张子理[1]2002年在《益气健脾中药小肠隐窝干细胞分子药理研究》文中研究表明研究背景和目的 粘膜损伤是十二指肠炎、Crohn病、溃疡性结肠炎等肠道疾病的主要病理改变。脾气虚弱证是这些疾病中较常见的证型之一。益气健脾是中医治疗脾气虚弱证的根本法则。党参、黄芪、白术、甘草是常用的益气健脾中药，由其组成的方剂如四君子汤和补中益气汤等在临床上治疗慢性胃炎、消化性溃疡、克隆氏病和慢性结肠炎等胃肠道疾病具有较明确的疗效。药理学研究也证实，它们对各种原因引起的胃肠粘膜损伤具有防治作用。 目前有关益气健脾方药胃肠粘膜修复的细胞分子生物学机理及其作用的物质基础还未阐明，现有的文献多为益气健脾中药对胃粘膜和结肠粘膜保护的研究方面，而对小肠粘膜作用的研究尚为空白。我们认为益气健脾方药小肠粘膜修复作用可能与其影响小肠隐窝细胞增殖、分化和移行的调控有关。隐窝细胞是位于小肠腺体隐窝区内的原位定向干细胞，具有未分化特性和增殖潜能，在粘膜损伤的情况下，隐窝细胞加速增殖，并转变成为分化细胞，快速移行到上皮表面，覆盖损伤粘膜，以维持小肠粘膜的完整性。小肠隐窝细胞增殖、分化和移行在粘膜修复过程中起着关键作用，其调节机制非常复杂，已知鸟氨酸脱羧酶(ODC)及其催化产物多胺参与了多种肽类物质如胃肠激素、原癌基因、生长因子相关基因和细胞因子等的表达，从而促进隐窝细胞增殖、分化和移行，在小肠粘膜修复过程中发挥重要作用。 小肠隐窝细胞株(IEC-6)是Quaroni等从大鼠小肠隐窝细胞分离出来并经体外培养传代而建立的。在组织学和免疫学方面与增殖性隐窝细胞无明显差别，具有未分化特性，在合适条件下，能分化为成熟的肠细胞。IEC-6的建立对于研究小肠粘膜及上皮细胞的生理、病理和药物作用等具有重要意义，为研究细胞增殖和移行提供了合适的体外模型。自建株以来被国外学者广泛运用于小肠粘膜修复的细胞和分子机理的研究。 根据以上研究背景，提出如下工作假说：益气健脾类中药粘膜修复作用的可能机制是通过影响小肠隐窝细胞ODC基因转录、蛋白表达及其活性，进而影响细胞内多胺的生物合成，促进隐窝细胞的增殖、分化和移行而实现的。围绕这一假设，本项目选择IEC-6作为实验对象，以益气健脾代表药物党参、黄芪、白术、甘草的有效组分对IEC-6细胞增殖、分化和移行，以及对细胞内ODC和多胺的作 张子理：益气健脾中药小肠隐窝干细胞分子药理研究用为指标进行活性追踪，确定单味药的有效部位和有效成分，并在明确有效成分的基础上进行适当的化学配伍，观察其对小肠粘膜修复的关键细胞酶即ODC基因转录、ODC蛋白表达和 ODC活性，以及对多胺合成的影响，归纳出益气健脾中药中与小肠粘膜修复相关的主要有效组分及其组合规律，明确其作用特点和物质基础，阐明益气健脾中药对肠粘膜修复作用的分子生物学机制，同时为益气健脾药物治疗疾病提供现代药理学依据，对“益气健脾”的科学内涵有所认识。研究方法1 细胞培养 IEC6细胞（ 3代）到货后立即复苏。细胞在3 7 oC水浴中迅速解冻，70％酒精消毒，转入含扣·L‘胎牛血清，10mg·L‘胰岛素和 50mp·L‘庆大霉素的DMEM培养液（cDmM）中，在900空气loCO。的潮湿环境中，37℃条件下培养。5天传代 1次，每周换液 3次。第 18－23代细胞用于实验。二 WC－6细胞药理实验技术方法的建立 通过观察细胞接种密度和培养时间对IEC6细胞增殖的影响，以及胃泌素和DFMO对 hC七细胞增殖、分化、移行及 ODC和腐胺含量的作用，建立 IEC6细胞药理实验方法。3 益气健脾中药对WC．6细胞药理作用筛选3．1 细胞增殖活性的检测：噬哩蓝比色（MTT）法 iC－6细胞以每孔 IX 10’／200pL的密度接种于 96了培养板，24h后加人实验药物，空白组加等量 D皿S，每组设 3个复孔。加药后 24h，加入 sg·L” MTT溶液20pL，继续孵育 4h，每孔吸去上清 120pL，加入 2009·LJ SDS溶液 120PL，振荡15min，室温过夜，次日用酶标仪检测570urn处的光吸收值（OD人计算细胞增殖率。 空白组OD一实验组OD 细胞增殖率一门—一）XI 00％ 空白组OD3．2 IEC乃细胞分化的观察 6孔培养板每孔加 1滴cDNffiM，放置盖玻片使其与培养板底部粘贴牢固，以让细胞爬上盖玻片。接种阻C币细胞，密度为每孔ZX m‘o000pL，培养24h，加入实验药物，空白组加等量 DIBS，每组设 3个复孔。24h后取出盖玻片，100ml·L”‘福尔马林固定20ndn，HE染色，显微镜观察细胞分化的形态特征。3．3 IEC币细胞移行的观察 IEC6细胞以每孔 2 X106／2000pL的密度接种于 6孔培养板，接种后第 72h， 2 广州中医药大学2002届博士学位论文用18mm长的单面刀片轻刮单细胞层，产生约18minXS～10mm的损伤区，立即更换培养液，并加入实验药物，空白组加等量 DPB S，每组设 3个复孔。加药后 24，48和 72h倒置显微镜下放大
温鹏[2]2012年在《甘草和党参提取物对IEC-6细胞迁移及多胺影响的研究》文中提出研究背景脾虚证是胃肠道疾病的主要证型,胃肠黏膜保护是益气健脾中药的主要作用机理之一。胃肠黏膜保护是中医“脾”功能的重要内容,胃肠粘膜损伤后的修复是益气健脾中药的重要物质基础。胃肠黏膜损伤后上皮有自身修复的能力,一般最先产生的是细胞迁移,所以细胞迁移与否,是否从非损伤部位迁移至损伤部位是粘膜是否修复的关键一步。而在胃肠粘膜保护与修复的过程中,多胺及其介导的钾通道激活信号通路起重要作用。多胺增加则增强了K+通道蛋白的表达,K+外流,导致膜的超极化,促进了细胞迁移,反之消除多胺则抑制了细胞迁移。研究目的通过观察益气健脾中药甘草、党参对IEC-6(小肠上皮细胞)迁移、多胺含量及4-AP负荷下细胞迁移的影响,探讨甘草、党参胃肠黏膜损伤修复的作用机理。研究方法利用实验室已经建立的小肠上皮细胞(IEC-6)迁移药理实验模型,对受试药及促进细胞迁移工具药精脒在细胞迁移上的药效进行观察,以确定是否受试药有效。并筛选受试药的有效部位。用多胺的特异性阻滞剂DFMO、钾离子的阻滞剂4-AP来抑制细胞的迁移,再加入受试药,用来考察受试药修复胃肠粘膜损伤的作用机理。用柱前衍生高效液相色谱法检测细胞迁移过程细胞内多胺(精脒)含量。研究结果1.甘草糖提取物50、100mg/L,甘草黄酮50、100mg/L,党参糖提取物25、50、100mg/L,党参黄酮50、100mg/L,对IEC-6细胞的迁移有促进作用,而甘草糖提取物25mg/L、甘草黄酮25mg/L,甘草皂苷25、50、100mg/L,党参皂苷25、50、100mg/L对IEC-6细胞的迁移并没有作用。2.甘草糖提取物50、100、200mg/L,甘草黄酮100、200mg/L,党参糖提取物50、100、200mg/L,党参黄酮50、100、200mg/L对DFMO负荷下所致IEC-6细胞迁移的抑制有逆转作用。3.细胞给药12小时后,甘草糖提取物50、100mg/L,甘草黄酮50、100mg/L党参糖提取物100mg/L,党参黄酮100mg/L能明显提高多胺含量,细胞给药24小时后,甘草糖提取物50、100mg/L,甘草黄酮100mg/L能明显提高多胺含量。4.甘草糖提取物50、100、200mg/L,党参糖提取物50、100、200mg/L,甘草黄酮50、100、200mg/L,党参黄酮50、100、200mg/L对钾离子通道抑制剂4-AP负荷下所致的IEC-6细胞迁移抑制有逆转作用。研究结论益气健脾中药甘草和党参胃肠粘膜损伤的修复是其甘草、党参糖提取物,甘草、党参黄酮部位在起作用,并且此作用与促进损伤后肠上皮细胞的迁移有关,作用的机理可能是通过促进粘膜损伤后多胺的生成及促进了钾离子外流,进而促进细胞迁移。
