周生[1]2002年在《禽传染性支气管炎病毒N基因RT-PCR、克隆及序列分析》文中研究指明禽传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Vires，IBV)N基因编码该病毒核衣壳蛋白(Nucleocapsid Protein)，是IBV相对稳定和保守的基因，对N基因进行研究，在IBV的检测、血清学分型、免疫特别是研制高效的DNA疫苗中具有重要意义。本研究对2株禽传染性支气管炎病毒标准毒株M_(41)、H_(120)和3株四川地区分离株SAIB_(WJ)、SAIB_(20)、SAIB_(14)的N基因进行RT-PCR、克隆和序列测定分析，并对其编码蛋白进行了分析，主要结果如下： 1．根据国际基因库Genbank公布的禽传染性支气管炎病毒N基因序列经多重比较设计的一对引物，对5株IBV(M_(41)、H_(120)、SAIB_(WJ)、SAIB_(20)、SAIB_(14))进行了RT-PCR扩增，5株均获得了长约1.2kb的特异扩增条带。将5株IBV毒株RT-PCR特异扩增产物定向插入到pUC18质粒多克隆位点，构建了含N基因的克隆质粒，转化DH_(5u)载体菌，筛选获得阳性克隆菌株。 2．对3个克隆质粒中的目的基因片段进行序列测定，结果表明该片段含有IBV N基因全序列，其结构基因全长1227bp，编码409个氨基酸。在国内首次将四川分离的3株IBV的N基因序列在国际基因库Genbank中注册，注册号SAIB_(WJ)为AY121091，SAIB_(20)为AY121092，SAIB_(14)为AY121093。 3．将3株四川分离株N基因序列用Bioedit软件与国内外已经在国际基因库Genbank中注册的IBV标准株M_(41)N基因进行同源性分析，结果表明SAIB_(WJ)、SAIB_(20)、SAIB_(14)N基因核苷酸序列与M_(41)N基因同源率分别为97.7％、93.1％、98.0％，相应的氨基酸序列同源率分别为96.5％、94.1％、97.5％。用ANTHEPRO软件对19株IBV毒株核蛋白保守区域分析结果表明，19株毒株存在15个氨基酸以上的完全保守区域3个，分别在87～102位、143～159位、254～268位。将四川分离株N基因序列用Phylip软件与国内外已经在国际基因库Genbank中注册的16株IBVN基因全序列进行系统进化树分析，结果表明，SAIB_(WJ)、SAIB_(14)与H_(52)、M_(41)的亲缘关系最近：SAIB_(20)与Gray、Ark99、De072的亲缘关系最近，结果与血清学分型一致。 本研究克隆并测定出了3株IBV四川分离株的N基因，丰富了IBV分子流行病学资料，为进一步研究IBV的分子水平检测方法，研制IB DNA疫苗提供了基础材料。
贺秀媛[2]2002年在《鸡传染性支气管炎病毒LX4株主要结构基因的研究》文中认为细菌、病毒等所产生的生物性毒物对机体的代谢、繁殖机能有着重要的影响，目前对细菌毒素的研究比较透彻，已经上升到分子水平，特别是通过病原微生物全基因组序列的测定，使人们从更高层次上把握病原微生物的致病机理及其规律成为可能。到目前为止，已完成了近10个细菌全基因组序列的测序工作，更多细菌的全基因组序列正在进行中。细菌全基因组序列测序工作的完成将给人类分析和研究编码细菌毒性蛋白的毒力基因、认识和阐明毒性蛋白的毒理带来新的机遇。而对病毒这方面的研究相对滞后，为了探讨病毒对细胞、组织的毒性作用及其毒理，分析病毒基因组中主要结构基因在致病和免疫中的功能，研制阻断病毒与细胞融合的药物及其有效的疫苗，为其防制提供全新的思路，就必须以基因组的分析为基础。