·论 著·
大鼠骨骼肌浸渍液电导率及其化学物质含量与死亡时间的关系
郑哲1，翟仙敦1，夏志远2，李永林1，赵琳琳1，刘慧丽3，莫耀南1
（1.河南科技大学法医学院，河南 洛阳 471003；2.中国政法大学证据科学研究院，北京 100088；3.河南科技大学医院，河南 洛阳 471003）
摘 要： 目的 研究骨骼肌组织浸渍液电导率中化学离子随死亡时间（postmortem interval，PMI）的变化机制。方法 将健康SD大鼠处死后保存于25℃左右的环境中，于死后即刻（0d）、1d、2d、3d、4d、5d、6d和7d提取大鼠骨骼肌组织，并与去离子水混合制成质量浓度为0.1g/mL的浸渍液，测定骨骼肌组织浸渍液EC值及常见的钾离子、钠离子、氯离子等9种化学成分的含量。结果 大鼠死后7d内骨骼肌EC随PMI的延长而逐渐增大（P =0.024），其浸渍液中尿酸（P =0.032）、尿素氮（P =0.013）、无机磷（P =0.022）的含量随PMI的延长而逐渐升高，镁离子的含量则随PMI的延长而逐渐降低（P =0.047），而钾离子、钠离子、氯离子、钙离子和肌酐与PMI相关性较弱（P ＞0.05）。结论 大鼠死后骨骼肌浸渍液中尿酸、尿素氮、无机磷等化学成分含量变化是骨骼肌EC变化的分子基础，有望通过多指标联用提高EC推断PMI的准确性。
关键词： 法医病理学；骨骼肌；电导率；死亡时间推断；大鼠
死亡时间（postmortem interval，PMI）推断一直是法医病理学研究的热点与难点问题。根据尸体温度下降的规律推断PMI是法医工作中最常用的方法，该方法在死后12h以内效果最佳，24h以后意义较小[1]。而根据晚期尸体现象的变化推断PMI所得结果误差较大。近年来，法医学者对PMI推断的研究方法也越来越多[2-3]。由于尸体腐败极其复杂，且研究条件具有局限性，寻找准确、快速、实用的PMI推断方法，始终是这一研究领域的重要任务。
前期研究结果[4]发现，大鼠死后骨骼肌电导率（electrical conductivity，EC）与晚期PMI显著相关，提示EC用于推断PMI方面的良好前景。从EC形成机制的角度来说，是由溶液中多种带电离子的导电作用综合而成[5-6]。因此，本研究将测定骨骼肌组织中常见的水溶性化学物质的含量，探究骨骼肌浸渍液的EC及其生化指标的变化规律。
1 材料与方法
1.1 实验动物的分组、处理及保存
健康SD大鼠40只（由河南科技大学动物实验中心提供并通过动物伦理委员会批准），雄性，体质量（300± 20）g，采用颈椎脱位的方法将其全部处死后随机分成8组［死后即刻（0d）、1d、2d、3d、4d、5d、6d和7d］，每组5只，保存于25℃左右的密闭环境中。
在当前广大农民群众收入水平不断提升的前提下，很多农民的体育消费层次也得到了提升。当前党和政府对“三农”问题越来越重视，很多扶持政策已经逐步深入到了农村地区，使农村地区经济水平得到了提升。很多农民群众意识到了身体健康的重要性，也认识到了体育对于精神世界的积极影响。这种思想意识上的转变，对于农村体育事业的发展具有良好的推动作用[3]。
1.2 主要实验仪器
基础型台式电导率仪（FE30K，上海上天精密仪器有限公司），ZY-1280全自动生化分析仪（上海科华生物工程股份有限公司），Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司），Discovery电子天平（美国OHAUS公司），KFR-26GW变频空调（珠海格力有限公司），RC-5 24小时动态温度监测仪（浙江易控电子科技有限公司）。
2.2.1 尿酸、尿素氮
1.3 骨骼肌EC及化学成分的测定
2.9 数字 执行GB/T 15835-1995《关于出版物上数字用法的规定》。公历世纪、年代、年、月、日、时刻和计数、计量均用阿拉伯数字。表示百分数的范围和偏差时，前一个数的百分符号不能省略，如:5% ～95%不要写成5～95%，50.2% ±0.6%不要写成50.2±0.6%。附带尺寸单位的数值相乘，按下列书写为4 cm×3 cm×5 cm，而不写成4×3×5 cm。
1.4 数据统计与分析
在穿越高铁桥梁桩基期间，建立足够的土仓压力平衡刀盘前端水土压力，以保证掌子面稳定，利用5个土仓压力传感器数据综合控制土压，上部土压控制在0.17MPa；将刀盘转速控制在1.4r/min，以减小掘进对周边土体和桥梁桩基的扰动；掘进推力控制在11 000kN，掘进速度控制在20～30mm/min[2]。