贺毅[3]2010年在《甘草通过RNA结合蛋白HuR对肠上皮细胞的p21、p53mRNA转录后调节研究》文中研究表明背景保护小肠粘膜屏障对防止肠内细菌及内毒素的移位具有非常重要的意义,小肠粘膜屏障完整性的维持有赖于小肠隐窝干细胞的增殖、分化、移行、粘附等共同作用,在病理性损伤下,小肠隐窝干细胞的快速增殖对粘膜损伤的修复起到了重要作用。现代研究发现健脾益气类中药能够通过调节肠内细胞的增殖能力对脾虚状态下的肠粘膜的损伤起到修复作用。甘草具有健脾益气的功效,同时甘草对以粘膜损伤为病理特征的疾病有显着的治疗作用如消化性溃疡病等。但目前有关甘草对小肠上皮细胞保护作用的细胞和分子水平药理研究的报道甚少。国外研究中常采用大鼠小肠隐窝干细胞IEC-6和DFMO诱导的生长抑制的IEC-6病理细胞模型为载体研究小肠上皮细胞增殖、移行、粘附、分化等功能。在健脾中药对胃肠上皮保护的机制研究中,小肠隐窝干细胞被认为是健脾益气中药的主要药理作用靶点之一,并采用IEC-6细胞模型进行了相关的药理研究,基于MTT法的初步研究发现甘草对正常IEC-6细胞有促进增殖的作用,但对其中潜在的分子机制并未研究,对病理状态下肠上皮细胞的药效作用也未涉及。国外通过DFMO诱导的生长抑制的IEC-6模型细胞发现了许多与肠上皮细胞细胞增殖相关的基因,这些基因表达受转录后水平的调控,即RNA结合蛋白HuR与其中的某些基因mRNA非编码区的AU富集元件(AU-rich elements, AREs)的相互作用使这些mRNA的稳定性受到影响,从而最终调节这些基因终产物——蛋白的表达及其生物学效应。预实验研究初步发现甘草及其活性成分之一甘草酸对IEC-6细胞内的HuR有调节的作用,因此本研究将更深入的研究甘草如何通过RNA结合蛋白HuR对肠上皮细胞p21、p53的mRNA进行转录后调节,明确HuR是甘草促进IEC-6细胞增殖作用的分子药靶之一。目的1.研究甘草对正常IEC-6细胞和DFMO模型细胞增殖的调节作用。2.研究与甘草调节IEC-6细胞增殖相关的基因及其表达。3.研究甘草在调控相关基因表达中可能与HuR有关的转录后调节机制。方法1.细胞模型和用药以正常IEC-6细胞作为生理性细胞模型,DFMO模型细胞作为病理性细胞模型。实验用药采用的甘草为甘草颗粒(商品化的甘草水提物),甘草成分采用的是2005版《中国药典》中规定的甘草两个主要指标成分甘草酸和甘草苷。2.研究甘草、甘草酸、甘草苷对IEC-6细胞增殖的调节作用和药物的有效剂量采用基于流式细胞术的细胞计数法、DAPI嵌染核酸的细胞周期检测以及CFSE标记细胞检测细胞分裂速度叁种方法研究甘草颗粒对正常IEC-6细胞和DFMO模型细胞的增殖的影响并确定有效的剂量范围。采用MTT法研究甘草酸对两种模型细胞的增殖的调节作用；采用流式细胞术的细胞计数法研究甘草苷对两种模型细胞增殖的影响。3.研究甘草对IEC-6细胞促增殖作用相关的靶基因表达的影响利用荧光定量PCR技术和western blot蛋白免疫印迹技术,分别对甘草调节IEC-6细胞增殖、并且与细胞周期相关的基因的mRNA水平和蛋白水平进行检测。4.研究甘草通过HuR调控相关基因mRNA稳定性的转录后调节机制首先通过放线菌素D抑制转录,并结合PCR技术研究甘草对相关mRNA稳定性的影响,以证明甘草通过转录后调节途径调控基因表达的可能性；其次以western blot技术分别检测HuR在胞浆、胞核的水平,研究mRNA稳定性的改变和RNA结合蛋白HuR的相关性；接着重点研究甘草对相关mRNA和HuR的共同调节是否通过mRNA和HuR的相互作用产生,分别以mRNP免疫沉淀技术研究细胞内源性HuR-mRNP复合物中目标mRNA的含量以明确甘草对HuR和靶mRNA结合的影响、以biotin-pull down技术研究相关mRNA和HuR的相互作用是否是通过HuR对mRNA非编码区AREs识别产生、以基因重组和荧光素酶报告基因检测技术验证甘草是否是通过相关mRNA的AREs片段对最终的基因表达产生影响。结果1.甘草对DFMO诱导的生长抑制的IEC-6细胞模型具有促进增殖的作用甘草对正常的IEC-6细胞并无促进增殖的作用；而对DFMO模型细胞的生长抑制的状态却有逆转的作用,且该作用与胞周期的影响有关；甘草酸和甘草苷虽为甘草的主要指标成分,但本实验中并未发现两者对于这两种细胞模型的增殖有和甘草颗粒一致的影响。2.甘草可调控DFMO模型细胞p21、p53基因的mRNA和蛋白表达DFMO模型细胞生长受抑的同时伴随p2、p53mRNA和蛋白水平的表达相对增加,但在添加甘草后得以一定程度的逆转,并且在一定范围内具有剂量依赖性。提示p2l和p53可能是本实验条件下甘草药理作用的靶基因。3.甘草通过RNA结合蛋白HuR从转录后水平调控p21和p53mRNA的稳定性甘草对DFMO模型细胞p21和p53 mRNA水平的下调可通过降低p21和p53mRNA的稳定性实现,同时DFMO引起的HuR向胞浆的外移可被甘草逆转。利用mRNP免疫沉淀技术,检测到甘草处理DFMO模型细胞后内源性HuR-mRNP复合物中的p21和p53mRNA含量,相对DFMO模型细胞减少,提示甘草减少了HuR与p21mRNA和p53mRNA的结合以及HuR携带mRNA向胞浆的转移,从而降低了p21和p53mRNA在胞浆内的稳定表达。Biotin-pull down技术检测的结果提示p21mRNA和HuR的结合可通过p21mRNA的3’-UTR内的AREs和HuR特异性的识别和结合实现；通过基因重组和荧光素酶报告基因技术验证了甘草能通过p21mRNA的3’-UTR内的AREs片段调控相应基因表达的水平。结论甘草对DFMO诱导的生长抑制的IEC-6细胞具有促进增殖的作用,该作用可以通过HuR介导的调节p21和p53mRNA稳定性的转录后调控机制实现。本课题通过体外实验为甘草在病理状态下对肠上皮细胞的保护作用提供了实验依据,证实了HuR作为甘草的分子药靶之一在转录后水平调控基因表达的作用。
郑芳[4]2012年在《白术与甘草配伍对IEC-6细胞增殖及p21、p53基因表达的影响》文中研究指明研究背景白术为常用健脾中药之一,具有健脾益气,燥湿利水,止汗安胎之功效,可用于脾虚食少,腹胀泄泻,痰饮眩悸、水肿、自汗、胎动不安等病证的治疗。临床以白术为主组成的方剂较多用于胃肠疾病的治疗。近代临床和药理研究均表明白术具有明显的胃肠黏膜保护作用,其有效提取部位能促进小肠上皮细胞的增殖、分化和迁移。同样作为常用健脾中药的甘草,具有健脾益气,清热解毒,祛痰止咳,缓急止痛,调和药性等功效。据研究,甘草对多种以粘膜损伤为特征的疾病和病理状态具有治疗作用。在我们实验室的前期研究工作中发现甘草可通过促进DFMO诱导的生长抑制模型的IEC-6细胞的增殖,对肠粘膜上皮细胞起保护作用,且该研究显示甘草促增殖作用与其在转录后水平下调p53、p21mRNA及其蛋白的表达有关。为此我们分别通过研究白术对正常IEC-6细胞和DFMO模型IEC-6细胞的增殖和p53、p21基因表达的影响,探讨同样作为常用健脾益气药的白术是否可通过与甘草相同的调控途径对肠上皮细胞的增殖产生影响。另外有研究表示白术多糖对肠上皮细胞的增殖具有抑制作用,且临床上常用健脾益气方中,甘草和白术常一起用于胃肠疾病的治疗,因此我们同时考察白术与甘草配伍使用对DFMO模型IEC-6细胞增殖和p53、p21基因表达的作用,以研究中药配伍对药物作用的影响。目的：1.