孙兴参[1]2001年在《猪体细胞核移植及几个相关问题的研究》文中提出细胞核移植技术不仅是研究细胞核与细胞质相互作用的重要手段，而且是在医学和农业等领域都将有着广泛的应用前景的一项重要胚胎工程技术。尽管近来哺乳动物体细胞核移植克隆已经取得了很大进展，但实践证明猪的克隆难度最大，有许多问题亟待解决。本实验对猪体细胞核移植及其相关问题如细胞融合、卵母细胞激活和卵母细胞体外成熟进行了研究。结果如下： 1.将卵丘细胞直接注入卵母细胞或将培养的颗粒细胞与卵母细胞融合，供核细胞都能发生染色质提前凝集（PCC）；将培养的颗粒细胞与去核的卵母细胞融合后，核重组变化方式与直接注射法的结果相似，但是融合培养的颗粒细胞要比直接注射卵丘细胞的发育速度快。 2.将卵丘细胞直接注入卵母细胞构建核移植胚胎，在中间受体内发育到囊胚。 3.猪-猪同种核移植胚胎和猪-小鼠异种移核胚胎激活后，异种重组胚多形成二原核（2PN），而同种重组胚则主要形成一原核（IPN）。 4.Ionomycin/6-DMAP或只用Ionomycin能够有效地激活猪卵母细胞，激活率可达84.3％和88.9％；电刺激/6-DMAP与化学刺激/6-DMAP激活方法在激活率上虽然没有明显差异，但电激活的卵裂率明显高于化学激活。 5.采用相对较低场强（0.8V/cm左右）和长脉冲（60μs）组合的重组胚胎的融合率高于高场强（2.1kv/cm左右）和短脉冲（20μs）的组合。 6.采用活体荧光染料Hocest33342对猪的生发泡进行了观察，发现猪GV染色质构型有五种类型；腔前卵泡卵母细胞都为GV-0染色质构型；随着卵泡的发育，GV-1卵母细胞比例增高；体外成熟过程中，随着培养时间的延长，GV-3的比率增加，但在体内，注射PMSG和hCG后没有观察到GV-3期，只是在注射hCG后18-24小时GV-2的比率增加。 7.无论是A类卵还是B类卵，在不含激素培养液中前培养12小时，并没有使卵母细胞GV染色质同步化，但就A类卵而言，成熟卵中极体完整的比率显着提高。 8.激素水平对卵丘扩展有影响，但随培养时间的延长，对激素的要求有逐步减少的趋势；猪卵丘扩展不依赖于卵母细胞，卵母细胞核成熟也与卵丘扩展无关；GV期卵母细胞、小腔卵泡内颗粒细胞和成熟卵的卵丘细胞都有较高的分泌CEEF能力；3-6mm卵泡的壁颗粒细胞不能分泌CEEF，但3—6mm卵泡的卵泡液中有CEEF。
徐小明[2]2006年在《胎猪骨髓间充质干细胞核移植及核移植胚胎干细胞的分离》文中认为本研究以猪不同类型的细胞为供核细胞,体外成熟去核卵母细胞为受体胞质在体外构建胚胎,建立了体外生产体细胞核移植胚胎的技术体系,为体细胞克隆猪及核移植源胚胎干细胞(ntESCs)系的分离提供良好的平台。论文主要从以下5个方面进行了研究:1.供核细胞的准备共从4例胎儿肌肉组织中分离得到4个猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts, pFF)株,从1例新生猪耳组织中用组织块培养法分离得到一个耳部皮肤成纤维细胞(porcine ear skin fibroblasts, pESF)株,从3例胎猪骨髓中分离得到3个胎猪骨髓间充质干细胞(porcine fetal mesenchymal stem cells, pFMSCs)株。将1~5代的pFF、pESF及pFMSCs分别进行冷冻保存,解冻复苏后形态及活力没有明显变化。pFMSCs形态为成纤维样,呈长梭形,连续传13代后形态没有明显改变。传代培养的pFMSCs生长潜伏期为1~2 d ,之后进入对数增殖期,接种后的第6天进入平台期。透射电镜分析表明,pFMSCs细胞核质比高,胞浆中细胞器少。核型分析表明,pFMSCs具有正常的核型(2n=38,XY)。流式细胞仪检测显示,pFMSCs表达细胞表面抗原CD44,CD166,CD105,CD117,不表达CD45,CD90,CD11a,CD14。在β-巯基乙醇作用下,pFMSCs可诱导分化为神经样细胞,Nestin染色阳性。经血清饥饿和接触抑制处理的pFMSCs,流式细胞仪检测G0/G1期的细胞分别为86.72%和88.44%。以上细胞的分离培养为猪体细胞核移植相关研究打下了基础。2.猪卵母细胞体外成熟培养体系的建立从屠宰场采集猪卵巢,选择颗粒细胞层数2层以上、胞质均一的COCs进行体外成熟培养,对培养液组份进行了比较发现:①mM199组猪卵母细胞成熟率显着高于M199组(71.7% vs 59.7%)(p<0.05),mM199组和M199组较NCSU-23组(43.6%)均能显着提高卵母细胞的成熟率(p<0.01)。②PMSG+hCG+FSH组卵母细胞成熟率略高于FSH+LH组,二组卵母细胞成熟率显着高于hMG组(p<0.01)。③分别添加FBS和PFF与对照组(分别不添加FBS和PFF)成熟率无统计学上的差异,但电激活后,均能显着提高卵裂率(p<0.05),桑囊率二者无显着差异(p>0.05)。④单独添加EGF和联合添加EGF和ITS卵母细胞成熟率较不添加组稍有提高。电激活后,均能显着提高桑囊率(p<0.05)。⑤选择颗粒细胞层数3层以上的COCs可以显着提高卵母细胞体外成熟率
吕培茹[3]2008年在《巴马小型猪体细胞核移植和食蟹猴—猪异种体细胞核移植相关问题的初步研究》文中进行了进一步梳理本研究主要探讨巴马小型猪体细胞核移植和食蟹猴-猪异种核移植的相关技术问题。本论文包括两大部分,第一部分是文献综述,第二部分是试验研究。试验研究包括:(一)猪和食蟹猴体细胞培养体系的建立;(二)巴马小型猪体细胞核移植体系的建立;(叁)PHA对孤雌激活和体细胞核移植胚胎发育的影响;(四)猪体细胞核移植胚胎移植方法的建立;(五)食蟹猴-猪异种核移植的初步研究。试验研究的方法和结果可归纳为如下几点:1.建立巴马小型猪睾丸成纤维细胞、耳部成纤维细胞、普通猪胎儿成纤维细胞和颗粒细胞的体外培养体系,并探讨其作为猪体细胞核移植供体的可能性。使用酶消化和组织块法成功分离培养了睾丸成纤维细胞,鉴定了其细胞类型,并且对其细胞周期与核心组蛋白(H3K9)乙酰化的关系进行了研究。结果表明,该培养体系可以支持上述几种细胞的体外生长。免疫荧光染色鉴定所分离到的细胞为睾丸成纤维细胞。