本研究首先分离鸡传染性支气管炎病毒我国地方流行毒株(IBV-LX4)，然后进行形态学和生物学特性的鉴定并进行蚀斑纯化。在此基础上，根据国内外已发表的IBV基因序列，分别设计特异性引物，应用不同引物进行反转录合成cDNA，分片段对IBV的主要结构基因进行PCR扩增，并分别将各个目的片段克隆到pUC19载体上，在大肠杆菌DH5α中实现目的基因的分子克隆，经蓝白斑筛选、限制性内切酶分析、PCR鉴定，筛选出重组阳性质粒，并对各个目的基因片段进行序列测定，从而获得IBV主要结构基因全序列。通过计算机分析软件，对我国IBV地方流行毒株LX4的主要结构基因全序列、分子特征及遗传变异进行分析比较，并初步分析预测传染性支气管炎病毒主要结构蛋白上可能存在的T细胞和B细胞表位。实验结果表明： 1．生物学特性：鸡胚尿囊液经离心、磷钨酸负染后，电镜观察该病毒为典型的冠状病毒；该毒株的第一代尿囊液对鸡胚无肉眼可见的致病作用，当继代到第5代后，胚体严重病变；病毒在鸡胚中随着接种时间的延长，其效价增高，96h可达到48h的2倍；该毒株可在CEF上生长，但不能形成明显的蚀斑；经1％胰酶处理后可凝集鸡红细胞；鸡胚的第四代尿囊液病毒回归动物体，病死鸡肾脏呈典型的花斑肾，腺胃则未见肉眼可见的病变。证明分离到的病毒为鸡传染性支气管炎病毒。 2．S1基因：其全序列共1614bp(从起始密码子ATG到S前体蛋白裂解位点)，编码537个氨基酸，其氨基端有一编码18个氨基酸的信号肽序列，第12～13位氨基酸残基构成了信号肽的切割位点，14～19位与111～124位氨基酸残基为S1蛋白的跨膜区域。S1蛋白中含有19个高度保守的潜在的糖基化位点及17个半胱氨酸。同源分析结果显示不同毒株S1基因均存在基因缺失、基因替换和基因插入等变异现象。S1基因除与QX的亲缘关系较近外，与其它参考株的同源率均低于80％，可能为一株国内流行性的变异株。 3．S2基因：核苷酸序列全长2023bp，编码625个氨基酸，包含完整的阅读框架，其中SZ C端约560—595位之间的35个氨基酸高度疏水，216～232位氨基酸残基与412～417位氨基酸残基为其另外的两个跨膜区。SZ基因序列中含有 19个半肤氮酸，13个糖基化位点。在 SZ与 SI交界处的切割序列为 HANRR。SZ N端第一个氨基酸为色氨酸（Ser），C端 560～587为一山正电荷组成的区域，古有两个长的 a－螺旋。SZ较为保守，其变异主要表现为点突变，且C端比N端的保守程度更大。与其他毒株之问核昔酸序列的同源性为幻％－引％，氨基酸序列的同源率为86％～N％。 4．A／I基回。序列全长678hi，，编码：125个氨基酸，包含完整的阅读框架，含有两个糖基化位点，9个高度保守的半肤氨酸，25～35位、52～95位之间的氨基酸残基为其两个跨膜区域，35～45位与88～98位之间的氨基酸残基为其两个信号肽，41位、92位氨基酸处为信号肽的切割位点。问源分析发现不问毒株间M基因存在着缺失、插入、及点突变等变异现象，且5”末端易发生变异，3”木端较为保守；与其他毒株 IBV M 基因核昔酸序列的同源性为 85％－100％，氨基酸序列的同源性为83％～100？／o。 5．N基因：全序列为1230hp，编码409个氨基酸，包含完整的开放阅读框架。其变异主要表现为基因缺失、基因替换和基因插入，且变异没有集中区域的高变区。与其他毒株间（除V18／91外）核昔酸序列的同源性为85％～99％，氨基酸序列的同源率为83％～91％。 