使用SPSS 13.0软件（美国IBM公司）进行统计分析，每组实验数据以
±s 表示，对各个化学指标不同时间点的原始数据作重复测量方差分析。以大鼠骨骼肌浸渍液EC及各生化指标数值为自变量（x ），PMI为因变量（y ），分别建立PMI随各指标变化的一次、二次、三次回归方程，以校准R 2值最高者为最佳拟合方程。检验水准α =0.05。
2.2.2 无机磷、镁离子
2 结 果
2.1 骨骼肌浸渍液EC与PMI的关系
表1显示：大鼠死后7d内，其骨骼肌EC值随PMI的延长而逐渐增大，其中0～1d，EC增长不明显，处于平台期；2～7 d，其EC值迅速增大，处于快速增长期。对不同时间点的EC值作重复测量方差分析并建立EC（x 1）与PMI（y ）的二次回归方程：
分别于死后即刻（0d）、1d、2d、3d、4d、5d、6d和7d，每只大鼠提取5g双下肢骨骼肌，置于研钵中并用剪刀剪碎、研磨，将骨骼肌组织与超纯水按照一定的比例混匀制成质量浓度为0.1 g/mL的匀浆浸渍液[7]。在研磨过程中，不间断地测定EC值，直到EC值达到最大不再增长时，即为本次研磨的终点。随后将浸渍液进行过滤，用基础型台式电导率仪测量滤液EC值并记录（电导率仪温度补偿系数设定为α =2%/℃）。所有上述滤液样本均使用ZY-1280全自动生化分析仪测定其钾离子、钠离子、氯离子、钙离子、镁离子、无机磷、尿酸、尿素氮、肌酐9种化学物质含量。
表1 各组骨骼肌电导率（n =5，
2.2 骨骼肌浸渍液化学成分含量与PMI的关系
由县（区）水利普查办召集县级现场复核会，所有县级普查员、普查指导员参加会议，会上由复核小组说明现场复核的程序。
《上海护理》是上海市卫生局主管、上海市护理学会主办的面向国内外公开发行的综合性护理技术类期刊。是中国科技论文统计源期刊(中国科技核心期刊)、中国期刊全文数据库收录期刊、中国学术期刊综合评价数据库来源期刊、中国学术期刊(光盘版)全文收录期刊、万方数据库全文收录期刊和中文科技期刊数据库全文收录期刊;首届《CAJ-CD规范》执行优秀期刊。
表2显示：大鼠死后7d内，其骨骼肌浸渍液中尿酸、尿素氮的含量随PMI的延长而逐渐增多，两种化学物质的含量在1d内均无明显增长，而在2～7d内开始快速上升，其整体变化规律均与EC大致相同，对不同时间点的尿酸、尿素氮的测定值作重复测量方差分析并建立尿酸（x 2）及尿素氮（x 3）与PMI（y ）的二次回归方程：
定义5（访问请求（IR））用户a和用户b是好友，用户b请求访问用户a发布的消息，我们用如下三元组来表示：irba=（b，m，a）。
食品科学在评价肉类新鲜程度及货架期方面有较为成熟的指标，如EC、挥发性盐基氮、菌落总数、丙二醛的含量等[8-9]。在这些指标中，EC的检测具有快速、简便、经济等特点，目前已广泛用于食品卫生等领域。其基本原理为：随着肉制品的腐败变质，其组织内大分子如核酸、蛋白质、脂肪、糖类等在酶和微生物的作用下逐渐降解为低分子导电性物质，因此，其导电小分子越多，EC值越大，肉制品的腐败变质程度越高[10-11]。法医学中死后尸体的变化规律与肉类的腐败变质类似，在腐败菌群及腐败微生物的作用下，尸体组织发生类似降解，随着腐败的进行，导电小分子物质不断积累，其EC值亦会逐步增加。
表2 各组骨骼肌浸渍液生化指标 （n =5，
2.2.3 钾离子、钠离子、氯离子、钙离子、肌酐
对不同时间点各组的钾离子、钙离子及肌酐的测定值作重复测量方差分析，结果显示，钾离子（P =0.922）、钙离子（P =0.086）和肌酐（P =0.152）3种生化指标随PMI的变化差异无统计学意义。钾离子在测定区间0～7 d内其含量始终在一定的区间范围内波动，基本保持稳定；钠离子、氯离子在0～7d内均检测不到其浓度值；钙离子、肌酐虽然在0～7d内均能检测到，但在此测定区间内两种物质的变化差异无统计学意义，与PMI的相关性不佳。
3 讨 论
无机磷的含量随PMI的增加而逐渐增多，镁离子的含量则逐渐下降，但两种化学物质在0～7d内的整体变化幅度均较小。对不同时间点的无机磷、镁离子的测定值作重复测量方差分析并建立无机磷（x 4）及镁离子（x 5）与PMI（y ）的回归方程：