两种同期化方法(血清饥饿和接触抑制)的结果显示:随着血清饥饿时间的延长G0+G1细胞的比例急剧升高后又趋于稳定,2d、4d组与70-80%汇合组差异显着(75.9%,95.9%vs.95.2%,P＜0.05),但2d、4d组差异不显着;细胞随着汇合度的增加G0+G1细胞的比例开始上升,接触抑制两天后基本趋于稳定,2d组、4d和6d组显着高于70-80%汇合组和100%汇合组(97.3%,95.0%,97.4%vs.74.7%,84.2%,P＜0.05)。流式细胞仪分析显示:无论是血清饥饿还是接触抑制处理,G0/G1期供体细胞组蛋白乙酰化水平变化趋势基本相同,基本上是先升高后又降低。2.建立了食蟹猴耳部成纤维细胞的体外培养体系,并探讨其作为猴同种体细胞核移植或异种体细胞核移植供体的可能性。分别使用酶消化和组织块法分离到了食蟹猴耳部成纤维细胞,间接免疫荧光法鉴定了其细胞类型并进行了核型分析。结果表明:该培养体系可以很好地支持该种细胞的体外生长,目前已传代到43代,生长仍旺盛;免疫荧光染色鉴定分离到的细胞为耳部成纤维细胞;对21代的细胞进行核型分析,核型正常。3.本试验的目的是:A.掌握猪卵母细胞成熟过程中第一极体的位置随时间发生偏移的规律,为提高盲吸法去核效率提供依据;B.初步探讨胎儿成纤维细胞和颗粒细胞核移植效率;C.胚胎培养时添加胰岛素对孤雌激活和颗粒核移植胚胎发育率的影响;D.探讨简易融合仪对孤雌激活和体细胞核移植胚胎发育能力的影响。结果表明:在44-46h,有84.7%的极体位置偏移不超过30°,盲吸法的去核率基本与之对应,平均在88.1%,适于在本段时间进行去核。胎儿成纤维细胞、颗粒细胞核移植胚胎的囊胚率分别为9.9%和8.7%。Insulin无论对于颗粒细胞核移植胚胎(8.0%vs.2.4%,P＞0.05),还是孤雌激活胚胎均无显着促进作用(47.3%vs.44.3%,P＞0.05),但孤雌激活胚胎的囊胚显着高于核移植胚胎(47.3%和44.3%vs.8.0%和2.4%,P＜0.05)。简易融合仪下,对于核移植胚胎,场强为200v/mm组的桑椹胚发育率均高于220v/mm组(33.3%,29.6%vs.17.1%,13.8%,P＞0.05);场强一定时,20μs组的桑椹胚率均高于40μs组。随着场强的升高和脉冲时间的延长,桑椹胚发育率呈下降趋势。对于孤雌激活胚胎,20μs组的分裂率和囊胚率均高于40μs组,但差异不显着。;4.对睾丸成纤维细胞进行血清饥饿和接触抑制处理,寻找适宜的同期化方法,同时探讨了高代睾丸成纤维细胞重构胚胎的核重塑的规律,并比较了高代、低代睾丸成纤维细胞和耳部成纤维细胞重构胚胎的发育率。结果显示:接触抑制法处理供体,核移植胚胎融合率显着高于血清饥饿法(68.6%vs.55.3%,P＜0.05),胚胎囊胚率也高于后者(21.1%vs.14.1%;P＞0.05),但差异不显着;重构胚胎激活后3h,供体核的大小基本不发生变化,激活后6h,绝大多数重构胚形成膨大的类原核,到12h时,几乎所有重构胚形成膨大的类原核,并开始观察到重构胚分裂现象;低代睾丸成纤维细胞和耳部成纤维作为供体细胞时,重构胚胎的融合率均显着高于高代睾丸成纤维细胞(84.4%,79.1%vs.69.2%,P＜0.05),前两者的重构胚融合率也差异显着(84.4%vs.79.1%,P＜0.05),低代睾丸成纤维细胞作为供体细胞时重构胚胎的囊胚率显着高于高代睾丸成纤维细胞和耳成纤维细胞(13.9%,8.9%vs.6.4%,P＜0.05)。5.探讨了植物凝集素(PHA)对于化学激活、电激活孤雌激活胚胎和体细胞核移植胚胎发育能力的影响。结果表明:添加适量PHA可以提高化学激活胚胎的囊胚率,10μg/mlPHA可以使囊胚率提高到54.1%;加入量大则有害;添加10μg/ml,20μg/ml的PHA可以显着提高体细胞核移植囊胚发育率(13.0%,5.6%vs.5.0%,P＜0.05),10μg/ml组的囊胚率比对照组提高1倍多。总之,PHA对于化学激活、电激活和体细胞核移植胚胎的作用呈剂量依赖性,适量添加有助于叁种胚胎的发育,过量则有害。6.以胎儿成纤维细胞和新生巴马小型猪睾丸成纤维细胞为供体构建的重构胚胎,利用刺入式胚胎移植法将其分别移入两头巴马小型猪和两头陆川猪的输卵管内。其中两头巴马小型猪和一头陆川猪返情,一头陆川猪怀孕到期,产下一头健康的雄性巴马小型猪。说明新生巴马小型猪睾丸成纤维细胞核移植胚胎可以发育到期。7.采用食蟹猴耳部成纤维细胞作为核供体构建猴-猪异种核移植胚胎,研究其核重编机制并寻找适宜的培养基,初步建立食蟹猴-猪异种核移植体系。结果显示:(1)重构胚胎激活后3h,供体核的大小基本不发生变化,但在激活后6h大部分形成膨大的类原核。(2)食蟹猴-猪异种核移植胚胎融合率为74.2%,有70.5%的重构胚胎发生卵裂,29%的卵裂胚胎发育到桑椹胚阶段。(3)NCSU23+10%FCS和TCM199+10%FCS培养基中,重构胚突破4-细胞阻滞发育到8-细胞以上的比例分别为23.5%和17.0%,NCSU23培养基为19.9%,但是只有在NCSU23+10%FCS和TCM199+10%FCS培养基中重构胚胎可以发育到囊胚阶段(1.4%vs.1.1%,P＞0.05),尽管差异不显着。
韩树标[4]2007年在《猪卵丘细胞核移植过程中卵母细胞末期去核相关问题研究》文中进行了进一步梳理在核移植过程中，供核细胞与受体胞质是重构胚的两个重要构件，尤其是受体胞质对重构胚核基因的重新编程及胚胎的发育至关重要。目前，大多数研究者都是采用MⅡ期卵母细胞作为受体胞质。但是该方法由于在去核时要抽取大量胞质，而且还要用紫外线照射以检查去核是否完全，因而对细胞损伤大影响重构胚的发育。近年来有人采用激活MⅡ期卵母细胞待其排出第二极体后，抽取第二极体及其周围少量含核的胞质来达到去核的目的，又称为TⅡ期去核。这种方法由于抽取的胞质少，而且不需要紫外线的照射，故而对细胞的损伤较小。许多实验室对该方法进行了研究，但是关于卵母细胞TⅡ期去核对猪体细胞核移植重构胚发育的影响，目前国内还尚无相关报道。本论文主要研究和比较了猪卵母细胞TⅡ期去核方法与效果，在此基础上还对猪卵母细胞TⅡ期去核法生产核移植胚胎的程序进行了优化，为推广应用该技术生产猪的体细胞核移植胚胎提供一些数据和经验。本实验在原有猪体细胞核移植技术的基础上，对影响猪卵母细胞TⅡ期去核重构胚发育的几个因素(卵母细胞预激活程序、核移植后核质作用时间以及核供体细胞预处理方法)进行如下实验。