李燕 何蓉 巫婷婷 刘江南
（成都军区第452医院风湿免疫科 四川成都 610021）
【摘要】目的：观察不同浓度的青蒿琥酯（ART）对人类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）滑膜细胞凋亡和细胞因子 CCL5水平的影响，探讨青蒿琥酯治疗RA的免疫机制。方法：收集RA患者关节液标本25例，体外分离培养滑膜细胞，以生长良好的3～5代滑膜细胞进行实验，调整细胞浓度，分为细胞对照组、ART组、MTX组。（1）不同浓度的 ART作用于滑膜细胞 24h，12.5?g/ml ART作用滑膜细胞8、24、48h，用流式细胞术分别检测其细胞凋亡。（2）不同浓度ART 和MTX分别处理滑膜细胞 48h，用ELISA法检测其细胞培养上清液中 CCL5水平。结果：（1）对 RA滑膜细胞凋亡的影响：ART在 3.125～25?g /ml浓度范围内作用滑膜细胞 24h后，早期凋亡细胞率与对照组比较，有显著差异（P﹤0.05），并呈剂量依赖性。但当 ART的浓度达到 50?g /ml时，早期凋亡细胞率反而降低；12.5?g /ml ART作用滑膜细胞不同时间段的细胞凋亡率与对照组比较，有显著差异（P﹤0.05），并呈时间依赖性。（2）对 CCL5水平的影响：不同浓度的 ART和MTX分别处理细胞 48h后，细胞培养上清液中 CCL5水平较对照组显著降低（P﹤0.05）。结论：青蒿琥酯可显著降低类风湿关节炎患者滑膜细胞 CCL5水平，诱导其凋亡，并呈时间依赖性和剂量依赖性。这可能是青蒿琥酯对类风湿关节炎治疗作用的重要机制之一。
【关键词】类风湿关节炎；滑膜细胞凋亡；CCL5；青蒿琥酯
【中图分类号】R593.22 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2015）18-0100-03
Effect of artesunate on apoptosis and CCL5 production of synoviocytes of rheumatoid arthritis Li Yan He Rong ,Wu Tingting, Liu Jiangnan. Department of Rheumatism and Immunology, 452 Hospital of PLA,Chendu,Sichuan,China 610021
【Abstract】Objective This study is aimed to delemine the inhibitory effects on CCL5 cytokine production and promoting early stage apoptosis of Artesunate(ART) in the fibroblast-likesynoviocytes (FLS) from patients with rheumatoid arthritis(RA).Methods:(1) FLS were incubated with different concentration ART for 24h, and were incubated with 12.5?g /ml ART for different time,Flow cytometry was applied to detect the apoptosis of FLS. (2) FLS were incubated with different concentration ART and MTX for 48h.,ELISA was applied to detect the levels of CCL5 in the cell culturation clear supernatant. Results (1) Different concentration ART were found to promot apoptosis on FLS compared with the controlled group (P﹤0.05), and ART appeared to be in a dosage and time dependent manner; (2) Different concentration ART and MTX presented remarkable inhibitory action on the levels of CCL5 compared with the controlled group (P﹤0.05), and ART appeared to be in a dosage dependent manner at the concentration ranging from 3.125-50?g /ml. Conclusion The effect of ART were remarkable on patients with rheumatoid arthritis. The mechanism of action may be realized through inhibiting FLS CCL5 cytokine and advancing FLS apoptosis.
