壳蛋白(Cap)与葡萄球菌核酸酶(SNase)的融合蛋白的PK-15细胞系,通过IFA、Q-PCR和ELISA证明稳定表达融合蛋白的细胞系可以抑制猪瘟病毒的增殖。论文的主要研究内容如下：1.猪瘟病毒囊膜糖蛋白的克隆及其在293T中的表达通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增了猪瘟病毒(CSFV) Shimen株囊膜糖蛋白E0、E2和E012叁个完整的阅读框基因并进行了克隆与序列鉴定,分别将其插入真核表达载体pcDNA3.0,构建了重组真核表达质粒pcDNA-E0, pcDNA-E2和pcDNA-E012。将此3个质粒经大量提取并纯化后,经磷酸钙转染人胚肾细胞(293T)。采用兔抗猪瘟高免血清为一抗,FITC-SPA为二抗,分别应用流式细胞术(FACS)和免疫转印(Western blot)鉴定真核质粒在293T细胞中的表达。结果表明3个质粒均可在293T细胞中表达,Western blot检测分析到了25.7、41.5和90kDa的3个条带,FACS检测到荧光细胞比例分别为60.2%、55.2%和56.5%。说明囊膜糖蛋白E0、E2和E012均能表达在细胞膜上,为后续假病毒颗粒的形成奠定了基础。2.构建整合囊膜糖蛋白的假型猪瘟病毒体系及其鉴定将上述已经鉴定的重组真核表达质粒pcDNA-E0, pcDNA-E2和pcDNA-E012分别与MuLv假型病毒构建体系的两种骨架载体pHIT60(包括MuLV的结构蛋白基因,即gag和pol)和pHIT111(为MuLV的基因组,还包括一个报告基因LacZ)经磷酸钙瞬时共转染293T细胞,48h后收集假病毒上清,超速离心后纯化假病毒颗粒。用抗CSFV的多抗为一抗,通过Western blot证明了整个囊膜糖蛋白E012能够在假病毒颗粒表面表达,说明E012能够整合到MuLv病毒粒子表面,该假型猪瘟病毒感染SK6、PK-15、ST、BHK21、Vero、COS7、293T和CEF等8种细胞,48h后检测发现只有在猪源细胞SK6、PK-15和ST中标记基因Lac Z能有效表达,表明所构建的假病毒具有感染性,但只能够感染猪源细胞。因此通过该假型猪瘟病毒进一步证实了猪瘟病毒对猪的单一嗜性。另外,纯化后的病毒经Reed-Muench计算其TCID50为104.58。加入各种浓度的NH4Cl(0～30 mmol/L)预先处理PK-15细胞,37℃温育1h,而后加入MuLV-E012作用,48h后,检测Lac Z.表达量；同时设pH依赖性的MuLV-VSV-G为阳性对照。实验结果表明MuLV-E012感染性与NH4Cl浓度存在极显着的线性负相关性,即随着pH值的升高,假型病毒MuLV-E012对PK-15细胞感染能力逐渐降低,而当NH4Cl浓度达到30 mmol/L时MuLV-E012进入宿主细胞几乎被完全抑制。因此通过假型猪瘟病毒证实了猪瘟病毒侵入细胞是受到pH影响的,即是pH值依赖型囊膜病毒。为避免操作活的病毒带来的搞危险性,本研究利用假型猪瘟病毒建立了微量中和试验。标准阴阳性血清和倍比稀释的待检血清56℃灭活30min后,对每份血清进行2倍梯度稀释,分别与假病毒MuLV-E012按1：1混合,4℃过夜。分别取100-tL上述病毒血清混合物一式3份加到96孔板PK15细胞中,建立了微量中和试验,与全病毒微量中和试验进行了比较,实验结果表明所建立的方法能够代替全病毒进行血清中和抗体滴度的测定,能够检测临床血清的猪瘟抗体中和效价。3.假病毒微量中和试验评价CSFV E2 B细胞表位亚单位疫苗免疫效果本研究目的是将E2的B细胞表位a(aa844-865)和b(aa693-716)串联和单独原核表达后研制亚单位疫苗,通过上述建立的假病毒微量中和试验评价亚单位疫苗的免疫效果,鉴定联合表位的优越性。实验优化了含有重组质粒(pET-rE2-a、pET-rE2-b和pET-rE2-ba)的BL21 (DE3)大肠杆菌的表达条件,将重组工程菌(BL21-rE2-a、BL21-rE2-b和BL21-rE2-ba)大量诱导表达,通过His-Bind螯合层析柱纯化融合蛋白,经SDS-PAGE和薄层扫描分析,结果表明：融合蛋白rE2-a, rE2-b和rE2-ba获得了较好的纯化。