1、猪卵母细胞TⅡ期预激活物质的选择。本实验以第二极体排出比率为指标，分别选择不同浓度的叁种物质，作用于猪成熟卵母细胞观察统计预激活效果。5％、7％和10％乙醇浓度预激活猪卵母细胞排出第二极体的比率分别为20.83％(25/120)、25.00％(30/120)和22.50％(27/120)；采用浓度为4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL和10μg/mL的放线菌酮预激活猪卵母细胞后，第二极体的排出率分别为：16.67％(20/120)、19.17％(23/120)、25.83％(31/120)和20.83％(25/120)；浓度为5μmol/mL、10μmol/mL、15μmol/mL和20μmol/mL钙离子载体A23187(CaA)预激活猪卵母细胞后第二极体的排出效果为54.17％(65/120)、58.33％(70/120)、64.17％(77/120)和57.50％(69/120)，15μmol/mL组效果最好，各浓度之间差异不显着(p＞0.05)。比较以上叁种物质预激活猪卵母细胞的效果发现15μmol/mL的CaA极显着优于其他两种物质(p＜0.01)。2、不同受体卵母细胞胞质对猪体细胞核移植的影响。本实验以重构胚卵裂率和4-细胞以上胚胎发育率为检测统计指标，以MⅡ期中期去核和TⅡ期去核的卵母细胞作为受体胞质，经血清饥饿的卵丘细胞作为核供体构建重构胚胎，比较两种受体胞质对猪体细胞核移植效果的影响。结果表明：MⅡ期中期去核的卵母细胞为核受体胞质的卵裂率和4-细胞以上胚胎发育率均高于TⅡ期去核的卵母细胞(31.67％vs24.17％,14.17％vs10.83％)，差异显着(p＜0.05)。说明，MⅡ期中期去核的卵母细胞更适宜作为核移植受体胞质。3、不同核质作用时间对猪体细胞核移植的影响。采用电融合法将卵丘细胞移入去核的卵母细胞中，供体细胞在TⅡ期去核的受体胞质内分别孵育0h、1h、2h、3h、4h和5h后，1.3kV/cm、80μs、单次脉冲电激活重构胚，以重构胚卵裂率和4-细胞以上胚胎发育率为检测统计指标，比较不同核质孵育时间对核移植效果的影响。结果表明：核质孵育4h可以获得较好的核移植效果，其卵裂率(35.83％(45/120))显着高于其他几组(22.50％、25.83％、26.67％、28.83％、30.83％，p＜0.05)。4-细胞以上胚胎发育率与孵育3h组差异不显着(12.50％vs12.50％,p＞0.05)。但与其它几组相比差异显着(12.50％vs 4.17％,9.17％,10.00％，7.50％,p＜0.05)。说明用TⅡ期去核卵母细胞作为核受体胞质，核质孵育4h后再进行补充性电激活可以提高猪体细胞核移植重构胚的发育率。4、不同供核细胞预处理方法对核移植效果的影响。本实验将经过血清饥饿处理的卵丘细胞作为对照组，分别用7％乙醇和钙离子载体A23187(5μmol/L)预处理供核细胞，核移植重构胚融合后，核质孵育4h再激活，比较两种预处理方法对核移植重构胚的影响。结果表明：用CaA预处理组的核移植重构胚的卵裂率(37.50％vs30.83％)和4-细胞以上胚胎发育率(15.83％vs10.83％)均高于对照组，差异显着(p＜0.05)。卵裂率也略高于乙醇预处理组的核移植重构胚卵裂率(37.50％vs34.16％，p＞0.05)，但是4-细胞以上胚胎发育率显着高于乙醇预处理组(15.83％vs9.17％，p＜0.05)。由此可见，TⅡ期去核的卵母细胞作为核受体胞质，用钙离子载体预处理核供体细胞，核质孵育4h再激活重构胚，有利于核移植重构胚的发育。综上所述，在以TⅡ期去核的猪卵母细胞作为核受体胞质时，最适宜的程序是：用浓度为15μmol/mL钙离子载体处理卵母细胞5min，然后抽取第二极体及其周围少量胞质进行去核。供核细胞用5μmol/mL钙离子载体预处理后注入TⅡ期去核的猪卵母细胞卵周隙内，采用参数为1.0kV/cm、80μs、单次脉冲电融合法移入供体细胞核，构建重构胚胎，此后，核质孵育4h，最后使用参数为1.3kV/cm、80μs、单次脉冲电激活重构胚，可以明显提高核移植重构胚的发育比率。简化核移植的操作程序。
赛务加甫[5]2007年在《提高绵羊体细胞核移植效率的研究》文中进行了进一步梳理本研究对绵羊卵母细胞体外成熟、卵母细胞冷冻保存、卵母细胞孤雌激活、绵羊同种和异种体细胞核移植及重构胚胎体外培养等关键技术进行了试验分析,以期提高绵羊体细胞核移植的效率,建立完善的核移植技术体系,为进一步获得体细胞克隆绵羊和异种克隆个体提供技术支撑。本研究内容包括以下几个方面:(1)在绵羊卵母细胞成熟培养液中添加孕酮等某些影响体外成熟的成份,确定绵羊卵母细胞的最佳成熟方案。(2)并通过对比不同冷冻保护剂对卵母细胞的冷冻保存效果,为核移植操作批量提供成熟的卵母细胞。(3)采用胞质注射法,建立精子提取物激活卵母细胞的方法,并且与离子霉素结合6-DMAP激活法和电激活法进行了比较,筛选出适宜激活方法。(4)体外分离培养得到道赛特绵羊和莎能奶山羊的耳皮肤成纤维样细胞,对绵羊皮肤成纤维细胞的生物学特性和不同细胞因子对其生长增殖的影响进行了研究,并对绵羊成纤维细胞和山羊成纤维细胞分别进行体外传代及冻存,为绵羊体细胞核移植和绵羊-山羊种间核移植试验提供了供体细胞。(5)绵羊孤雌激活胚、绵羊重构胚和绵羊-山羊种间重构胚分别置于不同的培养系统中培养,优化绵羊胚胎体外体系,增加胚胎的体外发育潜力。主要研究结果如下:1.绵羊卵母细胞体外成熟基础液中分别添加5μg/mL FSH+1.0 IU/mL LH+10%发情牛血清(OCS)、5μg/mL FSH+1.0 IU/mL LH+10%胎牛血清(FBS)、0.075 IU/mL HMG+OCS和0.075 IU/mL HMG+10% FBS,结果表明成熟液中添加OCS更有利于卵母细胞的成熟;添加5%～10%的BFF能够提高卵母细胞的成熟率,但20%BFF卵母细胞的体外成熟率下降;培养液中分别添加0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL和2.0μg/mL孕酮,结果表明孕酮的最适添加剂量为0.5μg/mL。