研究白术对正常IEC-6细胞和DFMO诱导生长抑制模型IEC-6细胞增殖的作用；2.研究白术与甘草配伍对DFMO病理模型IEC-6细胞增殖的影响；3.研究白术及其与甘草配伍对IEC-6细胞p21、p53基因表达水平的影响；方法：1.细胞模型和用药以正常IEC-6细胞作为生理性细胞模型,DFMO诱导的生长抑制模型IEC-6细胞作为病理性细胞模型。实验所用白术和甘草均为中药配方颗粒,购买于江阴天江药业有限公司,批号分别为：1008144和1102021。2.白术对细胞增殖作用的检测采用MTT法检测细胞数量和基于流式细胞术的CFSE标记检测细胞分裂速度以及PI染色检测细胞周期分布叁种方法,研究白术颗粒及其与甘草颗粒配伍对正常IEC-6细胞和DFMO模型IEC-6细胞增殖的影响并确定有效作用时间和剂量范围。3.白术对IEC-6细胞p53、p21mRNA和蛋白表达影响的检测利用qRT-PCR技术和Western Blot蛋白免疫印迹技术,分别检测白术颗粒及其与甘草配伍对不同模型IEC-6细胞p53、p21mRNA和蛋白表达水平的影响。结果：1.低剂量白术颗粒在加药处理24h和48h内对IEC-6细胞的增殖无明显影响,而高剂量白术颗粒在作用细胞48h后对正常IEC-6细胞的增殖具有显着的抑制作用,且该抑制作用伴随p21mRNA和蛋白表达水平的增加,p53mRNA和蛋白表达水平的降低；2.本实验选用剂量范围内白术颗粒对DFMO诱导生长抑制的IEC-6细胞的增殖无显着性影响,但实验所用白术颗粒可上调DFMO模型IEC-6细胞内p53、p21mRNA和蛋白的表达水平；3.白术颗粒与甘草颗粒不同比例配伍均能下调单独白术颗粒作用对DFMO模型IEC-6细胞p53、P21mRNA和蛋白表达的影响,促进IEC-6细胞的增殖。结论：本实验所选用剂量白术颗粒对正常IEC-6细胞具有显着的抑制增殖的作用,进一步的研究表明该作用与白术颗粒上调周期抑制蛋白p21的表达水平有关,且其对p21mRNA及蛋白表达的调控为非p53依赖途径；而对于DFMO模型IEC-6细胞,甘草颗粒与白术颗粒配伍使用,可显着下调单独白术颗粒作用所诱导的p53、p21mRNA和蛋白的表达,表明在此细胞模型中配伍用药甘草能调和白术的药性,降低其对p53、p2l基因的影响。
李秋霞[5]2006年在《白术黄芪方、白术AMPS-Ⅱ、黄芪注射液对Caco-2单细胞层屏障影响的实验研究》文中研究说明研究背景 祖国医学认为,脾胃为气血生化之源,后天之本。脾的功能旺盛才能保证机体健康、抵御外邪侵袭。如《灵枢·五癃津液别》篇云:“脾为之卫”。肠道拥有与外界相接触的最广大面积,许多毒素和致病因子如细胞因子等可经破坏的肠道屏障进入血液循环,不仅引起局部损害,亦可导致全身疾病。所以研究益气健脾方药对肠道屏障的作用具有重要的意义。 肠道屏障包括机械屏障、生物屏障、化学屏障及免疫屏障。肠道机械屏障主要由肠粘膜上皮细胞、细胞间紧密连接等构成。肠上皮细胞包括多种生物功能不同的细胞,是肠道机械屏障的主要组织结构基础。 肠上皮细胞之间一种特殊的膜性结构——紧密连接(tight junction),位于基底外侧细胞与细胞间的最上端,对来自于肠道的众多毒素和免疫原起着首当其冲的抵御作用,它是维持肠粘膜通透性(mucosa permeability)的重要组织成分,生理情况下只能允许2μm大小的离子或小分子物质通过,以沟通机体内、外环境,紧密连接调节着离子、水分子、大分子甚至癌细胞的通路,因此与水肿、腹泻、血性转移等密切相关;任何原因使紧密连接成分发生改变,或直接损伤了紧密连接,都会造成肠粘膜对肠内容物的通透性增高,细菌或毒素等得以入侵体内,激起一系列病理生理改变。 益气健脾中药是治疗脾虚证的主要药物,由党参、白术、黄芪、甘草等为主要药物组成的四君子汤、补中益气汤、黄芪建中汤、参苓白术散、白术黄芪汤等是治疗脾虚证的经典方剂。益气健脾中药可通过影响肠道机械屏障、化学屏障、免疫屏障、生物屏障而发生作用。具体体现在促进肠上皮细胞修复、清除毒素和减少致炎因子、减少细菌移位和调节肠道菌群失调、促进肠道分泌SIgA、改善肠道血循环等方面。 现代药理研究认为益气健脾方药能增强和调节消化系统的功能,对胃肠粘膜有增强屏障功能,有促进粘膜防护因子分泌等作用。益气健脾方药主要用于治疗有脾虚表现的病证,而脾虚证反映了以消化系统功能障碍为主的全身性综合病理状态,在脾虚患者或脾虚动物的肠上皮细胞及上皮细胞之间的细胞连接可出现异常,因此益气健脾中药对脾虚证的作用机理之一可能是对胃肠粘膜的保护或修复。 本实验室2000年引进了大鼠小肠隐窝干细胞(intestinal epithelial cell line,IEC-6),将其用于胃肠粘膜修复药物作用的研究。研究结果发现黄芪注射液(主要含黄芪皂苷)可促进IEC-6细胞分化和迁移,亦可促进IEC-6细胞白介素6(IL-6)的分泌;白术AMPS-Ⅱ(主要含白术糖复合物)具有促进IEC-6细胞分化的作用,可明显改变IEC-6细胞的形态,其影响程度与药物作用的剂量和时间呈正相关,并可通过激活鸟氨酸脱羧酶促进IEC-6细胞移行,可刺激IEC-6细胞的绒毛蛋白mRNA表
于向阳[6]2009年在《肠梗阻导致肠功能障碍的中西医结合实验研究Ⅱ》文中研究说明第一部分肠梗阻导致肠功能障碍中肠上皮、肠免疫屏障及微生态的时相性研究实验一家兔可复性肠梗阻造模方式及材料的改良目的：在前期实验建立的家兔机械性肠梗阻的基础上进行梗阻方式和材料的改良，使模型操作更简便、更经济、效果更稳定。方法：改用“肠管外压迫”的方式，将输液器部件改造成体外牵拉式锁扣，在末段回肠肠系膜无血管区戳孔，套住肠管，引出切口旁腹壁外。手术1～2天后由体外牵拉锁扣固定，造成该部位肠管的闭塞梗阻。解除梗阻时只需剪断锁扣后抽出装置。同时对体外水囊充注式梗阻装置、塑封钢缆圈套器等方法也进行了尝试。结果：该方法在造成梗阻的安全性、确切性等方面较原模型更优，避免了原方法所存在的腹腔感染、肠粘连、肠套迭以及肠穿孔等意外情况，并且不存在装置脱落等不稳定因素。结论：在获得更确切稳定的梗阻效果的基础上，改良后的方法创伤更小、造模周期更短，操作简单且材料经济，是较为理想的可复性机械性完全性肠梗阻模型。实验二肠梗阻对小肠上皮细胞的损害及其增殖修复能力的影响目的：观察急性机械性低位小肠梗阻对于小肠上皮损害程度以及其自身再增殖、修复能力的影响。方法：选用健康大耳白兔，随机分为正常对照组(Norm)、假手术组(Sham)、梗阻1h组(H_1)、梗阻6h组(H_6)、梗阻12h组(H_(12))、梗阻24h组(H_(24))、梗阻48h组(H_(48))、梗阻72h组(H_(72))，每组6只。分别对各组动物血清瓜氨酸水平、生化、小肠组织鸟氨酸脱羧酶活性，以及小肠上皮内杯状细胞形态、数量变化进行检测和观察。结果：肠梗阻后早期肠上皮细胞存在保护性的增殖加速过程，表现为ODC活性在梗阻后6h开始增高(p＜0．001)，随着梗阻未解除，损害因素不断加重，ODC活性在梗阻24h下降，至72h甚至低于正常水平。对小肠上皮形态学观察中发现杯状细胞增多趋势，且形态发生时相性改变。以上指标在小肠不同部位发生变化的时相和程度并不一致，回肠较之空肠变化更显着。至梗阻48h-72h阶段，血清瓜氨酸水平低于正常水平(p＜0．05)。另外在对生化指标的检测中发现CK发生显着变化较早，相对其它指标较为敏感(24h vs 48h-72h)。结论：①肠梗阻发生后的早期就已经存在上皮的修复，表现为小肠组织ODC活性增高；②另外杯状细胞可能参与了小肠粘膜的修复，并且可能是上皮修复的关键细胞；③在梗阻后期随着上皮增殖活性的降低，血清瓜氨酸水平这一间接指标也随之降低，说明其对判断小肠功能障碍严重程度具有一定参考价值；④在肠梗阻发生后，CK相对其他生化指标可能对肠实质性损害更具有敏感的诊断提示意义。