综合以上实验结果，本实验得出以下结论： l）生物学实验证实国内地方分离株 I．X4为鸡传染性支气管炎病毒。 幻首次克隆并测定了我国地方分离株LX4的主要结构基因核合酸序列，实验证实编码纤突蛋白巧）、膜蛋白 ＊）和核蛋白＊）的基因均存在基囚插入、缺夫与点突变现象，而SZ基因仅表现为点突变。 3）各结构基因的变异程度不同，纤突蛋白SI基因的变异最大，纤突蛋白SZ的变异次之，膜蛋白基因最为保守，其N端前42位氨基酸较易变异，C端更为保守。核蛋白中间比两端保守。基于SI基因高变区（前500m）。整个引基因、N基因的基因分型结果是一致。 4）LX4株纤突蛋白裂解位点处氨基酸的组成为 Hll］ll；UI，这种序列的毒株不同于已报道的其它传染性支气管炎病毒。 引首次预测了其主要结构蛋白
磨美兰, 韦平, 李康然[3]2000年在《应用RT-PCR及RFLP技术对鸡传染性支气管炎病毒进行诊断与分型的研究进展》文中认为本文概述了近年来国内外应用 RT PCR及 RFLP技术对鸡传染性支气管炎病毒 ( IBV)进行诊断与分型的研究进展。主要介绍以 IBV通用引物的 RT PCR进行诊断及其应用、型特异引物的 RT PCR及其应用以及 RT PCR结合 RFLP分析技术进行分型的应用 ,而且还展望了这些技术在临床诊断及分子流行病学研究上的应用前景
丁红梅[4]2001年在《禽传染性支气管炎病毒新的变异株核衣壳基因的克隆及在大肠杆菌中的表达》文中进行了进一步梳理本研究用Tizol试剂直接从尿囊液中抽提病毒核酸，参考已报道的IBV－ Beaudette核衣壳基因，自行设计—对引物，以IBV—N毒株（肾型）、ZJ971 毒株（腺胃型）和一个参考疫苗毒株H52为模板，用RT－PCR扩增它们的核衣 壳基因，将扩增得到的cDNA克隆入pBluescript SK载体中。用Lasefgene analysiS软件分析它们的核苷酸和推导的氨基酸序列。在此基础上，把ZJ971 毒株核衣壳基因克隆到pBV220表达载体，利用大肠杆菌进行原核表达，并 用Western－blotting检测。结果显示： ZJ971毒株、N毒株、H52毒株的核衣壳基因ORF全长都为1230个核苷 酸，均编码一条409个氨基酸组成的多肽。 腺胃病变型IBV－ZJ971毒株与其他各血清型IBV的核昔酸同源性在 87．0％—98．6％之间，氨基酸同源性在91．0％一98．1％之间。171位氨基酸突 变导致这一区域的亲水性大为增强，但283位氨基酸突变导致邻近的282位 亲水性下降，使其最大疏水峰由 197位移到282位。系统进化分析表明 ZJ971 毒株与DI 466、Cu／TZ毒株的亲缘关系较近，它们可能有共同的祖先。 肾病变型IBV-N毒株与其他各血清型IBV的核苷酸同源性均不高（86．6％ —87．4％），氨基酸同源性在90．5－91．7％之间。其中189-190、223、236、286、 334-336位氨基酸的突变使上述5个区域的亲水性明显下降，240、301位氨 基酸的突变使这两个区域的亲水性稍有上升，整个蛋白的平均亲水值比其 它IBV小。系统进化分析表明N毒株与其它毒株（包括肾病变型Gray）的亲 缘关系均较远，处于相对独立的一支。 综合上述结果进一步从核衣壳蛋白基因角度证实 ZJ971 毒株、N毒株 是不同于其它各型IBV的新的变异株。 Western-blotting 只在重组表达菌样品中检测出一条约45kD的特异性蛋 白条带，与预期的蛋白分子量大小一致，表明 IBV－ZJ97毒株的核衣壳蛋 白确实在大肠杆菌中获得了高效表达，表达的核衣壳蛋白具有一定的金免疫 反应性，为进一步研究和开发IBV基因工程苗奠定基础。