夏志远等[4]的研究结果发现，EC值与晚期PMI显著相关。在此研究成果的基础上，本研究进一步对部分EC相关性的化学成分进行研究，测定了大鼠骨骼肌中钾离子、钠离子、氯离子等9种常见的化学物质的含量，分析单个具体的生化指标随PMI的变化规律，探究EC变化机制的同时通过对多指标的分析提高PMI推断的准确性。本研究选取骨骼肌为研究对象，因其血供较少，且由皮肤包绕，在死后受外界因素影响较小，整体来说较为稳定，是用来研究PMI的最佳选择[12]。选用去离子水与骨骼肌样本混匀可以避免外界离子对EC形成的干扰，达到对EC研究的最佳效果。前期实验结果[4]表明，组织浸渍液温度每增加1℃，其实际测定的EC值增加约2%。因此，我们将电导率仪的温度补偿系数设定为2%，不同温度下所测定的溶液EC值按照2%的补偿系数自动补偿至25℃下的标准值。
本研究测定并研究了包括骨骼肌浸渍液中EC及9种常见的化学成分，实验结果显示：大鼠骨骼肌EC值随PMI的增加而逐渐增高，与PMI的相关性较好，死后1d内EC增长不明显，处于平台期，骨骼肌腐败不明显；1d后随着腐败的发展，EC值开始逐渐增大，进入快速增长期。这与前期实验结果[4]相符合，同时也证明了EC在用于PMI推断方面的稳定性。
随着尸体腐败的进行，蛋白质、核酸等逐渐降解，产生的碱性含氮类物质逐渐增多[13]，尿酸与尿素氮为腐败的主要产物之一。本研究结果显示，0～7 d内大鼠骨骼肌浸渍液中尿酸、尿素氮的含量随PMI的延长而逐渐增多，两种物质的变化规律类似且与PMI的相关性均较好。其中0～1d，两者的含量均无明显上升，处于平台期，说明在1d内大鼠骨骼肌腐败不明显；而1～7d，随着腐败的充分发展，两者的含量随PMI的延长而快速增加，其整体变化趋势与EC保持一致。尿酸及尿素氮的含量变化某种程度上代表蛋白质、核酸等的降解程度，其变化规律不仅可以印证EC的变化机理，同时也可以辅助EC对于PMI的推断。
大鼠死后0～7d内无机磷的含量随PMI的延长而逐渐增多，其原因可能为死后细胞逐步发生降解，细胞基本结构被破坏，其生物膜中的磷被释放出来而导致磷的含量逐渐增多[14]；而镁离子的含量则逐渐降低，其原因可能为死后镁离子与某种化学物质结合成络合物难以分离，因而其含量逐渐降低。无机磷与镁离子两种生化指标与PMI的相关性均较好，但两者的整体变化幅度均较小。在死后的特定时间段内，两者的变化规律仍可以辅助推断EC的变化趋势。
大鼠死后0～7 d，骨骼肌浸渍液中钾离子、钙离子、肌酐的含量均在一定范围内波动，但三种化学物质的整体变化差异无统计学意义，在晚期PMI推断方面意义较小；而钠离子、氯离子两种物质均在仪器最低检测限之下，其原因可能为两者均存在于细胞间质，本研究虽对组织细胞进行破坏，但其胞内钠离子、氯离子的含量较低，导致其离子的总含量仍较低，检测含量仍在标准曲线最低检测限之下，亦不会随PMI的增大浓度逐渐增大，因此，此两者同样不适合用于晚期PMI的推断。虽然钾离子、钠离子、氯离子、钙离子和肌酐5种生化指标与PMI相关性不佳，但其测定结果为后续研究提供了基础数据。
综上所述，本研究通过对大鼠死后不同间隔时间骨骼肌浸渍液中EC及钾离子、钠离子、氯离子等9种化学物质含量的测定，在分子变化的基础上探究了EC随PMI的变化机制，其中尿素氮、尿酸等与PMI的相关性极好，在联合EC推断PMI方面展现出良好的研究价值，为多指标联用推断PMI提供了一定的研究基础。但死后腐败变化极其复杂，多种影响因素（温度、湿度、氧分压等）综合作用下EC的变化规律将是未来的研究方向。
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Relationship between Electrical Conductivity and Chemical Content of Rat Skeletal Muscle Impregnating Solution and Postmortem Interval
ZHENG Zhe1,ZHAI Xian-dun1,XIA Zhi-yuan2,LI Yong-lin1,ZHAO Lin-lin1,LIU Hui-li3,MO Yao-nan1
（1.School of Forensic Medicine,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,Henan Province,China;2.Institute of Evidence Law and Forensic Science,China University of Political Science and Law,Beijing 100088,China;3 Hospital of Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,Henan Province,China ）