【Key words】Rheumatoid arthritis; Artesunate; CCL5 cytokine; early apoptosis
青蒿的有效成分是青蒿素，青蒿素的还原产物双氢青蒿素可以合成两种衍生物：青蒿琥酯（Artesunate，ART）和蒿甲醚。现代研究发现其除了具有抗疟、抗血管增生、抗炎、抗肿瘤等作用外，还具有广泛的免疫调节作用。为了进一步明确ART对RA的作用靶点，本研究着重探讨不同浓度的 ART和MTX对 RA滑膜细胞因子CCL5水平的影响，体外观察 ART诱导 RA滑膜细胞凋亡的规律，从而为临床治疗 RA提供理论依据。
1.材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1标本来源 在川北医学院附属医院风湿科2007年3月～2007年10月就诊的、有膝关节积液的RA患者25(男8，女17)例，年龄41(20～67)岁，平均病程7.4(6月～18年)年，所有患者均符合美国风湿病学会1987年的 RA诊断标准，且近 1月内未用DMARDS和激素。
1.1.2 主要试剂及仪器 胎牛血清（FCS，浙江省杭州四季青公司）；青蒿琥酯（注射液：桂林南药股份有限公司，批准文号：H10930195, 60mg一支）；胰蛋白酶（Sigma公司）；DMEM培养基（Gibco- BRL公司）；Annexin V-FITC试剂盒（广州市长瑞生物技术有限公司）。3M型CO2恒温培养箱；BX71型倒置相差显微镜；Bcnchmark型酶标仪；FACSCalibur流式细胞仪（flow cytometry，FCM 美国BD公司）；CCL5 ELISA试剂盒（美国ADL公司）。
1.2 方法
1.2.1滑膜细胞的分离与培养 无菌抽取关节液30ml左右（肝素抗凝），以1000rpm离心10min，弃上清。Hanks 液洗细胞3次，加入含20％胎牛血清的 DMEM培养液（含青霉素100U/ml，链霉素100?g/ml），置细胞于无菌培养瓶中，于5％CO2饱和湿度培养箱中培养，2～3d分别换液1次，即可除去未贴壁的单个核细胞及红细胞。培养2～3d后，可见树突状及成纤维状滑膜细胞生长，并混有大量巨噬细胞，经消化、传代后，得到纯化的滑膜细胞。将3～5代滑膜细胞用于实验，不同的实验使用不同的细胞浓度和培养器皿，每天观察细胞生长情况。
1.2.2流式细胞术检测滑膜细胞凋亡率 取对数生长期细胞，按细胞浓度为2×105/mL，1ml/孔接种于6孔培养板，3～4h细胞贴壁后予以补液至 2ml。培养 24h后，吸弃悬浮细胞，每孔加入终浓度分别为3.125、6.25、12.5、25、50?g/ml ART分别处理滑膜胞 24h；终浓度为12.5?g/ml ART分别处理滑膜细胞8、24、48h。吸弃上清，收集细胞，重悬于离心管中，1500rpm离心5min，用缓冲液悬浮细胞，制备细胞悬液。向悬液中加入5ul Annexin V-FITC和10ul PI，混匀。室温避光孵育5min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。照上述方法重复4次，结果用x-±s表示。
1.2.3 ELISA法测定滑膜细胞培养液上清中细胞因子的表达取对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×105/mL，100?l/孔接种于96孔培养板，3～4h细胞贴壁后，加入含20%胎牛血清的 DMEM培养液至200?l。培养24h后，吸弃悬浮细胞。每孔中加入LPS（5?g/ml）刺激细胞24h后，加入终浓度分别为3.125、6.25、12.5、25、50?g/mlART,终浓度为12.5?g/mlART，20?g/mlMTX，12.5?g/ml ART+20?g/mlMTX分别处理细胞48h,收集上清。ELISA法检测CCL5水平。根据试剂盒提供的说明书进行操作。
1.2.4 统计学处理 用SPSS11.5统计软件分析，计量资料以均数±标准差（x-±s）表示，选择双侧P＜0.05作为检验水准。采用单因素方差分析。
2.结果
2.1 ART12.5?g/ml分别处理滑膜细胞8、24、48h后，RA滑膜细胞凋亡的时效关系
Annexin V检测试剂盒能使早期凋亡细胞与 Annexin V荧光标记物特异性结合，PI染色则使坏死细胞得以从中区别开来。根据阴性对照所设定的荧光正常界限，将滑膜细胞分为正常活细胞（荧光双阴性细胞，又称活细胞，Annexin(-)、PI(-)，左下象限），早期凋亡细胞（Annexin(+)、PI(-)，右下象限）及坏死（Annexin(+)、PI(+)，右上象限）。结果显示，对照组在8、24、48h三个时间段内，凋亡率逐步增加，但无显著差异（P＞0.05）；而 ART12.5?g/ml在 8、24、48h三个时间段内，随作用时间的延长，凋亡率逐步增加，差异有显著性（P＜0.05）。（见图1～图4、表1）