用猪抗CSFV阳性血清为一抗,HRP-SPA为二抗,DAB显色表明分别在22、22和25 kDa处出现明显条带,与预期大小相符,证实表达纯化的蛋白rE2-a、rE2-b和rE2-ba有良好的抗原性。将此3个重组蛋白分别与SEPPIC 206 VG白油佐剂进行乳化后免疫6周龄猪瘟抗体阴性的叁元商品仔猪,间隔2周再疫1次。2免后3周所有实验组用200TCID50的猪瘟石门株进行动物攻毒实验。各组仔猪在初免后间隔7d采血,应用假病毒微量中和试验检测血清中和抗体水平。实验期间,观察攻毒后各组临床症状、发病率、死淘率和保护率,每天测量实验猪的肛温。动物实验结果表明：3个重组蛋白rE2-a (A组)、rE2-b (B组)和rE2-ba (C组)均能诱导仔猪产生中和抗体水平,在攻毒后4周,中和抗体分别达到64、128和256；而疫苗组(D组)为128。重组蛋白组的保护率分别达到80%、100%和100%,D组也达到100%,因此说明B或C组产生的中和抗体达到或超过D组,免疫保护率可以与D组相当。攻毒后,A-C组的仔猪仅出现轻微的发热,但是持续时间不长,几乎全部健活；仅A组1头仔猪在发热过程中因为受到细菌继发感染,其死亡剖检发现有轻微的猪瘟病变,说明A组保护率欠缺。空白对照组(E组)的仔猪没有中和抗体产生,出现明显的猪瘟临床症状,攻毒后3周全部死亡。该结果为猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2 B细胞表位亚单位疫苗的临床应用奠定了基础。4.构建稳定表达CSFV Cap蛋白和SNase融合蛋白的细胞系猪瘟病毒为有包膜的RNA病毒,位于病毒颗粒内部的衣壳蛋白与病毒的RNA结合构成病毒的核衣壳,因此我们可以考虑利用CTVI的原理,构建猪瘟病毒衣壳蛋白(cap)与葡萄球菌核酸酶(SNase)的融合蛋白,用于抗猪瘟病毒感染的研究。根据猪瘟病毒核衣壳蛋白(cap)基因序列设计一对引物,RT-PCR扩增获得编码Cap基因的完整阅读框,将其插入到含有金黄色葡萄球菌核酸酶(SNase)基因的真核表达载体pcDNA-SNase中,筛选获得重组质粒pcDNA-Cap-SNase.测序鉴定后,脂质体转染猪肾细胞(PK-15),经终浓度1000μg/mL的G418稳定筛选,建立稳定表达Cap-SNase融合蛋白的细胞系(PK-15/Cap-SNase)。通过RT-PCR、蛋白免疫印迹(Western blot)和间接免疫荧光(IFA)鉴定Cap-SNase融合蛋白的表达,通过体外消化线性阳性质粒DNA对核酸酶活性进行检测。实验结果表明：建立的PK-15/Cap-SNase细胞系可以稳定表达融合蛋白Cap-SNase,该融合蛋白能够被兔抗核衣壳蛋白抗体所识别,并且具有良好的核酸酶活性,能够对线性阳性质粒DNA进行切割。因此,该细胞系的建立为CTVI策略抑制猪瘟病毒的增殖和感染奠定了基础。5.应用衣壳蛋白靶向灭活策略抗猪瘟病毒感染研究将猪瘟病毒Shimen株感染PK-15/Cap-SNase细胞系后,应用间接免疫荧光(IFA)、荧光定量PCR和ELISA方法鉴定CTVI系统抑制猪瘟强毒的增殖效果。实验结果表明,CTVI能有效抑制病毒的繁殖。IFA鉴定病毒感染5d后PK-15/Cap-SNase细胞中产生的子代病毒滴度与正常PK-15细胞相比较下降了102倍,6d后产生的子代病毒滴度与正常PK-15细胞相比较下降了103倍；real-time PCR分析表明,阴性对照正常PK-15细胞无明显的抑制作用,与而稳定表达融合蛋白Cap-SNase的细胞株在病毒进入的3天出现明显的抑制,接种后6天抑制趋向平稳,在第8天抑制率达到78%,差异显着。应用美国IDEXX CSFV Ag ELISA Kit的检测结果：PK-15对照细胞呈现强阳性,而PK-15/Cap-SNase细胞系的ELISA光吸收度数值明显低,呈现弱阳性。因此本研究表明PK-15/Cap-SNase细胞在不同程度上抑制了猪瘟病毒粒子的增殖。这些结果为进一步将衣壳蛋白靶向病毒灭活策略应用于抵抗猪瘟病毒感染奠定了基础。