实验叁小肠梗阻后肠腔内环境及微生态变化目的：观察急性机械性低位小肠梗阻发生后肠道内环境及微生态的改变，以了解肠梗阻发生后肠道自稳态破坏与肠屏障破坏的时相性关系。方法：选用健康大耳白兔，随机分为正常对照组(Norm)、假手术组(Sham)、梗阻1h组(H_1)、梗阻6h组(H_6)、梗阻12h组(H_(12))、梗阻24h组(H_(24))、梗阻48h组(H_(48))、梗阻72h组(H_(72))，每组6只。观察梗阻后每一时段小肠内PH、含水量及采用平板计数法了解肠杆菌科与双歧杆菌菌群数量变化。另外在不同时段进行血内毒素水平、各脏器细菌移位阳性率等进行观察。结果：结果显示肠梗阻发生后末段回肠的PH值逐渐下降，肠内容物含水量进行性增加，两者均在梗阻12h-24h阶段出现显着变化(p＜0．05，p＜0．01)。在对该部位肠杆菌科和双歧杆菌的培养发现，在梗阻12h-24h阶段二者出现比例倒置，肠杆菌科成为优势菌种。另外，对脏器组织的培养和对血浆内毒素检测发现，同样也是在12h-24h阶段二者出现显着性变化。结论：肠梗阻后肠功能障碍是对方面因素的综合结果，其中肠道自稳态的破坏为之后的细菌大量增殖、细菌和内毒素移位提供了环境基础。肠梗阻较早期的12h-24h阶段可能是肠内环境、微生态发生剧烈转变的阶段，同时也可能是细菌和内毒素移位的开始。而此时肠道机械屏障往往并没有出现广泛破坏，这更说明机械屏障、生物屏障、化学屏障的破坏都是肠功能障碍的危险因素。实验四肠梗阻对肠上皮Claudin1 mRNA表达的影响目的：了解急性肠梗阻发生后肠道上皮细胞间紧密连接破坏的时相性特点。方法：选用健康大耳白兔，随机分为正常对照组(Norm)、假手术组(Sham)、梗阻1h组(H_1)、梗阻6h组(H_6)、梗阻12h组(H_(12))、梗阻24h组(H_(24))、梗阻48h组(H_(48))、梗阻72h组(H_(72))，每组6只。利用实时荧光定量RT-PCR技术，对动物末段小肠上皮的紧密连接相关蛋白Claudin_1的mRNA表达情况进行相对定量分析。结果：本实验显示，梗阻发生后6h已经发现Claudin_1 mRNA表达已经显着减少至正常表达量的一半左右(p＜0．05)，12h为18％(p＜0．01)，24h为11％，48h-72h阶段表达量很低。结论：肠梗阻发生后早期(6h)已经发生机械屏障的破坏，表现为紧密连接蛋白上游基因的低表达，随着梗阻进展，这种低表达更加显着，至梗阻48h-72h阶段，这一基因的表达水平已经很低。提示这一阶段肠上皮的完整性已经完全失去，肠道机械屏障破坏严重。实验五肠梗阻家兔小肠免疫屏障功能的变化目的：利用肠梗阻模型，观察急性机械性肠梗阻的发生对肠道免疫系统的影响。方法：选用健康大耳白兔，随机分为正常对照组(Norm)、假手术组(Sham)、梗阻1h组(H_1)、梗阻6h组(H_6)、梗阻12h组(H_(12))、梗阻24h组(H_(24))、梗阻48h组(H_(48))、梗阻72h组(H_(72))，每组6只。采用流式细胞术对梗阻近端低位回肠、高位空肠两个不同部位小肠派伊尔淋巴结(PP)的CD3~+、CD4~+、CD8~+淋巴细胞亚群进行分析，利用HE染色切片计数上述两个不同部位IEL和LPL的百分比于梗阻不同阶段的变化。另外ELISA法检测小肠内分泌型免疫球蛋白A(S-IgA)含量。结果：本实验显示肠梗阻发生后12h-24h阶段，动物小肠的PP在数量上和总面积上均增加(p＜0．05)，随着梗阻进展又逐渐减少，至梗阻72h阶段则显着低于正常水平(p＜0．01)。流式细胞术对PP淋巴细胞CD3~+、CD4~+、CD8~+亚群的分析结果显示，肠梗阻解除后PP内CD3+亚群为增多趋势，低位回肠Sham组为29．44±2．54％，12h增加为35．92±2．08％(p＜0．05)，72h增至49．48±6．37％(p＜0．01)；CD4~+亚群同样在12h阶段明显高于Sham组(84．68±2．80％vs 80．5 1±2．22％，p＜0．05)，此后逐渐下降至72h则迅速减少显着低于Sham组(61．62±6．96％，p＜0．01)；CD8~+亚群变化趋势与CD4~+相反，在12h-24h阶段较Sham组下降(8．47±1．41％vs 11．52±1．04％，p＜0．05)，之后逐渐增高至72h达到最高(22．97±4．83％，p＜0．05)；CD4~+／CD8~+比值的变化趋势为早期阶段先增高，24h阶段明显高于Sham组(12．10±2．17 vs 7．97±1．40，p＜0．01)，后期逐渐下降至72h阶段则显着低于Sham组(3．35±1．03，p＜0．01)。上述几项在高位空肠中观察到的结果要明显晚于低位回肠，并且变化不剧烈。通过HE染色对IEL和LPL的百分比计数结果显示，不同部位的IEL百分比随着梗阻时间变化未发现明显差异，而LPL百分比在梗阻6h阶段明显增多，其中空肠部位的较Sham组有统计学差异(p＜0．05)。随着梗阻时间延长，两个部位的LPL百分比均呈下降趋势。肠腔内s-IgA的ELISA结果显示，梗阻发生后其肠内含量增高，24h阶段高于Sham组(p＜0．05)，随后下降至72h的最低水平，与24h水平有差异，但与Sham组间未发现统计学差异。结论：①肠梗阻发生后，小肠PP数量和总面积均增加，这可能与梗阻后受到更多炎性因素刺激有关，另外其内淋巴细胞亚群也出现相应变化，CD3~+呈不断增多趋势，CD4~+亚群比例、CD4~+／CD8~+均在早期增多，而后随着梗阻进展逐渐下降。反之，CD8~+亚群比例早期降低，后期增高，这些都预示着肠道免疫的一过性增强和之后的减弱；②通过对上皮内IEL、固有层LPL占总细胞数量百分比的统计，可以看出，IEL变化存在一定改变，但本实验尚未发现统计学的差异。而LPL百分比特点也是梗阻早期增大，后期下降，这可能是淋巴细胞归巢至固有层这一效应部位增多有关，后期随着淋巴细胞凋亡增多和其它大量炎性细胞浸润而至其比例下降；③s-IgA的量的变化进一步印证了上述现象，在早期肠腔内增多，至后期逐渐低于正常水平；④肠道免疫系统的激活是较早出现的，而且肠梗阻引发的肠免疫屏障改变可能存在部位上的差异，回肠更早、更强烈的出现免疫改变。而固有层效应部位上淋巴细胞可能这种差异并不明显，有待印证。第二部分四君子汤对肠梗阻解除后肠功能障碍的调节作用的实验研究实验六四君子汤对肠梗阻解除后小肠上皮修复的调理作用目的：利用可复性机械性完全性肠梗阻模型，观察比较肠梗阻梗阻解除后自然恢复与中药四君子汤对小肠上皮细胞增殖与修复的影响。方法：选用健康大耳白兔，随机分为假手术组(Sham)、梗阻48模型组(m_(48))、自然恢复48h组(S_(48))、中药治疗48h组(T_(48))、自然恢复96h组(S_(96))、中药治疗96h组(T_(96))，每组6只。对动物模型梗阻解除后48h、96h时肠杯状细胞形态学、小肠组织鸟氨酸脱羧酶活性、血清瓜氨酸水平、紧密连接相关蛋白Claudin_1 mRNA表达等分别进行检测和观察。结果：本实验显示，在肠梗阻解除后小肠上皮的杯状细胞数量逐渐减少，48h后已经出现明显差异，96h基本恢复正常中药治疗组较自然恢复组差异更明显。血清瓜氨酸水平逐渐恢复至正常水平，中药组要早于自然恢复组(48h，p＜0．05)，鸟氨酸脱羧酶活性明显增高，尤其是而中药治疗组明显高于自然恢复组(P＜0．05)。另外发现中药四君子汤可以上调Claudin_1 mRNA的表达，高于自然恢复组水平。