结果表明绵羊卵母细胞的体外成熟培养液组成为M199+10 mmol/L Hepes+0.38 mmol/L丙酮酸钠+ 25 mmol/L谷氨酰胺+1μg/mL 17β雌二醇(17β-E2)+5μg/mL FSH+1.0 IU/mL LH+10%OCS+0.5μg/mL孕酮时其体外成熟培养效果最好。2.采用程序冷冻法对处于不同发育时期的绵羊卵母细胞进行冷冻保存,冷冻液Ⅰ～冷冻液Ⅳ对同一时期卵母细胞冷冻解冻后的形态正常率、卵裂率和桑囊胚发育率均无显着影响,而冷冻液Ⅳ体外成熟24 h冷冻解冻后的卵母细胞发育率显着高于GV期和体外成熟10 h的卵母细胞,说明用乙二醇(EG)作为冷冻保护剂,添加0.1 mol/L海藻糖较合适对成熟培养24 h的绵羊卵母细胞进行冷冻保存;-6.5℃植冰时冷冻卵母细胞囊胚发育率显着高于其他组。采用玻璃化冷冻方法对绵羊GV期到体外成熟培养24 h卵母细胞进行冷冻保存试验证实,以玻璃化冷冻液Ⅱ作为冷冻剂,体外成熟培养24 h卵母细胞的卵裂率和囊胚发育率最好,不经过成熟培养的卵母细胞玻璃化冷冻效果最差,认为添加0.1 mol/ L海藻糖来进行卵母细胞的玻璃化冷冻可以起到保护作用,卵母细胞冷冻解冻后可以用作受体胞质进行核移植,重构胚的发育能力受冷冻处理的影响不显着。3.对绵羊卵母细胞以连续3次120 v/mm的直流脉冲进行电激活获得最佳激活效果,囊胚发育率显着高于脉冲1次和2次(P<0.05);用分别注射不同剂量的精子提取物,对绵羊卵母细胞进行孤雌激活,结果表明最佳注射剂量为向每个卵母细胞注入精子提取物3 pL;分别用电激活法,离子霉素联合6-DMAP法和精子提取物胞质内注射法对绵羊卵母细胞进行激活,结果表明电脉冲的激活效果显着低于后二者的效果,且差异显着,精子提取物和离子霉素联合6-DMAP法的囊胚率差异不显着,均可以用于绵羊卵母细胞的激活。4.高糖DMEM较适宜于绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养和继代培养。以DMEM+50% NCS(new - born calf serum),添加10% DMSO为冻存保护剂,进行冷冻保存的无角道赛特绵羊皮肤成纤维细胞,解冻细胞经体外5~6次传代培养,细胞形态维持在初始状况,保持了良好的遗传特性;添加EGF和胰岛素对绵羊皮肤成纤维细胞的生长均有促生长作用。5.卵母细胞体外成熟培养时间分别为15~17 h、19~21 h与23~25 h时,随着培养时间的增加成熟率也增加,卵母细胞去核成功率随着成熟时间的延长而下降,试验认为卵母细胞体外成熟19~21 h,既可以保证高的去核成功率,又可以保证卵母细胞较高的成功率,有利于提供充足的卵源;不经血清饥饿处理的供体细胞采用胞质注射法构建克隆胚,其胚胎发育率略高于血清饥饿处理组,但差异不显着。试验认为体外成熟培养19~21 h的卵母细胞可以作为核移植受体细胞,未经血清饥饿处理的成纤维细胞作为供体细胞进行核移植,可以获得较高的重构胚胎发育率。6.采用胞质内注射法构建绵羊皮肤纤维细胞重组胚,胚胎经离子霉素联合6-DMAP激活后,其细胞融合率、卵裂率和囊胚发育率均高于电融合法,同时结果表明重构胚用离子霉素联合6-DMAP或精子提取物激活后,卵裂率和囊胚发育率相近,其中精子提取物的激活效果优于离子霉素激活法;激活间隔时间研究结果证实,卵母细胞注核后经体外培养3～4 h后再激活,可以获得较高的激活率。7.用冷冻的山羊成纤维细胞可以成功构建山羊-绵羊异种体细胞核移植胚,种间体细胞核移植胚能够进行正常的早期发育,种间重构胚经离子霉素联合6-DMAP或者胞质注射精子提取物激活后,卵裂率和囊胚发育率差异不显着(P>0.05);用电脉冲融合法构建异种核移植胚胎时,其融合率、卵裂率和囊胚发育率均低于胞质注射法;不同山羊供体细胞进行山羊-绵羊异种核移植胚胎构建时,血清饥饿处理与否对种间核移植囊胚率无显着影响,表明山羊皮肤成纤维细胞可以不经过血清饥饿处理直接进行核移植。8.联合使用培养液能改善绵羊同种和异种重构胚的发育。即使用CR1aa+BSA培养重构胚3 d,再用SOFaa+5%FBS继续培养,获得的重构胚囊胚发育率较高。在胚胎培养液中添加孕酮可在一定程度上提高重构胚的卵裂率和囊胚率。其中以2.0和4.0μg/mL孕酮组的囊胚率最高,与对照组和其他孕酮浓度组差异显着。发现共培养体系对绵羊同种核移植重构胚的发育有显着的影响,而且在3 d更换1次新的饲养细胞单层对重构胚的发育有明显的促进作用。
冯秀亮[6]2003年在《人—猪异种细胞核移植研究》文中认为1．自屠宰场采集猪卵巢，用抽吸法采集卵母细胞，选择外周卵丘细胞包裹致密、卵母细胞胞质均一的卵母细胞(A，B级)进行体外成熟培养，研究其相关影响因素。结果表明：①A(M199+10％FBS+10IU／ml PMSG+10IU／ml hCG+2.5IU／ml FSH)、B(M199+10％FBS+10IU／ml PMSG+10IU／ml hCG+10％PFF)、C(M199+10％FBS+10IU／ml hCG)和D(M199+10IU／ml PMSG+25mg／ml BSA)4组成熟培养液进行猪卵母细胞体外成熟，成熟率分别为61.8％、64.0％、38.3％和66.1％，A，B，D 3组之间无显着性差异(P＞0.05)，A，B，D组与C组间差异极为显着(P＜0.01)。其中D组成熟卵母细胞卵周隙和第一极体均较小，质量较差；②以M199与mM199作为基础培养基时，卵母细胞成熟率分别为63.3％和79.3％，差异极为显着(P＜0.01)；③培养液中不添加血清与添加血清时卵母细胞成熟率分别为60.3％和33.8％，差异极为显着(P＜0.01)。无血清组卵丘细胞扩散较差；④由直径＜2mm、2mm-8mm和＞8mm卵泡获得的卵母细胞成熟率分别为21.7％，64.9％和82.4％，＜2mm一组与另两组成熟率差异极为显着(P＜0.01)。直径＞8mm一组成熟卵母细胞卵周隙中有较多碎片，形态上质量较差；⑤卵巢运输温度为25～30℃、30～35℃、35～39℃以及35～39℃且操作温度为37℃时，成熟率随温度升高而升高(4.0％，22.9％，49.0％，60.3％)，有显着性差异，运输温度较低时成熟卵母细胞质量较差。 2．