葛恒涛[7]2016年在《利用山羊乳腺生物反应器制备具有免疫原性病毒结构蛋白的研究》文中研究表明畜禽传染病是对养殖业危害严重的一类疾病,不仅对社会造成巨大的经济损失,也给人类健康带来巨大威胁。疫苗接种是防控此类疫病的有效措施,传统的灭活疫苗和弱毒疫苗在防治和消除传染病的流行中发挥了重要作用,但都存在一定安全隐患。亚单位疫苗是致病菌或病毒的具有免疫原性的表面结构蛋白,能诱发机体产生特异性免疫,且具有更高的安全性。哺乳动物乳腺为高效的蛋白合成和分泌器官,是制备具有复杂结构蛋白理想的生物反应器。本研究利用TALE切口酶介导的基因打靶将口蹄疫病毒(FMDV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)具有免疫原性的结构蛋白基因定点整合至山羊β-乳球蛋白(BLG)基因座,并通过体细胞克隆生产转基因动物;转基因动物乳中分离纯化得到的的重组蛋白(A-FMDV VP1和CSFV E2)用于小鼠免疫试验,结果表明乳腺表达的重组蛋白具有较好的免疫原性,能够诱发机体特异性体液免疫反应。本研究旨在建立一种利用动物乳腺生物反应器生产具有免疫原性病毒结构蛋白的技术体系,为利用乳腺生物反应器制备亚单位疫苗奠定研究基础。研究内容如下:1.靶向山羊BLG基因第2外显子TALE切口酶表达载体的构建使用“TAL Effector-Nucleotide Targeter(TALE-NT)2.0”筛选针对山羊BLG基因第2外显子(BLG exon2)序列的TALENs靶位点,并利用单元模块组装法构建TALENs表达载体pTALEN-E2-L和pTALEN-E2-R;构建包含TALENs靶位点序列和其同源的牛BLG基因序列的双荧光报告载体pRFP-GBE2-GFP和pRFP-BBE2-GFP;将以上报告载体分别与TALENs共转HEK293细胞,荧光表达结果显示靶向BLG exon2的TALENs可对其靶序列进行特异性剪切;使用单碱基突变法将TALEN表达载体pTALEN-E2-L FokⅠ450位氨基酸残基Asp突变为Ala得到pTALEN-E2-Lm,即将TALENs突变为TALE切口酶。2.EGFP基因在山羊BLG基因座不同整合位点的表达水平比较根据靶向山羊BLG exon1的TALENs(本实验室保存)和靶向山羊BLG exon2的TALENs的靶位点序列设计相应的基因打靶载体;PCR扩增同源臂DNA片段、EGFP基因片段以及bGHpA片段,以ploxpⅡ为载体骨架分别构建针对BLG exon1和BLG exon2的EGFP基因打靶载体pBTE1-EGFP和pBTE2-EGFP。使用打靶载体与相对应的TALENs表达载体共转染山羊乳腺上皮细胞(GMECs),经G418筛选和PCR鉴定分别得到EGFP基因定点整合至BLG exon1/exon2的细胞克隆12和14个;打靶阳性细胞克隆经激素诱导后,使用荧光定量PCR和Western blot在EGFP基因定点整合至BLG exon1/2的GMECs中均可检测到EGFP的表达,且整合至BLG exon2的细胞中EGFP表达水平较高。结果表明,定点整合至山羊BLG基因座的外源基因可以在内源性BLG基因调控序列的指导下表达并分泌到体外,且BLG第1内含子的存在对外源基因的表达有一定的促进作用。3.TALE切口酶介导的病毒结构蛋白基因在山羊体细胞中的定点整合及转基因克隆山羊的生产分别以质粒为模板PCR扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5-M基因,猪瘟病毒(CSFV)E0、E2基因和牛A型和O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因序列,将扩增片段3’端连接bGHpA终止信号序列后,构建靶向BLG exon2的置换型基因打靶载体pBTE2-GP5-M、pBTE2-E0、pBTE2-E2、pBTE2-VP1_A、pBTE2-VP1_O。以pTALENE2-Lm和pTALEN-E2-R为模板体外转录制备编码TALE切口酶的mRNAs;并将其分别与以上各基因打靶载体共同电穿孔转染山羊胎儿成纤维细胞,经G418正向筛选、GANC负向筛选、PCR及测序鉴定分别得到GP5-M、E0、E2、VP1_A和VP1_O基因序列定点整合至BLG exon2的细胞克隆。