Abstract： Objective To study the mechanism of change of the electrical conductivity（EC）of rat skeletal muscle impregnating solution that occurs with the change of postmortem interval（PMI）.Methods Healthy Sprague-Dawley rats were killed and kept at about 25℃.Skeletal muscles were extracted at different PMI——immediate（0 d）,1 d,2 d,3 d,4 d,5 d,6 d,and 7 d,then mixed with deionized water to make impregnating solution with a mass concentration of 0.1 g/mL.The solution’s EC and nine common chemicals in it,such as potassium ion,calcium ion,and chloride ion,were determined.Results EC increased gradually with the extending of PMI（P =0.024） during the 7 days after the rats’death.The content of uric acid（P =0.032）,urea nitrogen（P =0.013） and phosphorus（P =0.022） also increased during the extension.However,the content of magnesium ions decreased with extending of PMI（P =0.047）.The correlation between potassium ion,sodium ion,chlorine ion,calcium ion,creatinine and PMI were weak（P ＞0.05）.Conclusion The molecular basis of skeletal muscle EC change in rats after their death is the changes of uric acid,urea nitrogen,inorganic phosphorus and other chemical components.Furthermore,combine use of various indicators can improve the accuracy of the EC method to infer PMI.
Keywords： forensic pathology;skeletal muscle;electrical conductivity;estimation of postmortem interval;rats
中图分类号： DF795.1
文献标志码： A
doi： 10.12116/j.issn.1004-5619.2019.05.011
文章编号： 1004-5619（2019）05-0572-04
基金项目： 河南省基础与前沿课题资助项目（112300410082）
作者简介： 郑哲（1991—），男，硕士研究生，主要从事法医病理学研究；E-mail：forensiczheng@sina.com
通信作者： 莫耀南，男，教授，硕士研究生导师，主要从事法医病理学和法医临床学研究；E-maill：forensic@haust.edu.cn
（收稿日期： 2017-05-18）
（本文编辑：邹冬华）
标签：法医病理学论文; 骨骼肌论文; 电导率论文; 死亡时间推断论文; 大鼠论文; 河南科技大学法医学院论文; 中国政法大学证据科学研究院论文; 河南科技大学医院论文;