结论：①中药四君子汤可以促进肠梗阻解除后肠上皮细胞的再增殖和上皮完整性的修复过程，表现为其可以加速肠上皮内杯状细胞对肠上皮的重建的完成进度；②可以提高小肠组织ODC活性，提示四君子汤能提高上皮再生能力；③而上皮再生后的结果体现为血清瓜氨酸水平的提高；④四君子汤可以上调肠上皮紧密连接相关蛋白Claudin_1的上游基因表达，促进肠上皮完整性的修复⑤通过结果说明肠梗阻解除后的肠功能障碍在辨证上存在脾胃虚的情况，邪实已祛，正气受损的实质可能应该包括肠上皮的损害，而四君子汤的作用靶点之一可能是促进肠隐窝干细胞的增殖从而达到上皮完整性的修复。实验七四君子汤对肠梗阻解除后小肠免疫的调理作用目的：利用可复性机械性完全性肠梗阻模型，观察比较肠梗阻解除后自然恢复及中药四君子汤对肠道免疫屏障的影响。方法：选用健康大耳白兔，随机分为假手术组(Sham)、梗阻48模型组(M_(48))、自然恢复48h组(S_(48))、中药治疗48h组(T_(48))、自然恢复96h组(S_(96))、中药治疗96h组(T_(96))，每组6只。通过流式细胞术对动物模型梗阻解除后48h、96h时PP淋巴细胞亚群(CD3~+、CD4~+、CD8~+、CD4~+／CD8~+)进行分析、利用ELISA法对肠道内s-IgA含量进行检测以及通过病理切片对IEL、LPL百分比进行计数。结果：本实验显示，肠梗阻解除后中药干预的T48组、T96组较自然恢复的S48、S96组的PP淋巴细胞CD3+、CD4+、CD8+亚群及CD4+／CD8+比值具有调节作用，使之更快恢复或接近梗阻前水平；在对iIEL、LPL相对数量的观察中，四君子汤干预组的LPL更早的接近正常比例；各处理组s-IgA水平之间未发现统计学差异。结论：肠梗阻解除后小肠的免疫屏障功能紊乱并没有立即恢复，自然恢复48h后CD4+、CD4+／CD8+比值等指标并没有随之恢复，而却较M48组更趋下降，这可能提示肠功能的免疫状态并没有因肠梗阻解除而立即恢复，这可能是肠道内环境紊乱、肠道菌群失调以及肠上皮完整性的破坏不可能马上改善有关。而应用四君子汤可以明显促进小肠在梗阻解除之后存在的免疫屏障功能障碍。表现为，四君子汤干预组较自然恢复组的PP淋巴亚群更快恢复正常，并可能对肠效应部位的淋巴细胞分布或数量具有调节作用。肠梗阻解除后的脾胃功能受损的实质可能涵盖了肠上皮功能低下以及肠免疫系统的紊乱，而四君子汤健脾作用的靶点很可能包括对肠道免疫系统的调理作用。
李茹柳[7]2006年在《白术黄芪方对溃疡性结肠炎及紧密连接相关蛋白影响的实验研究》文中研究表明一、研究背景与目的 脾虚证反映了以消化系统功能障碍为主的全身性综合病理状态,有消化吸收功能障碍、胃肠屏障功能低下等表现。脾虚证主要以益气健脾法治疗,代表药物有党参、白术、黄芪、茯苓、甘草等,以其为主组成的经典方剂有四君子汤、补中益气汤、参苓白术散、黄芪建中汤等。许多研究表明,脾虚患者和脾虚动物存在肠上皮细胞形态和功能的病变,通过益气健脾方药治疗可得到明显改善。表明这类中药有维持肠上皮完整、改善上皮细胞功能和保护肠粘膜等作用。但国内对益气健脾中药肠粘膜修复作用机理的研究不多。 本实验室近年来开展了相关研究,以化学方法提取得到党参、白术、黄芪和甘草的提取部位18个,发现一些提取部位能促进小肠隐窝IEC-6细胞增殖、移行、分化,促进细胞内鸟氨酸脱羧酶(ODC)、绒毛蛋白、转铁蛋白等表达,提高多胺(腐胺)含量等,最后筛选出3个有较强药理活性的提取部位白术AMPS-Ⅱ、黄芪总皂苷、甘草总黄酮,并对其进行了提取工艺研究,各有效组分均达到中药新药有效部位的要求,在动物实验中以均匀设计法得出其最佳配伍比例,设立了由白术AMPS-Ⅱ、黄芪总皂苷、甘草总黄酮组成的白术黄芪方提取物新组方(以下简称白术黄芪方)。组方思路源自金元医家刘完素的白术黄芪汤,其《素问病机气宜保命集·泻痢论》曰:“白术黄芪汤:服前药,痢虽已除,犹宜此药和之。……白术一两,黄芪七钱,甘草叁钱。”按原文所述,白术黄芪汤主要在泻痢已除之后应用,以达调理脾胃、“和之”的目的,类似泻痢恢复期和溃疡性结肠炎缓解期的治疗。其疗效可能与促进肠粘膜修复、保护肠上皮屏障的相关。因此益气健脾中药的作用靶点除了ODC和多胺等机制外,肠上皮细胞连接作为肠粘膜屏障的重要组成部分也可能是其靶点之一。本实验室最近观察了白术黄芪方对细胞紧密连接及其相关蛋白ZO-1的影响,结果表明该方可促进肠上皮Caco-2细胞增殖,增强ZO-1蛋白表达,白术AMPS-Ⅱ和黄芪皂苷可促进肠上皮细胞连接的形成从而促进细胞分化(尚未发表资料)。 在以上工作基础上,本研究根据白术黄芪汤的临床功用,选择肠粘膜损伤性疾病溃疡性结肠炎(属于中医“下痢”范畴)为研究对象,考察白术黄芪方经过药物提取、筛选、组方后的自术黄芪方,新方与原方汤剂比较,其适应症、药效、毒性等情况。研究目的是观察白术黄芪方是否使疗效增加而不引起毒性增加,是否保留其治疗泻痢恢复期脾胃虚弱的功效,是否保持中药配伍组方能增效的特点,其作用机理是否与肠上皮细胞紧密连接及其相关蛋白(选择构成紧密连接的重要蛋白claudin-1、occludin)有关等。研究内容包括建立适用于中医药治疗溃结病程发展特点的动物模型;比较白术黄芪方和白术黄芪汤治疗溃疡性结肠炎的疗效及其毒性;观察白术黄芪方对溃疡性结肠炎不同病变阶段的疗效及其对claudin-1、occludin蛋白的影响,以考察该方益气
涂小华[8]2016年在《四君子汤多糖对IEC-6细胞迁移多胺信号通路钙离子调控影响的研究》文中认为研究背景胃肠黏膜损伤是多种胃肠道疾病的病理基础之一,而胃肠粘膜有自身修复能力,该修复过程包括细胞迁移、细胞增殖、细胞凋亡、粘膜重建等多个环节。早期粘膜损伤快速修复是上皮细胞迁移并覆盖损伤区域的过程,该过程受多种因素调节,如多胺、叁叶草蛋白、生长因子、黏蛋白、前列腺素等。在小肠上皮细胞(IEC-6)的研究表明,多胺信号通路是上皮细胞迁移的重要调控因素；在小肠上皮细胞迁移过程,多胺、钾通道蛋白、细胞膜电位等钙离子(Ca2+)调控的上游指标可增加Ca2+内流驱动力,以提高胞内游离钙离子浓度([Ca2+]cyt)而促进细胞迁移；胞内钙库调节指标如磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)、(1,4,5)-叁磷酸肌醇(IP3),钙通道蛋白如瞬时受体电位通道蛋白-1(TRPC1)等调控了[Caz+]cyt;Ca2+又作用于下游靶点如Rho GTPase、细胞骨架蛋白myosinⅡ等而促进细胞迁移；Ca2+调控是上皮细胞迁移过程多胺信号通路的关键因素。脾虚患者可见胃肠粘膜损伤的病理改变,益气健脾是脾虚证的主要治则,益气健脾代表方剂四君子汤有防治胃肠粘膜损伤的作用。本课题组前期研究表明,益气健脾中药黄芪、白术、党参、甘草的提取物(如糖提取物、黄酮提取物等)可促进IEC-6细胞迁移,作用机制与其影响多胺信号通路有关,多糖组分是益气健脾中药促进细胞迁移的药效成分之一。研究目的观察四君子汤多糖对小肠上皮细胞(IEC-6)迁移多胺信号通路Ca2+调控的影响,探讨益气健脾代表方剂四君子汤促进胃肠粘膜损伤修复的作用机制,为其治疗胃肠粘膜损伤病变的疗效机制研究提供科学依据。研究方法(1)四君子汤多糖提取分离纯化：四君子汤经水提醇沉、sevag法去蛋白、DEAE-52纤维素柱层析,分别得到四君子汤总多糖、粗多糖、纯化多糖；苯酚-硫酸法检测3种多糖样品的多糖含量；HPLC法对四君子汤纯化多糖进行纯度分析。