以基因打靶阳性细胞为核供体,经体细胞核移植及胚胎移植共生产克隆山羊7只,经PCR、测序鉴定及Southern blot进行基因型分析,其中PRRSV GP5-M基因打靶山羊2只;CSFV E0基因打靶山羊2只;CSFV E2基因打靶山羊1只;A型FMDV VP1基因打靶山羊2只。以上结果表明,TALE切口酶介导的基因打靶技术可用于制备基因组中定点整合外源基因的山羊体细胞。4.基因打靶羊乳汁中重组蛋白的检测及其免疫原性验证对A型FMDV VP1和CSFV E2基因打靶奶山羊进行激素诱导泌乳,收集乳汁经脱脂和去除酪蛋白处理后得到乳清,将乳清样品SDS-PAGE之后进行考马斯亮蓝染色、Western blot及ELISA检测重组VP1(rVP1)和重组E2(rE2)的表达效率,其中乳清中rVP1和rE2浓度分别为1.02 mg/mL和1.46 mg/mL。乳清中的rVP1和rE2经Ni离子螯合亲和层析纯化,添加佐剂后分别免疫Balb/c小鼠,免疫后第4周可在小鼠血清中分别检测到FMDV和CSFV特异性抗体。以上结果表明,定点整合至山羊BLG exon2的外源基因可以利用内源性BLG调控序列在动物体内进行高效的表达分泌,且表达的重组病毒结构蛋白具有良好的免疫原性,能够诱发动物机体特异性体液免疫反应。综上所述,本研究利用TALE切口酶介导的同源重组将病毒结构蛋白基因定点整合至山羊BLG基因第2外显子,获得的转基因动物乳腺中能够分泌具有免疫原性的重组蛋白,为利用转基因动物乳腺生物反应器制备亚单位疫苗的研究奠定了基础。
刘芳冰[8]2016年在《猪瘟病毒E0蛋白在酵母系统和哺乳动物细胞系统中的表达与鉴定》文中指出猪瘟(Classical Swine Fever, CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV)引起的一种高度接触性传染病,死亡率高,危害严重,被列为动物A类传染病。猪瘟病毒是隶属黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestiyirus)的单股RNA病毒,其中,猪瘟病毒E2、E0蛋白是可诱导机体产生中和性抗体的保护性蛋白,E0是唯一可分泌到猪瘟病毒感染细胞培养液上清中的糖蛋白。编码E0的氨基酸序列要更为保守,研究E0蛋白对CSF的防制具有重要意义。本论文主要进行了以下几方面的研究：一：猪瘟病毒E0蛋白在毕赤酵母表达系统中的表达与鉴定。利用基因工程手段,成功构建能够在毕赤酵母GS115菌株中表达E0蛋白的重组质粒pPIC9K-E0,通过电转化将其转化到GS115中,通过对诱导时间、诱导温度以及甲醇的诱导浓度进行优化,最终确定了28℃诱导温度下甲醇终浓度为0.5%诱导120h可以使E0蛋白的产量达到最高。使用猪瘟病毒阳性血清对粗提后的E0蛋白进行Western blot鉴定和间接ELISA鉴定,鉴定结果表明,利用酵母菌株表达的重组E0蛋白具备良好的反应原性,可以作为包被原对猪瘟病毒的E0抗体进行检测。二：猪瘟病毒E0蛋白在PK-15细胞中的表达与鉴定。成功构建能够在猪源性PK-15细胞中表达目的蛋白的重组质粒PEGFP-E0,并通过化学转染的方法将其插入PK-15细胞中,实现了猪瘟病毒E0蛋白在PK-15细胞中的表达。为进一步大量表达纯化E0糖蛋白、研究其生物学功能和活性奠定了基础。
季新成[9]2004年在《猪瘟病毒E2基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达》文中研究指明本文利用反转录PCR（RT-PCR）和套式PCR（nPCR）技术，对流行于国内部分地区的9株猪瘟病毒（CSFV）E2基因进行克隆，并对其核苷酸及氨基酸序列的同源性进行比较及分析，绘制了系统关系发生树，以期了解近期猪瘟流行野毒主要保护性抗原E2基因的变异情况，为猪瘟的防制提供分子流行病学方面的资料。同时以1株（陕西周至株）为材料，在昆虫细胞中进行表达，为新型猪瘟基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。