对电场强度、脉冲次数和卵龄对猪卵母细胞电激活的影响进行比较。随着电场强度增加(100～200V／mm)，卵裂率和卵母细胞裂解率也逐渐升高；由电场强度为150V／mm，脉冲时程60us的电刺激取得较好结果(无裂解卵母细胞，卵裂率81.6％)；分别给予1次、2次和3次150V／mm，60us的电刺激，均可激活卵母细胞，但随脉冲次数增加，裂解率增加，以2次电脉冲效果较好(无裂解卵母细胞，卵裂率71.4％)；体外成熟40，44，48和52h猪卵母细胞用2次150V／mm，60us电刺激激活，卵母细胞裂解率为0.0％、0.0％、0.0％和10.7％，卵裂率为66.7％、75.0％、82.8％和84.0％，以IVM 48h卵母细胞得到较好结果。 3．在有无颗粒细胞饲养层基础上，分别用M199+10％FBS和NCSU-23为培养液培养猪孤雌激活卵母细胞。结果表明，无论有无饲养层，以M199+10％FBS为培养液时卵裂率均低于以NCSU-23为培养液的卵裂率，有显着性差异；以NCSU-23为培养液无饲养层培养猪激活卵母细胞，卵裂率为93.2％，囊胚率为31.8％。人一猪异种细胞核移植研究4.分别用分离单细胞接种培养和组织块培养两种方法成功分离人胎儿成纤维细胞和 成体皮肤成纤维细胞。利用成纤维细胞和上皮细胞贴壁时间和对消化液敏感程度不 同，可以对成纤维细胞进行纯化。两种不同来源成纤维细胞经冷冻保存，解冻后复 苏存活率为88.7%和857%。第3代冷冻解冻后成体皮肤成纤维细胞染色体组型: Zn二46，根据着丝粒指数分为4组，1.5号为中部着丝粒，6一12号为亚中部着丝粒， 13一22号为近端着丝粒，23号为性染色体。表明，两种来源细胞在传代初期保持了 良好的生活形态，经取材，保存和传代消化等处理没有引起染色体水平的变异。5.通过胞质内注射法将供体细胞核移入体外成熟43一44h去核猪卵母细胞内，电刺激 激活重构胚。比较人胎儿/成体成纤维细胞作为核供体时对核移植的影响，卵裂率 分别为47.8%和46.7%，无显着性差异(P>0.05);正常换液和传代的人胎儿成纤 维细胞与经高密度抑制培养的人胎儿成纤维细胞用作核供体进行核移植，卵裂率分 别为39.0%和40.4%，无显着性差异(P>0.05):以NCSU一23为培养液，采用微滴 法和四孔板法培养核移植重构胚，卵裂率分别为44.4%和47.4%，桑堪胚率为7.1% 和8.9%，无显着性差异(P>0.05)。6.用胞质内直接注射法将人胎儿成纤维细胞注入猪卵母细胞构建人一猪异种重构胚， 卵裂率为47.4%，囊胚率为0.7%。表明猪卵母细胞胞质可以对人胎儿成纤维细胞 重新编程并支持重构胚的早期发育。
项智锋[7]2004年在《猪体细胞核移植及相关技术研究》文中研究表明1．以猪卵巢卵母细胞为研究对象，进行卵母细胞体外成熟培养，对影响该技术的几项重要因素即卵母细胞状态、培养基、培养基添加物进行研究分析，结果表明：(1)来源于不同直径卵泡和不同分级的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)在体外成熟中成熟能力差异显着，直径2-6ram卵泡GOEs成熟率80.7％，大于6mm卵泡COCs成熟率81.2％，均显着高于小于2mm卵泡COCs成熟率(36.5％，P＜0.05)。A、B级COCs成熟率极显着于C级(P＜0.01)，叁者成熟率分别为80.7％、80.2％，21.2％。(2)TCM199、NCSU-23两种不同的培养液对猪卵母细胞体外成熟培养卵母细胞成熟率无明显差异(79.8％，80.6％，P＞0.05)。(3)基础培养基中添加促性腺激素PMSG、hCG能显着提高猪卵母细胞体外成熟率(添加PMSG、hCG组分别为：80.5％、77.2％、84.0％，未加组：62.5％、50.5％)；类固醇激素E2当与PMSG、hCG协同作用时对卵母细胞的体外成熟有支持作用，且激素作用时间为24h时成熟率最高(84.0％)；而再添加生长激素rpGH则作用不大(浓度为10ug/ml、20ug/ml、0成熟率分别为：80.4％、75.7％、77.5％，叁组差异不显着P＞0.05)；卵泡液对卵母细胞体外成熟具有促进作用(添加组：81.4％、81.8％，未加组：50.6％)，添加组成熟率显着高于未添加组(P＜0.05)。 2．以卵丘细胞为供核体细胞，采用胞质内注射法进行猪体细胞核移植，对去核、激活和培养等关键技术过程进行研究，结果表明：(1)点压法、挤压法对卵母细胞去核去核率明显高于盲吸法(叁者分别为62.5％，64.6％，50.7％，P＜0.05)。盲吸法去核染色体容易发生位置偏离，影响去核效果，但对早成熟的卵母细胞(36-44h)进行去核可明显提高去核效率(P＜0.05)，在36-38h、39-41b、42-44h去核率分别为60.9％、67.8％、64.3％，而45-48h为48.4％。(2)体细胞预激活有助于提高核移胚卵裂率(28.0％，20.1％，P＜0.05)。钙离子载体A23187单独或与6-二甲基氨基嘌呤6-DMAP联合作用能使猪体细胞核移胚激活继续发育。(3)核移胚以NCSU23及卵丘颗粒单层饲养TCM199培养系统进行分别培养，核移胚卵裂率无明显差异(30.06％，31.5％，P＞0.05)。但NCSU23培养4细胞后发育能力更高(13.5％，3.9％，P＜0.05)。
王爱萍[8]2007年在《不同激活方法对猪卵丘细胞核移植效果的影响》文中研究说明成熟卵母细胞移核后的激活是核移植的关键步骤之一，卵母细胞激活率的高低直接影响核移植的效率。当前核移植效率低下，其原因之一就是受体卵母细胞未被充分激活。到目前为止，已对多种哺乳动物卵母细胞孤雌激活进行了一系列研究，但有关猪成熟卵母细胞移核后体外激活的研究尚不够深入。本试验以体外成熟的猪卵母细胞为材料，通过胞质内注射方法将卵丘细胞移入卵母细胞4.5h后，以电脉冲、CHX(cycloheximide)和6-DMAP为人工刺激条件，单一激活和联合激活为基本激活方法，以重构胚的卵裂率和8细胞以上胚胎发育率为检测指标，研究不同激活方法对猪体细胞核移植重构胚激活效果的影响，并与移核前进行预激活、移核4.5h后再进行单一电激活的试验组结果相比较研究激活问题，以寻找一种猪卵母细胞较好的人工激活方法，为提高猪核移植技术的成功率提供技术参考。