(2)受试药筛选及剂量确定：在IEC-6细胞迁移模型下观察四君子汤总多糖、粗多糖、纯化多糖对细胞迁移的影响,筛选出细胞迁移药效较好的多糖样品为本研究受试药。细胞实验设正常对照组,阳性对照药精脒组(5μmol·L-1),四君子汤多糖40、80、160mg·L-1组(4-AP负荷实验设四君子汤多糖20、40、80 mg·L-1组)；DFMO或4-AP负荷实验设正常对照组,DFMO或4-AP模型组,精脒组和受试药组同时加入DFMO或4-AP。(3)细胞迁移实验：细胞划痕损伤法造细胞迁移模型,相差倒置显微镜观察细胞迁移情况。(4)柱前衍生HPLC法测定细胞内多胺(精脒和精胺)含量。(5)RT-qPCR法检测Kv1.1、PLC-γ1、TRPC1 mRNA表达。(6)Western Blot法检测Kv1.1、PLC-γ1、TRPC1、RhoA、Rac1、Cdc42蛋白表达。(7)流式细胞仪检测细胞膜电位、[Ca2+]cyt。(8)酶联免疫法检测IP3含量。(9)Pulldown assay法检测GTP-RhoA、GTP-Rac1、GTP-Cdc42蛋白表达。(10)免疫荧光法检测myosinⅡ蛋白表达。研究结果(1)四君子汤多糖提取分离纯化及药效追踪结果：①四君子汤总多糖、粗多糖、纯化多糖的得率分别为5.42%、4.19%、2.44%；②四君子汤总多糖、粗多糖、纯化多糖的多糖含量分别为67.9%、72.4%、81.6%。③药效追踪结果提示四君子汤3种多糖样品均能促进细胞迁移；因四君子汤纯化多糖药效最佳,故确定其为本研究后续实验受试药,实验剂量设为20 mg· L-1～160 mg· L-1,有效剂量40 mg·L-1～160 mg·L-1。(2)四君子汤多糖对细胞迁移的影响：能促进细胞迁移,逆转DFMO(多胺合成抑制剂)负荷所致的细胞迁移抑制；提示四君子汤多糖促进细胞迁移的作用与影响多胺有关。(3)四君子汤多糖对细胞迁移多胺信号通路Ca2+调控上游指标的影响：①能提高细胞内多胺(精脒、精胺)含量,可逆转DFMO所致的细胞内多胺(精脒、精胺)含量降低。②能提高钾通道蛋白Kv1.1 mRNA和蛋白表达,可逆转DFMO负荷所致Kvl.1mRNA和蛋白表达抑制；③可逆转4-AP(钾通道蛋白抑制剂)负荷所致的细胞迁移、Kv1.1 mRNA和蛋白表达抑制；④能提高细胞膜电位以增加细胞膜电位超极化,可逆转DFMO所致的细胞膜电位去极化。提示四君子汤多糖可通过提高细胞多胺含量、激活钾通道、增加细胞膜电位超极化,从而提高Ca2+内流驱动力。(4)四君子汤多糖对细胞迁移多胺信号通路Ca2+调控的影响：①能增加细胞内[Ca2+]cyt,可逆转DFMO所致的[Ca2+]cyt降低；②能提高钙通道蛋白TPRC1 mRNA和蛋白表达,能逆转DFMO所致的TPRC1 mRNA和蛋白表达抑制；③能提高胞内钙库动员指标PLC-γ1 mRNA和蛋白表达以及IP3含量,可逆转DFMO所致的PLC-γ1 mRNA和蛋白表达抑制以及IP。含量降低；④若使用无Ca2+培养液以去除细胞外Ca2+,则不但空白对照组出现显着的细胞迁移抑制,且四君子汤多糖促进细胞迁移的作用也明显弱于使用含Ca2+培养液时。提示四君子汤多糖可通过促进Ca2+内流和胞内钙库动员两途径以增加[Ca2+]cyt,又以前者作用更明显。(5)四君子汤多糖对细胞迁移多胺信号通路Ca2+调控下游靶点的影响：①不但能提高Rho GTPase(RhoA、Rac1、Cdc42)总蛋白表达,逆转DFMO负荷所致的RhoA. Rac1、Cdc42总蛋白表达抑制；还能提高Rho GTPase激活形式的GTP-RhoA、GTP-Rac1、 GTP-Cdc42蛋白表达；②能提高细胞骨架myosinⅡ蛋白表达,逆转DFMO所致的myosinⅡ蛋白表达抑制。提示四君子汤多糖可通过作用于Ca2+下游指标如Rho GTPase和myosinⅡ以影响细胞骨架重排而促进细胞迁移。研究结论四君子汤多糖可通过作用于多胺信号通路而促进IEC-6细胞迁移,钙离子调控是其关键指标之一；多糖组分是四君子汤促进小肠上皮细胞迁移的主要药效成分之一；研究结果为探讨四君子汤胃肠粘膜保护机制提供了参考。
宋厚盼[9]2014年在《白术对IEC-6细胞迁移多胺信号通路钙离子调控影响的研究》文中指出研究背景人体的消化道粘膜上皮构成了一道重要的屏障以抵御存在于肠腔内的毒性和免疫原性物质。粘膜上皮屏障完整性的破坏常发生于多种胃肠道病变,如炎症性肠病,腹部疾病,肠道感染以及NSAIDs肠病等。由于粘膜表面上皮具有强大的再生能力,胃肠道粘膜表面屏障的完整性即使在破坏后也能快速地重建。早期的损伤后粘膜修复(上皮整复)主要依靠上皮细胞迁移至损伤区域并重新密封胃肠粘膜的表面损伤,此过程不依赖上皮细胞增殖。上皮整复必须要有细胞内多胺的参与,在模拟上皮整复的体外小肠上皮(IEC-6)细胞模型中,刺激细胞迁移也需要多胺的参与。研究发现,多胺介导信号通路是IEC-6细胞迁移的主要调控因素,其中钙离子是该通路的关键指标。IEC-6细胞是一种非兴奋细胞,在细胞膜上不表达电压门控型钙离子通道,所以细胞内钙离子浓度的提高需依赖于钾离子通道的表达和激活。本研究围绕钙离子上游的钾离子通道表达和下游的调节细胞骨架的Rho GTP酶等的变化探讨白术提取物促进IEC-6细胞迁移的作用机制。祖国医学认为,脾胃为气血生化之源,后天之本。脾的功能旺盛则是保证机体健康及抵御外邪的重要因素。近年来胃肠道粘膜的保护功能日益受到重视。胃肠粘膜排列紧密的上皮细胞和上皮细胞表面粘液层的完整性和连续性构成了胃肠粘膜屏障存在的两个重要解剖学基础。胃肠粘膜损伤是某些中医证型如脾虚证的重要病理基础,胃肠粘膜保护是益气健脾中药的主要作用机理之一。胃肠粘膜保护是中医“脾”功能的重要内容,也是益气健脾中药的重要作用靶点。研究目的观察益气健脾中药白术对小肠上皮细胞迁移过程多胺介导信号通路钙离子调控的影响,探讨白术促进胃肠粘膜损伤修复的作用机制。在分子水平研究益气健脾中药促进粘膜损伤修复的调控机制,为阐述益气健脾中药治疗脾胃病的科学内涵提供依据。研究方法1.采用超声提取法以100%甲醇对白术进行提取,并用高效液相色谱法对白术提取物主要成分进行定性分析。2.在手术刀片划痕法IEC-6细胞迁移模型,以荧光相差倒置显微镜观察细胞迁移情况并拍照,用Ipwin32统计软件统计越过划痕的细胞迁移数。3.采用MTT法和实时细胞分析仪(RTCA)考察白术提取物对IEC-6细胞增殖的影响。4.采用柱前衍生高效液相色谱法检测IEC-6细胞迁移过程多胺(腐胺、精脒和精胺)含量。5.采用流式细胞仪结合荧光染料DiBAC4(3)和Fluo-3/AM分别检测IEC-6细胞迁移过程细胞膜电位(Em)和细胞质游离钙离子浓度([Ca2+]cyt)。6.荧光定量 PCR 法检测 IEC-6 迁移过程 Kv1.1、TRPC1、PLC-γ1、RhoA、Rac1、Cdc42 mRNA 表达。7.Western blot 法检测 IEC-6 迁移过程 Kv1.1、TRPC1、PLC-γ1、RhoA、Rac1、Cdc42蛋白表达。8.激光共聚焦显微镜检测IEC-6迁移过程肌球蛋白Ⅱ(myosin Ⅱ)蛋白的表达和分布。研究结果1.白术药材以甲醇经超声提取后的3次得率分别为10.5%、10.05%和11.05%。用高效液相色谱法检测出白术提取物的3种主要成分白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,对实验所用的同批次白术药材分3次以高效液相色谱图进行相似度分析,发现其相似度分别为0.995、0.989、0.995,表明本研究中所用的白术药材质量稳定并且可控。2.