（1）采用RT-PCR和nPCR扩增出9株国内近期猪瘟流行野毒株的E2基因，将其分别克隆于pMD18-T载体并进行核苷酸序列测定，根据C-株，Brescia株，Alfort株及Shime株确定起始氨基酸叁联体的正确位置后进行氨基酸序列推导，并进行了同源性比较，绘制了系统关系发生树。结果表明,所测9株CSFV E2基因的长度均为1324 bp，编码的氨基酸序列均包括完整信号肽序列和跨膜序列，共由442个氨基酸残基组成。可将13株(包括4株参考毒株)CSFV 分为两个组群，GXGL ，GXNN，LNAS，SDJN 4株毒株与C 株，Shimen株， Alfort株和 Brescia株同为一个群组，其E2基因间的核苷酸序列同源性为94.0%～99.4%，所推导氨基酸序列同源性为93.7%～99.5%。HNLS ，SXZZ ，HNCA ，HNXY和 HNDX 5株同为另一群组，之间核苷酸序列同源性为81.9%～99.7%，所推导氨基酸序列同源性为88.2%～99.1%。13株E2基因间的核苷酸序列同源性为81.9%～99.7%，所推导氨基酸序列同源性为88.2%～99.5%，其中 9株流行野毒与4株参考毒株之间核苷酸序列同源性为81．9%～98.9%，所推导氨基酸序列同源性为88.2%～99.5%。说明近期流行毒株的变异呈现一定的多样性。通过对主要抗原区域氨基酸位点变异进行分析，发现各毒株间抗原决定簇未发生明显的变异。（2）对已知的E2基因进行分析后，用聚合酶链式反应（PCR）从陕西周至株克隆化E2全基因中扩增出除去3'端跨膜区的特异性片段（1 033 bp），并在其两端引入BamH I和Hind III酶切位点，将其亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb，获得重组质粒 pFBHT-E2，转化进含穿梭载体Bacmid 的感受态细胞DH10Bac，得到含E2基因的重组载体质粒rBacmid-E2，以脂质体介导的方法将此重组载体质粒转染 sf9昆虫细胞，经SDS-PAGE和Western-blotting及ELASA等方法检测，结果表明，此E2基因在昆虫细胞中正确表达，表达的蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应。
胡慧[10]2004年在《猪瘟病毒E2基因的表达及其间接ELISA诊断方法的研究》文中提出本研究试图从分子生物学角度来揭示目前猪瘟仍频繁发生的原因，为广泛开展CSFV分子流行病学的研究提供基础资料，为CSF的防制提供科学依据和理论支持，为猪瘟诊断提供稳定的标准诊断抗原及诊断方法。本论文由4部分构成：1.应用RT-PCR和nPCR扩增了7株国内近期流行的CSF野毒E2基因，分别克隆于pGEM-T Easy载体，对其进行了核苷酸序列测定及氨基酸序列推导，同时将其与C株，Alfort株，Brescia株进行了同源性比较及遗传进化分析，并构建了CSFV的遗传发生树。结果表明，7株流行野毒与C株，Alfort株，Brescia株核苷酸序列同源性分别为91.6%～94.5%，89.2%～92.7%和85.9%～89.3%，氨基酸同源性分别为91.2%～95.8%，88.9%～92.0%和84.0%～90.1%；而7株野毒之间的差异很小，其核苷酸序列同源性为95.8%～99.7%，氨基酸同源性为96.3%～99.1%。所绘制的遗传发生树分为2个组群，所测得7株流行野毒均属于第1群，而且可分为两亚群，与C株和HCLV株都在同一亚群。表明现行猪瘟病毒流行株的变异呈现一定的多样性，并不尽向远离疫苗株的方向变异，现行的猪瘟疫苗在一定程度上仍然可以起到保护作用。2.应用RT-PCR技术对中国猪瘟兔化弱毒株，经典强毒株石门毒株(Shimen)，近期地方流行的属于第一群毒株的新疆毒株(XJ)和第二群代表毒株甘肃临洮(LT)株E2基因的主要抗原区(包括A，B，C，D在内)进行扩增，均得到约561bp的基因片段。将这4个基因分别克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中，经酶切、PCR扩增和测序分析确证其正确插入到表达载体中，且阅读框正确，从而构建成重组表达载体。