王宪文[5]2002年在《传染性支气管炎病毒地方分离株的RFLP和序列分析》文中研究表明用扩增片段为0.2kb、0.6kb、1.7kb的叁对引物分别对传染性支气管炎病毒6株标准株：M_(41)、Holte、Arka、Conn、Gray、T和8株地方分离株：宜、138、广32、云、S_AIBV14呼、Am、J_7、张IBV进行RT-PCR，结果以0.6kb片段引物扩出的毒株最多：6株标准株中的5株：M_(41)、Arka、Conn、Gray、T；8株地方分离株中的6株：广32株、J_7株、张IBV株、Am株、宜株、138株。0.2kb片段长度的引物可扩增出2株标准株：M_(41)株和Connecticut株和2株地方分离株：S_AIBV14#呼和Am株；而1.7kb长度片段的引物只扩增出了标准株M_(41)和地方分离株138株。取各毒株0.6kb片段PCR产物，分别用叁种限制性内切酶AluⅠ、TaqⅠ和AfaⅠ进行酶切，然后根据标准株的酶切模式对各地方分离株进行RFLP分型(AfaⅠ酶切均为阳性)，可将参考株分为如下叁种模型①M_(41)模式：AluⅠ酶切、TaqⅠ酶切均有特异的条带；②Ark株、G株、C株模式：AluⅠ酶切阳性而TaqⅠ酶切阴性；③T株模式：AluⅠ酶切阴性而TaqⅠ酶切阳性。然后根据标准株的酶切模式对各地方分离株进行RFLP分型，可将各地方分离株分为①M_(41)模式有：广32株、J_7株、张IBV株、Am株②Ark株、G株、C株模式有138株、宜株。这表明我国IBV血清型众多，但以M_(41)为代表的呼吸型传支占比例最大(50％)，宜株为代表的肾型传支也有一定数量(25％)。将地方分离株宜株的0.6kb片段的扩增产物进行测序并与标准株Ark株、G株、C株和标准株M_(41)的相应序列进行分析比较，认为该地方分离株是以点突变为主并可能伴有基因插入、基因缺失和基因重组的新的IBV变异株，氨基酸同源性的分析显示叁株呼吸性毒株M_(41)、H_(52)、H_(120)同源性极高分别为95.8％、97％、98.8％；宜毒株与同一酶切类型的Ark株、G株、 C株的同源性分别为91．6％、SS％、85％，其中与Ark－1529－29株氨基 酸同源性最高，为 gi．6见与不同酶切类型的 M。l、、H。卜 H；。。叁毒株氨基 酸同源性较低分别为85．6巩86．2卧86．2趴 因而推测宜株是由 Ark、 《9型株变异而来。本研究对IBV的快速诊断和分型有较大 的实用价值，可为IBV的防制和地方制苗株的选择提供参考依据。
参考文献：
[1]. 禽传染性支气管炎病毒N基因RT-PCR、克隆及序列分析[D]. 周生. 四川农业大学. 2002
[2]. 鸡传染性支气管炎病毒LX4株主要结构基因的研究[D]. 贺秀媛. 西北农林科技大学. 2002
[3]. 应用RT-PCR及RFLP技术对鸡传染性支气管炎病毒进行诊断与分型的研究进展[J]. 磨美兰, 韦平, 李康然. 广西农业生物科学. 2000
[4]. 禽传染性支气管炎病毒新的变异株核衣壳基因的克隆及在大肠杆菌中的表达[D]. 丁红梅. 浙江大学. 2001
[5]. 传染性支气管炎病毒地方分离株的RFLP和序列分析[D]. 王宪文. 河南农业大学. 2002
标签：生物学论文; 畜牧与动物医学论文; 氨基酸残基论文; 基因合成论文; 基因变异论文; 序列模式论文; 编码序列论文; 基因结构论文; 同源重组论文; 保守序列论文; 同源基因论文; 引物设计论文; 呼吸道疾病论文; pcr论文;