在手术刀片划痕法IEC-6细胞迁移模型,筛选出白术提取物促进细胞迁移的3个给药剂量分别为50、100和200mg/L。细胞增殖实验表明,这3个剂量的白术提取物在24h、36h内对IEC-6细胞增殖的作用不明显。提示白术甲醇提取物的药理活性主要是促进细胞迁移,而对细胞增殖无明显影响。后续实验主要观察白术提取物促进细胞迁移的作用机制。3.受试药对IEC-6细胞迁移及多胺含量影响的结果表明,白术提取物(100mg/L和200mg/L)能促进IEC-6细胞迁移,逆转DFMO(多胺合成抑制剂)所致的细胞迁移抑制;能增加细胞迁移过程多胺含量,逆转DFMO所致的多胺(腐胺、精脒和精胺)含量减少。提示白术提取物促进细胞迁移与增加细胞内多胺含量有关。4.受试药对钾通道激活影响的结果表明,白术提取物(1OOmg/L和200mg/L)能逆转4-AP(钾通道抑制剂)所致的细胞迁移抑制;能提高细胞迁移过程钾通道Kv1.1 mRNA和蛋白表达,逆转DFMO所致的Kv1.1 mRNA和蛋白表达下降;增加细胞迁移过程膜电位(Em),逆转DFMO所致的Em降低。提示白术提取物促进细胞迁移的作用与钾通道激活、膜电位超极化有关。5.受试药对钙离子调控影响的结果表明,白术提取物(1OOmg/L和200mg/L)能提高细胞质游离钙离子浓度([Ca2+]cyt),提高钙通道蛋白TRPC1 mRNA和蛋白表达,提高调节胞内钙库释放的PLC-y1 mRNA和蛋白表达,可逆转DFMO所致的[Ca2+]cyt降低、TRPC1及PLC-γ1 mRNA和蛋白表达降低;若去除了细胞外的Ca2+(使用无Ca2+培养液),则不但空白对照组出现显着的细胞迁移抑制,且白术提取物促进细胞迁移的作用程度也明显弱于使用含Ca2+培养液时。提示白术提取物促进细胞迁移的作用与其影响钙离子调控有关,主要作用途径可能是通过促进细胞外Ca2+内流而增加[Ca2+]cyt,另一较弱的作用途径可能是增加细胞内钙库释放Ca2+。6.受试药对细胞迁移过程细胞骨架调控因素Rho GTP酶(RhoA、Rac1和Cdc42)影响的结果表明,白术提取物(100mg/L和200mg/L)能提高RhoA、Rac1、Cdc42 mRNA和蛋白表达,逆转DFMO所致的RhoA、Rac1、Cdc42mRNA和蛋白表达下降;此外,白术提取物可提高IEC-6细胞迁移过程肌球蛋白Ⅱ的表达,使肌球蛋白Ⅱ应力纤维含量增加,提示白术提取物对调节细胞骨架指标的影响是其促进细胞迁移的作用机制之一。研究结论益气健脾中药白术对胃肠粘膜损伤修复的作用与其促进损伤后上皮细胞迁移有关,作用机制与其影响多胺介导钾通道激活信号通路有关,尤其对细胞内[Ca2+]cyt调控的影响是其作用的关键指标之一。
王静[10]2009年在《脾气虚证相关基因RPS20在IEC-6细胞的生物功能鉴定》文中研究表明研究背景和目的中医理论认为脾主运化水谷精微和水湿,脾主统血,脾主升清,为气血生化之源、后天之本,脾主思,脾主四肢肌肉,开窍于口,其华在唇等。由此看出,脾的生理功能所涉及的广泛性,决定了它的病理也不会局限于一病一症一脏器。同时,脾与五脏六腑的关系,“内伤脾胃,百病由生”等,说明脾胃损伤会引起很多疾病的发生,脾病会引起很多脏器系统的病变,而很多疾病、脏器病变也会引起脾病的发生。从脾虚证入手进行脾本质的研究,长期以来一直是中西医结合证本质研究的重要课题。众多学者运用多种现代技术和方法,分别从生化、生理、超微结构等方面进行探讨,近年更有人从神经—内分泌—免疫网络方面来探讨脾虚证的实质,对其进行了各种客观指标的研究,取得了一定的成果。然而,这些研究都只反映了部分已知基因表达产物(受体、酶、细胞因子以及肽类等)的改变,远未揭示证的实质。基因组及后基因组时代的到来,为从基因水平切入证候的研究提供了新的思路与方法。多数学者认为,基因组学在整体观、阴阳学说、五脏学说、病因学说等方面与中医学具有相似性,中医“证”的内涵即基因表达的改变,因此提出了中医证候基因组学的概念。目前,主要是采用基因芯片技术分析证候的差异基因表达谱,来进行中医证候基因组学的研究,具有代表性的是关于脾虚证、肾阳虚证、虚寒证、心阳虚证、肺虚证等的研究。我们实验室前期先后对慢性浅表性胃炎脾气虚证者与正常志愿者、慢性浅表性胃炎脾气虚证患者与慢性浅表性胃炎脾胃湿热证患者、溃疡性结肠炎脾气虚证患者与正常志愿者、溃疡性结肠炎脾气虚证患者与溃疡性结肠炎脾胃湿热证患者进行基因表达谱的分析。证实了慢性浅表性胃炎脾气虚证者,具有差异表达基因,其中蛋白合成相关的差异基因大多下调;慢性浅表性胃炎脾气虚证患者与慢性浅表性胃炎湿热证患者比较,相关差异基因也表达下调,这与脾气虚时机体功能抑制,而湿热时机体功能亢进相符合;进行扩大样本量重复分析或进行同证异病分析时,趋势相同。通过对这些海量数据进行生物信息学的分析整合,我们认为脾气虚证具有蛋白质合成相关基因下调的趋势,其中以核糖体蛋白基因下调比较显着。核糖体蛋白基因是核糖体的重要组成部分,起到组装核糖体,促进蛋白质合成的作用。核糖体蛋白高度保守,但核糖体蛋白基因发生突变或缺失时,可以产生存活且异常的表型。核糖体蛋白基因突变或核糖体蛋白缺失或不恰当的化学修饰,一方面将影响核糖体的功能,降低多肽合成的活性,另一方面会影响RP(ribosomal protein)的生理功能,从而导致各种严重的后果。我们选择重复性表达下调的RPS20(ribosomal protein S20)对其进行生物功能鉴定。实验以大鼠小肠隐窝细胞株(Intestinal crypt cell line,IEC-6)为模型,采用RNAi(RNA interference)技术干扰RPS20,造成RPS20缺失表型,观察对细胞生理功能的影响,以初步探讨脾气虚证相关基因RPS20的生物功能。研究方法1.IEC-6细胞生长状况的观察采用相差显微镜技术观察细胞形态结构;台盼蓝排斥试验检测细胞活力;细胞计数法及MTT比色法绘制IEC-6细胞生长曲线。2.RNA干扰过程中IEC-6细胞转染条件的优化以24孔板为例,采用阳离子脂质体转染FAM-siRNA片段进入IEC-6细胞内,通过调整FAM-siRNA和Lipofectamine2000的剂量,分别采用荧光显微镜和流式细胞仪两种仪器检测转染后荧光强度。3.筛选针对RPS20基因的有效干扰片段3.1 RT-PCR检测RNAi后IEC-6细胞RPS20 mRNA的表达设置空白对照组、siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组,6孔板每孔种植8×10~5个细胞,第2日转染时,按照每孔转染总体积2.5mL、20μM浓度的siRNA20μL(即siRNA终浓度160nM)、Lipofectamine2000 4.2μL的条件进行转染,然后采用RT-PCR检测干扰后24h、48h、72h后RPS20 mRNA表达。3.2荧光定量RT-PCR检测RNAi后IEC-6细胞RPS20 mRNA的表达设置空白对照组、转染试剂对照组、阴性对照组、siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组,转染条件及方法同3.1,然后采用实时荧光定量RT-PCR检测干扰48h后RPS20mRNA表达。3.3 Western-Blot检测RNAi后IEC-6细胞RPS20蛋白的表达设置空白对照组、转染试剂对照组、阴性对照组、siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组,转染条件及方法同3.1,然后采用Western-Blot检测干扰后24h、48h、72h,RPS20蛋白的表达。