重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中，用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，用SDS-PAGE电泳，Western-blotting和薄层凝胶扫描分析表达的蛋白。结果表明，E2基因的主要抗原区可以在大肠杆菌中表达，表达的蛋白多以包涵体形式存在，表达产物的分子量约为50kDa(目的基因的蛋白分子质量为21.7kDa，载体GST分子质量为29kDa)，与理论推测的蛋白分子量一致；薄层凝胶扫描分析表明，表达蛋白约占菌体蛋白总量的20%～30%；经Western-blotting证明，表达的E2蛋白可被猪瘟阳性血清所识别，表达蛋白可用于基因工程诊断抗原。3.C株和LT株E2基因主要抗原区在pGEX-4T-1表达载体中表达产量较高，但是都以包涵体形式存在，必须经过复性才具有生物学活性。收集诱导表达的菌液，超声波破碎分离包涵体，尿素和Triton X-100分别洗涤包涵体，用尿素溶解包涵体，复性液稀释变性蛋白，缓冲液透析获取纯化蛋白。SDS-PAGE分析电泳结果表明，尿素和Triton X-100可洗去部分杂蛋白，8mol/L尿素能很好的溶解包涵体，回收率较低约10%，其纯度可达70%。ELISA试验测定的结果显示，与复性前变性蛋白相比，纯化蛋白与CSFV阳性血<WP=6>清反应的特异性提高20倍左右。可以批量生产基因工程诊断抗原来取代全病毒抗原；有望进一步研制针对E2的单克隆抗体，为CSF的诊断提供先进的技术。4.用纯化的猪瘟病毒重组E2蛋白作为抗原包被酶标板，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG为二抗，建立了检测猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法，并确定了ELISA最佳工作条件：C株和LT株抗原包被浓度分别为8.7μg/mL和11.7μg/mL，37℃放置1h后，再4℃过夜，猪瘟阳性血清(1∶160)在37℃作用1h，二抗(1∶800)37℃作用1h，底物溶液37℃显色15min。通过重复性试验，交叉试验，特异性试验和稳定性试验等试验结果表明该方法重复性好，特异性强，灵敏度高；与用猪瘟全病毒为抗原的ELISA试剂盒，间接血凝试剂盒比较，特异性为97.14%，敏感性为93.18%，两者的符合率为95%，经统计学分析，这两种检测方法的检验结果无显着性差异(P>0.05)。用已建立的方法检测临床血清样本148份，总阳性率为68.91%。本研究结果为猪瘟诊断方法的标准化提供了实验基础，为猪瘟的诊断与监测提供一种良好的技术手段。
参考文献：
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[2]. 猪源Mx1蛋白的表达及其抗猪瘟病毒感染的研究[D]. 何丹妮. 南京农业大学. 2012
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[4]. 猪瘟病毒E2蛋白及其重复抗原表位的原核表达和特异抗血清制备[D]. 李素. 吉林大学. 2007
[5]. 猪瘟病毒囊膜蛋白E0基因的表达及鼠抗E0多抗血清的制备[D]. 马思杰. 扬州大学. 2008
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[7]. 利用山羊乳腺生物反应器制备具有免疫原性病毒结构蛋白的研究[D]. 葛恒涛. 西北农林科技大学. 2016
[8]. 猪瘟病毒E0蛋白在酵母系统和哺乳动物细胞系统中的表达与鉴定[D]. 刘芳冰. 郑州大学. 2016
[9]. 猪瘟病毒E2基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达[D]. 季新成. 西北农林科技大学. 2004
[10]. 猪瘟病毒E2基因的表达及其间接ELISA诊断方法的研究[D]. 胡慧. 西北农林科技大学. 2004
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