图1 对照组
注：图1～图4为对照组及ART12.5?g /ml处理滑膜细胞8、24、48h流式图像分析结果。
表1 ART12.5?g /ml作用滑膜细胞不同时间后的早期凋亡率（％）
注： *与同一时间段对照组比较， P＜0.05；
2.2 不同浓度ART处理RA滑膜细胞24h后，滑膜细胞凋亡的量效关系
不同浓度ART分别处理RA滑膜细胞24h后，结果显示，ART 在（3.125～25?g /ml）范围时，随剂量的增加，早期凋亡细胞率逐步升高，与对照组比较有显著差异（P＜0.05）。而当 ART达到50?g /ml时，早期凋亡细胞率反而降低。（见表2）
表2 不同浓度ART作用滑膜细胞24h的早期凋亡率（x-±s）
注：▼与对照组比较，P＜0.05
表4 不同浓度ART和MTX作用滑膜细胞48h后的CCL5水平变化
（单位：pg/ml）
注:▼与对照组比较，P＜0.05；◇与ART、MTX比较，P﹤0.05
结果显示不同浓度 ART 分别处理滑膜细胞 48h后，滑膜细胞培养上清液中细胞因子 CCL5水平均较对照组显著降低（P＜0.05），并呈剂量依赖性。（见上表3）不同浓度的ART、MTX、 ART+ MTX组分别处理滑膜细胞48h后，滑膜细胞培养上清液中细胞因子 CCL5水平均较对照组显著降低（P＜0.05）；组间比较，ART+MTX组的CCL5水平降低得更加明显（P＜0.05）。（见上表4）
3.讨论
RA是一种以慢性进行性对称性多关节炎为主要临床表现的异质性、系统性疾病，目前对RA的发病机制尚未完全明确，滑膜细胞的凋亡抑制和细胞因子网络失调是RA发生的主要原因之一。趋化因子是对白细胞起特异性趋化吸引作用的细胞因子，大量的研究结果表明，趋化因子CCL5在 RA患者的关节滑液中呈高水平表达[1]，通过抑制 CCL5的表达，减少炎性细胞在关节的浸润，可望阻断或延缓RA 关节病变进展。
青蒿是我国传统中药，有研究报道青蒿琥酯能诱导RA成纤维细胞样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes, FLS）产生白细胞介素及影响其信号转导，降低IL-1β、IL-6和IL-8的水平[2]，通过上调滑膜组织中Fas/Fasl、Bax及下调Bcl-2的表达，以此来达到诱导滑膜细胞凋亡的目的[3]，抑制IL-17的水平，降低RANK配体的表达，减少对关节软骨的破坏[4]，在一定程度上促进了FLS凋亡和减少促炎细胞因子表达，进一步缓解RA滑膜炎的症状，进而阻止炎症对骨与软骨的侵蚀，阻断或延缓RA关节病变进展。本实验证实ART在3.125～25?g/ml浓度范围内作用于滑膜细胞后，所诱导的早期凋亡细胞率呈剂量依赖性，但当剂量达到50?g/ml时，早期凋亡细胞率却降低，这可能与ART的细胞毒性有关；ART 12.5?g/ml分别作用滑膜细胞不同时间段后，所诱导的早期凋亡细胞率呈时间依赖性。本实验还发现不同剂量的ART作用滑膜细胞48h后，CCL5水平逐渐降低，呈剂量依赖性；不同浓度的ART和MTX作用滑膜细胞48h后，CCL5水平明显下降，当二者联合作用后，CCL5水平下降得更加明显。
尽管本试验纳入的样本量较少，要得出确切的结论还需要更大样本量的试验。但本实验仍显示青蒿琥酯可明显下调CCL5 水平，诱导滑膜细胞凋亡，抑制或控制了RA发生发展，这可能是青蒿琥酯治疗RA的免疫机制之一。
【参考文献】
[1]刘宁涛，杨明辉，袁国华，等. 趋化因子 CCL5在类风湿关节炎患者滑液炎性细胞中的表达[J].中国临床康复，2006，10（4）：131-133.
[2]Xu H,He Y,Yang X,et al. Anti-malarial agent artesunate inhibits TNF-α-induced production of proinflammatory cytokines via inhibition of NF-B and PI3 kinase/Akt signal pathway in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes [J],Rheumatology, 2007,14(1) :1-7
[3]陈先国，宋兴福，崔向军，等.青蒿琥酯对佐剂性关节炎滑膜组织中凋亡因子Fas/Fasl及Bcl-2/Bax表达影响的实验观察[J].时珍国医国药，2006,17（10）：1926-1928.
[4]李雅娟，赵丽娜，李莉，等.青蒿琥酯对胶原诱导型关节炎模型大鼠IL-17表达的影响研究[J].中国煤炭工业医学杂志，2015,18（5）:799-802.
论文作者:李燕,何蓉,巫婷婷,刘江南
论文发表刊物:《心理医生》2015年18期供稿
论文发表时间:2016/5/12
标签：细胞论文; 浓度论文; 凋亡论文; 青蒿论文; 水平论文; 细胞因子论文; 作用论文; 《心理医生》2015年18期供稿论文;