4.RNAi后IEC-6细胞形态功能的改变4.1 RNAi后IEC-6细胞形态的变化转染条件及方法同3.1,设置空白对照组、转染试剂对照组、siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组,采用相差显微镜观察细胞的大体形态;设置空白对照组、转染试剂对照组、阴性对照组、siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组,采用透射电镜观察干扰RPS20基因48h后,IEC-6细胞超微结构的变化。4.2 RNAi后对IEC-6细胞迁移能力的影响设置空白对照组、转染试剂对照组、阴性对照组、siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组,转染条件及方法同3.1,转染后48h划痕法建立细胞迁移模型,划痕24h后,拍照,计算细胞迁移的数目,以观察干扰RPS20后,细胞迁移能力的变化。4.3 RNAi后IEC-6细胞增殖效率的变化设置空白对照组、siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组,转染条件及方法同3.1,采用细胞计数法计数干扰后24h、48h、72h IEC-6细胞数目的变化;设置空白对照组、转染试剂对照组、siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组,96孔板每孔种植2.5×10~4个细胞,第2日转染时,按照每孔转染总体积0.6mL、20pM浓度的siRNA20μL(即siRNA终浓度160nM)、Lipofectamine2000 4.2μL的条件进行转染,MTT法观察干扰RPS20后24h、48h、72h IEC-6细胞增殖效率的变化。4.4 RNAi后对IEC-6细胞凋亡的影响设置空白对照组、转染试剂对照组、阴性对照组、siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组,转染条件及方法同2,采用Anexin V—FITC检测方法,观察干扰RPS20 48h后诱导IEC-6细胞凋亡的情况。结果1.IEC-6细胞生长状况的观察引进的IEC-6细胞具有典型的正常肠上皮隐窝细胞的形态特征;具有较高的生存活力;细胞在第3天时进入对数生长期,在第7～10天时达到平台期,之后又继续缓慢增长。2.RNA干扰过程中IEC-6细胞转染条件的优化荧光显微镜检测转染效率,以评分进行秩和检验:结果仅有转染试剂或仅有FAM-siRNA,或两者均无的组别,评分均为0;转染试剂加FAM-siRNA组别均有或强或弱的荧光表达。流式细胞仪检测转染效率,以Lipofectamine2000 1.0μL+FAM-siRNA 160nM组转染效率最高(平均76.3%);而空白对照组约为1%。3.筛选针对RPS20基因的有效干扰片段3.1 RT-PCR检测干扰后RPS20 mRNA的表达在干扰后24h,与空白组比较,siRNA1组RPS20的mRNA表达明显减少,差异具有显着性意义(P＜0.05),而siRNA2、siRNA3组都没有明显抑制其表达;在干扰后48h、72h,siRNA1、siRNA2、siRNA3组,都没有明显抑制RPS20 mRNA表达的趋势。3.2荧光定量RT-PCR检测干扰后RPS20 mRNA的表达相对于空白对照组来说,siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组叁组都在转染48h后成功地干扰了RPS20基因的表达,干扰效率在80%-90%左右。3.3 Western-Blot检测干扰后RPS20蛋白的表达与空白对照组比较,干扰后24h,siRNA1、siRNA2组蛋白表达量均降低,且差异具有显着性意义(P＜0.028,P＜0.049),siRNA3组蛋白表达量也趋向降低,但并不具有显着性差异(P＜0.065);与空白对照组比较,干扰后48h,siRNA2、siRNA3组蛋白表达量均降低,且差异具有显着性意义(P＜0.028,P＜0.006),siRNA1组蛋白表达量也趋向降低,但并不具有显着性差异(P＜0.619);与空白对照组比较,干扰后72h,siRNA2、siRNA3组蛋白表达量均降低,且差异具有显着性意义(P＜0.019,P＜0.015),siRNA1组蛋白表达量也趋向降低,但并不具有显着性差异(P＜0.056)。4.RNAi后IEC-6细胞形态功能的改变4.1 RNAi后IEC-6细胞形态的变化相差显微镜下观察,与空白组比较,siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组叁组干扰序列细胞数都有所减少,但细胞形态并没有明显改变。透射电镜检测干扰后48h细胞超微结构的变化,发现:空白对照组IEC-6细胞膜、细胞核完整,细胞器丰富;转染试剂对照组及阴性对照组,细胞核都比较完整,有少许空泡及脂肪颗粒;siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组细胞膜不完整,胞浆内有大量空泡出现,溶酶体增加,siRNA2组、siRNA3组空泡内还有疑似高电子致密度内容物的生成;细胞器较少,部分细胞呈现细胞器模糊。4.2 RNAi后对IEC-6细胞迁移能力的影响与空白组比较,siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组都能在干扰后48h抑制细胞的迁移(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01)。4.3 RNAi后IEC-6细胞增殖效率的变化细胞计数法:与空白对照组比较,转染后24h、48h、72h,siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组都能明显抑制IEC-6细胞生长的数目(P＜0.01)。MTT法:与空白对照组比较,转染后24h,siRNA2组、siRNA3组都能明显地抑制细胞增殖(P＜0.05);转染后48h,siRNA2组能抑制细胞的增殖(P＜0.05);转染后72h,siRNA2组、siRNA3组能抑制细胞的增殖(P＜0.01,P＜0.05)。4.4 RNAi后对IEC-6细胞凋亡的影响与空白对照组比较,siRNA1组活力细胞减少,差异具有显着性意义(P＜0.05);siRNA1组早期凋亡细胞有所增多,但差异没有显着性意义;各组正常死亡细胞及晚期凋亡细胞比较,差异都没有显着性意义。结论1.IEC-6细胞生长曲线在第10后,从平台期又进入了缓慢增长阶段,由于在连续培养IEC-6细胞10天后,细胞会呈现分化状态,分析缓慢增长可能与分化有关;2.本课题设计并合成了3对针对大鼠RPS20的siRNAs,而且都能够有效地抑制IEC-6细胞RPS20mRNA与蛋白的表达,表明了序列的有效性;3 IEC-6细胞胞浆空泡化,并且迁移、增殖能力受到抑制,但并没有导致细胞早期凋亡的发生,该结果提示干扰RPS20可能影响IEC-6细胞的消化吸收功能和胃肠粘膜损伤修复功能,与前期收集的脾气虚证患者消化吸收功能下降、黏膜损伤修复能力下降等表现相符合。本结果支持由临床研究基因表达谱归纳出的特点,支持脾气虚证本质与RP相关的假说。
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