根据对试验数据的分析，得到以下几点结论：1、电激活参数的优化选择将在38.5℃、5％CO_2和饱和湿度下平衡4.5h后的重构胚放到电激活液中孵育5min。以不同的电场强度(1.0 KV·cm~(-1)，1.3 KV·cm~(-1)，1.6KV·cm~(-1)，1.9KV·cm~(-1))和不同脉冲次数(1次，2次，3次)80μs对重构胚进行激活，试验结果如下：电场强度对核移植效果的影响：当场强为1.0 KV·cm~(-1)时，重构胚的的卵裂率和8细胞以上胚胎率分别只有22.50％(27／120)和2.50％(3／120)，低于场强1.3 KV·cm~(-1)组的卵裂率(32.50％，39／120)和8细胞以上胚胎率(5.00％，6／120)，差异显着(P＜0.05)。说明电场强度低于1.3 KV·cm~(-1)时，电刺激较弱不足以使重构胚获得充分的激活。当场强高于1.3 KV·cm~(-1)时，如场强为1.6 KV·cm~(-1)和1.9 KV·cm~(-1)时，重构胚的卵裂率和胚胎发育率都有所下降，特别是当场强为1.9 KV·cm~(-1)时，其卵裂率(25.83％，28／120)和8细胞以上胚胎率(0.83％，1／120)都明显低于场强为1.3 KV·cm~(-1)组，差异极显着(P＜0.01)，说明当场强高于1.3 KV·cm~(-1)时，随着场强的升高，核移胚的卵裂率和胚胎发育率逐步下降。电脉冲次数对核移植效果的影响：在场强为1.3KV·cm~(-1)脉宽80μs条件下，一次脉冲，重构胚的卵裂率和8细胞以上胚胎率分别为32.50％(39／120)和5.00％(6／120)，都高于脉冲2次脉冲(26.67％，32／120；1.67％，2／120)和3次脉冲(22.50％，27／120；1.67％，2／120)组，差异极显着(P＜0.01)。脉冲为2次和3次组，卵裂率和8细胞以上胚胎率都无显着差异(P＞0.05)，但随着脉冲次数的增加有减少的趋势。以上结果表明：固定80μs的脉冲宽度选择1.3KV·cm~(-1)电场强度，一次脉冲的电激活条件对猪卵母细胞进行刺激，可以获得较好的胚胎发育率。2、不同放线菌酮浓度对核移植效果的影响：以上一步试验的结果为依据，将在38.5℃、5％CO_2和饱和湿度下平衡4.5h后的重构胚放到电激活液中孵育5min。对重构胚以1.3KV·cm~(-1)、80μs和一次脉冲参数进行电激活后，再置入含不同浓度(4μg／ml、7μg／ml、10μg／ml、13μg／ml)CHX的NCSU-23中处理4小时。试验结果：用7μg／ml和10μg／ml CHX处理4小时，其卵裂率分别为42.50％(51／120)和40.83％(49／120)，高于4μg／ml组和13μg／ml组的卵裂率(32.50％，39／120；26.67％，32／120)，差异显着(p＜0.05)。其8细胞以上胚胎率分别为6.67％(8／120)、7.50％(9／120)，也显着高于4μg／ml组(0.83％，1／120)和13μg／ml组(0.83％，1／120)，差异极显着(P＜0.01)。而7μg／ml组和10μ／ml组在卵裂率和8细胞以上胚胎率差异都不显着(P＞0.05)。结果表明：核移胚经电激活处理以后，放在含有7μg／ml～10μg／ml之间浓度放线菌酮的胚胎液中处理4小时效果最佳。3、不同6-DMAP浓度对核移植效果的影响：以第一步试验的结果为依据，将在38.5℃、5％CO_2和饱和湿度下平衡4.5h后的重构胚放到电激活液中孵育5min。以1.3KV·cm~(-1)、80μs和一次脉冲参数对重构胚进行电激活后，再置入含不同浓度(0.5mM／L、1mM／L、2mM／L、4mM／L、6mM／L)6-DMAP的NCSU-23液中平衡4小时。试验结果：当浓度为0.5mM／L、1mM／L和2mM／L时，随着浓度的增加其8细胞以上胚胎率(3.33％，4／120；5.83％，7／120；9.17％。11／120)逐渐增加，卵裂率(38.33％，46／120；40.00％，48／120；40.83％，49／120)也略有增加，但变化不明显；当6-DMAP浓度达到4mM／L时，其卵裂率(45.83％，55／120)和8细胞以上胚胎率(13.33％，16／120)均高于其它试验组，差异显着(p＜0.05)；此时再增加6-DMAP浓度如6mM／L组，其卵裂率(38.33％，46／120)和8细胞以上胚胎率(7.50％，9／120)反而下降，明显低于4mM／L试验组，差异极显着(p＜0.01)。试验结果表明：当6-DMAP浓度小于4mM／L时，随着浓度的增加，核移胚的发育率也增加。当6-DMAP浓度大于4mM／L时，随着浓度的增加，核移胚的卵裂率和8细胞以上胚胎率则逐渐下降。4、不同联合激活方法对核移植效果的影响：本试验采用前面试验所得的最佳电激活参数与最佳放线菌酮和6-DMAP浓度，以电激活为对照组，比较了电激活+CHX与电激活+6-DMAP联合激活方法对猪体细胞核移植的效果，结果显示：电激活+CHX组与电激活+6-DMAP组的卵裂率(40.83％，49／120；45.83％，55／120)和8细胞以上胚胎率(7.50％，9／120；13.33％，16／120)都高于电激活组的卵裂率(32.50％，39／120)和8细胞以上胚胎率(5.00％，6／120)，差异显着(p＜0.05)。说明电刺激以后再用CHX或6-DMAP处理均能显着提高卵裂率和胚胎的发育率。电激活+6-DMAP的卵裂率(45.83％，55／120)和8细胞以上胚胎率(13.33％，161120)都高于电激活+CHX组的卵裂率(40.83％，49／120)和8细胞以上胚胎率(7.50％，9／120)，差异显着(p＜0.05)，说明6-DMAP与电脉冲的联合效果好于CHX与电脉冲的联合效果。试验说明电激活+6-DMAP为理想的激活手段。5、预激活去核卵母细胞胞质对核移植效果的影响：本试验把去核后的受体胞质用电脉冲进行预激活或无激活处理，然后再进行直接胞质内注核操作，移核后再用电脉冲给予激活处理，比较两种方法对核移植效果的影响。试验结果：激活组和对照组的卵裂率分别为25.83％(31／120)和32.50％(39／120)，后者高于前者，差异极显着(p＜0.01)，8细胞以上胚胎率两组分别为2.50％(3／120)和5.00％(6／120)，后者也高于前者，差异显着(p＜0.05)。说明预激活不能提高胚胎的发育效果，对胚胎的发育是不利的。核移植过程中直接用去核卵母细胞作胞质受体可以获得较好的胚胎发育效果。综上所述，在猪卵丘细胞核移植过程中，在核移植前对卵母细胞进行预激活和核移植后再进行补充激活的方法不能够使其重构胚胎获得良好的发育效果；选用不预激活的MII期卵母细胞胞质作为核受体进行核移植，移入的供体核在这种高MPF活性的胞质环境中作用4.5h，使其完成核膜破裂、核质互作和早熟染色质凝集后，对重构胚采用1.3 KV·cm~(-1)、80μs和一次脉冲的电脉冲进行激活，降低MPF的活性，重构胚胎的发育效果有所改善；通过以上电激活后再转入含4mM／L 6-DMAP的NCSU-23培养液中处理4小时，补充激活重构胚，再使MPF的活性进一步降低，能够使移入的体细胞核既受到高MPF作用发生染色质的重塑，又能及时进入低MPF活性的充分激活状态，使移入的体细胞核转变成胚性原核，从而获得较好的胚胎发育效果。因此，本试验条件下所获得的优化方法是：将移核4.5h的卵母细胞质进行电激活后再使用6-DMAP化学物质进行补充激活4h，重构胚胎的卵裂率和8细胞以上胚胎发育率分别为45.83％和13.33％，与其它方法相比均存在显着的差异。
胡军和[9]2005年在《猪体细胞核移植研究》文中研究表明本研究以猪卵母细胞为主要材料,体外成熟培养猪卵母细胞,同时分离培养颗粒细胞与胎儿成纤维细胞作为供核细胞,对卵母细胞成熟培养、孤雌激活和核移植的影响因素进行了探讨,为进一步进行转基因猪的研究奠定了基础。实验主要结果如下:(1)研究了不同时间段添加外源激素及不同基础培养液和血清有无对猪卵母细胞体外成熟的影响。实验包括,①猪卵母细胞以TCM199+10% FBS+10IU/mL Pregnant Mare Serum Gonadotrophin(PMSG)+10 IU/mL Human Chorion Gonadotrophin(hCG)+2.5 IU/mL Follicle Stimulate Hormone (FSH)为成熟培养液体外培养44 h,前22 h在培养液中加入激素,后22 h 不加入激素及前22 h不加激素,后22 h添加激素和添加激素连续培养44 h;②以实验①中激素添加的方案在体外添加激素连续培养44 h,对不同基础培养液(TCM199 粉剂、TCM199 原液和改良TCM199(mM199))对猪卵母细胞体外成熟进行了研究; ③以实验②中筛选出的mM199组为成熟培养液对比血清有无对猪卵母细胞体外成熟的影响。结果表明,实验①中3 种激素添加不同时间段其成熟率分别为45.67%、45.29%和46.07%,对猪卵母细胞体外成熟无显着影响(P>0.05);实验②中,mM199 组的成熟率(54.10%)高于TCM199 粉剂组的成熟率(46.16%)及TCM199 原液组的成熟率(47.14%),但差异不显着(P>0.05);实验③中无血清组的成熟率(67.10%)高于有血清清组的成熟率(52.22%),差异显着(P<0.05)。由此可见,mM199 +10 IU/mL PMSG+10 IU/mL hCG+2.5 IU/mL FSH 是一种适合于猪卵母细胞体外成熟的培养液,体外成熟率达67.10%。(2)研究了离子霉素、电场强度、电脉冲次数和电刺激-化学联合激活对猪卵母细胞孤雌激活的影响,以出现分裂球为激活的标准。结果表明:①10 μM 离子霉素处理5 min的激活率60.71%(17/28)与处理10 min、15 min的激活率62.50%(15/24)、65.22%(15/23)差异不显着(P>0.05)。②以电场强度120 v/mm,脉冲次数3 次处理猪卵母细胞的激活率66.67%(30/45)与60 v/mm、80 v/mm、100 v/mm 的激活率40.98%(17/42)、44.11%(15/34)、46.19%(18/39)有显着差异(P<0.05),但与140 v/mm、160 v/mm 的激活率63.89%(23/36)、64.10%(25/39)无显着差异(P>0.05)。③以电场强度120 v/mm,不同电脉冲次数进行激活。以2 次电脉冲激活猪卵母细胞的激活率67.40%(31/46)与1次、2 次电脉冲的激活率62.80%(27/43)、68.30%(28/41)无显着差异(P>0.05)。④以电场强度120 v/mm,2 次电脉冲与10 μM 离子霉素处理5min 联合激活猪卵母细胞的激活率84.84%(29/33)与只用电场强度120 v/mm,2 次电脉冲的激活率64.67%(23/34)差异显着(P<0.05)。实验结果表明:电场强度120 v/mm,2 次电脉冲与10 μM 离子霉素处理5min 联合处理激活能有效提高猪卵母细胞孤雌激活的激活率。(3)本研究利用成熟后的卵母细胞的颗粒细胞,可以简单而快速的进行颗粒细胞的分离与培养;用室温消化法可以分离培养单个细胞分别获得猪胎儿成纤维细胞;在进行冷冻保存后可以成功解冻猪胎儿成纤维细胞(其存活率为83.5%);这样为以后的核移
胡林林[10]2014年在《利用体细胞核移植技术生产转hGFAP-DsRed基因巴马小型猪的初步研究》文中指出细胞基因修饰技术和体细胞核移植技术相结合成为生产转基因动物的一种有效方法。小型猪在体积、新陈代谢、器官组织结构和基因组等方面都与人的极为相似,是人类疾病模型的首选动物。转基因克隆猪的生产对农业、生物医学和基础研究都具有重要的应用价值,目前猪的克隆效率低,限制了其在多个领域的应用。因此,本研究是为建立高效稳定的转基因克隆猪的生产平台,并在此基础上优化转基因克隆猪生产的技术程序,以期提高转基因克隆猪的生产效率,为转基因克隆猪更广泛的应用奠定基础。本研究的试验方法和结果简述如下：1.巴马小型猪体细胞的分离培养本实验从出生3日的巴马小型猪成功分离出了巴马小型猪肾脏成纤维细胞、耳部成纤维细胞和睾丸成纤维细胞。对细胞类型进行免疫组化染色鉴定时,肾脏成纤维细胞、耳部成纤维细胞和睾丸成纤维细胞,抗波形蛋白均显阳性,抗角形蛋白显阴性。根据组织来源、细胞的形态及免疫组化结果表明：本实验成功分离出叁种组织来源的成纤维细胞。2.转基因细胞系的建立及其生物学特性的研究转基因克隆胚胎生产中,建立高质量的转基因阳性细胞系是获得克隆动物的关键。本章试验结果如下：细胞转染hGFAP-DsRed基因后,经博莱霉素筛选获得了肾脏、睾丸和耳部细胞转基因克隆斑,PCR鉴定结果与目的片段大小一致,所获得的克隆斑为转基因体细胞。检测了转基因细胞是否被微生物(细菌、真菌、病毒)污染,叁种转基因细胞的培养液均未见浑浊现象,结果表明,转基因肾脏、睾丸和耳朵成纤维细胞均未被细菌和真菌污染；用红细胞吸附实验检测转基因细胞系是否被病毒污染,结果未见细胞凝聚成团或者与体细胞吸附,表明3种不同组织来源的转基因成纤维细胞未被病毒污染；采用PCR和Hoechst33342染色检测支原体污染,结果为阴性；分析不同代次转基因细胞的核型,结果表明,随着代次的增大正常2倍体细胞的比率有降低的趋势,但差异不显着；对转基因细胞系进行了长期的传代培养,转基因肾脏成纤维细胞目前已传至56代,转基因耳部成纤维细胞传至30代,转基因睾丸成纤维细胞传至25代。总之,本试验成功建立了3种类型转基因细胞系,为后续的体细胞核移植实验提供了高质量,充足的转基因供体细胞。3.转基因克隆胚胎融合/激活条件的优化融合/激活是体细胞核移植重构胚胎构建关键的一步,只有经过融合、激活的胚胎才能开始重编程,启动基因表达,继续发育。本实验优化了转基因克隆胚胎融合/激活的参数,结果如下：脉冲时程30μs,1次脉冲,场强1.5kv/cm组,融合率(87.32%)和分裂率(69.79%)显着高于1.0KV/cm(78.63%,45.07%)和2.0kv/cm(63.87%,36.72%)。囊胚率显着高于1.0kv/cm和2.0kv/cm (21.74%vs.9.65%,5.49%,P<0.05);脉冲时程30μs时,融合率(81.92%)和囊胚率(19.56%)显着高于20μs(69.19%,7.51%)和40μs (69.28%,6.51%), (P<0.05);3次脉冲组的融合率(63.32%vs.81.92%,81.59%,P<0.05)、分裂率(38.09% vs.63.40%,67.46%,P<0.05)和囊胚率(5.49% vs.33.15%,12.97%,P<0.05)均显着低于1次脉冲和2次脉冲组；而在相同脉冲次数和脉冲时间下,转基因克隆胚胎需要的场强相对要大。总之,本实验室条件下,最适合于转基因克隆猪胚胎生产的融合/激活参数是1.5kv/cm、30μs和1次脉冲。4.供体细胞的细胞周期、细胞种类和细胞代次对转基因克隆胚发育的影响供体细胞所处的细胞周期,细胞种类和细胞代次对体细胞核移植胚胎的发育潜能有很大的影响,本实验检测了血清饥饿、Roscovitine和接触抑制法对转基因细胞同期化效果以及叁个处理组细胞作为供体核对重构胚胎发育能力的影响；比较了不同类型的转基因供体细胞作为供体核对构建重构胚胎发育潜能的影响；采用第10、20、30代的转基因肾脏成纤维细胞作为供体核,研究细胞的代次对转基因克隆胚胎发育潜能的影响。研究结果如下：叁种同期化方法均能将80%以上的细胞处于G0/G1期,接触抑制和roscovitine组显着高于血清饥饿组(92.11%,89.59% vs.80.82%,P<0.05)；相反,处于S期的细胞,血清饥饿组显着高于接触抑制组和roscovitine(14.99% vs.2.54%,6.34%,P<0.05)；处于G2/M期的细胞,叁组之间差异不显着(P>0.05)；血清饥饿组、接触抑制组和roscovitine处理组,细胞凋亡率分别为(14.13%,6.71%,2.46%),血清饥饿组细胞凋亡率显着高于另外两组(P<0.05)。检测了叁个处理组的细胞BAX, BCL-2的相对表达量,BAX的表达量以血清饥饿组最高,而血清饥饿组BCL-2表达量最低。结果表明：血清饥饿能够增加转基因细胞的凋亡率,roscovitine能够降低转基因细胞的凋亡率；以叁种细胞为供体核所获得囊胚率,血清饥饿组显着低于roscovitine组和接触抑制组(14.2%vs.21.30%,20.3%,P<0.05)。转基因肾脏成纤维细胞、耳部成纤维细胞和睾丸成纤维作为供体核构建的克隆胚胎囊胚发育率差异不显着(18.08%,10.19%,10.76%,P>0.05)。结果表明：叁种类型的转基因细胞均支持克隆胚胎的发育,以肾脏成纤维细胞为供体时囊胚率最高,肾脏成纤维细胞更适合于转基因克隆猪生产的核供体细胞。5. Oxamflatin对转基因克隆猪胚胎发育的影响体细胞核错误的表观遗传重编程是引起克隆低效率的主要原因,有研究表明,通过添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂,如oxamflatin能够提高体细胞核移植胚胎的发育潜能,本实验研究oxamflatin对猪转基因克隆胚胎发育的影响。结果如下：用1μM 的 oxamflatin处理克隆胚胎12h,与对照组相比能够显着提高转基因克隆猪的发育能力(29.63%vs.17.53%, p<0.05), oxamflatin能够改变AcH4K8的表观遗传状态,提高了转基因克隆胚胎2-cell,囊胚期胚胎的组蛋白乙酰化水平,使AcH4K8组蛋白乙酰化水平更接近与体外受精(IVF)胚胎,显着提高了转基因克隆猪胚胎的体外发育能力,oxamflatin能够提高与胚胎发育相关多能基因(Oct-4, Sox-2, Nanog)和抗凋亡基因(BCL-2)的相对表达量,降低促凋亡基因(BAX)的表达。总之,组蛋白乙酰化酶抑制剂oxamflatin能够改变转基因克隆胚胎的表观遗传状态和基因表达,增加囊胚率,提高核的重编程能力和胚胎的发育潜能。6.利用本研究建立的体系进行胚胎移植,胚胎移植后获得3头克隆猪,经PCR扩增、制作冰冻切片在荧光显微镜下观察和Western Blotting等方法进行初步鉴定,其中一头被鉴定为转hGFAP-DsRed基因阳性克隆猪。
参考文献：
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[10]. 利用体细胞核移植技术生产转hGFAP-DsRed基因巴马小型猪的初步研究[D]. 胡林林. 广西大学. 2014
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