湖南省计划生育研究所 生殖医学中心 湖南长沙 410007
【摘 要】目的：通过改进人类卵母细胞冷冻步骤来实现人类卵母细胞冷冻解冻后复苏率。方法：收集试管婴儿助孕治疗（IVF-ET）患者未成熟卵母细胞，经体外培养成熟后用于本实验（n=120）。与常规卵裂期胚胎玻璃化冷冻相比较，将成熟后的人类卵母细胞首先采取地冷冻保护剂浓度（5%DMSO，5%EG无蔗糖）融滴法平衡，然后置于5/8玻璃化冷冻保护液（15%DMSO，15%EG，0.8M蔗糖）及玻璃化冷冻保护液中各30秒，最后装入载体置于液氮中保存。人类卵母细胞采用常规解冻方法解冻。结果：解冻后的人类卵母细胞存活率达到100%，解冻后卵母细胞膜保持完整。结论：该种改良的人类卵母细胞冷冻的方法具有较高的解冻存活率，为人类卵母细胞冷冻保持提供一个较好的冷冻方案。
【关键词】人类卵母细胞；玻璃化冷冻；渗透压
A modified method for human mature oocytes vitrification
Abstract Objective The purpose of this study is to develop a modified method for the cryopreservation and efficient post-thaw recovery of human oocytes.Method 120 human unfertilization oocytes were collected form IVF patients，were firstly equilibrated in cryoprotectant buffer（5%DMSO，5%EG without sugar）drops for 9 mins by fused method.The oocytes were then dehydrated by 5/8×VS medium（15%DMSO，15%EG with 0.8M sugar）and 1×VS medium for 40 second separately.The dehydrated oocytes were loaded in carrier and put in the liquid nitrogen immediately.Result the survival rate of cryo-oocytes is high（98.3%）.Conclusion the mortified method for oocyte vitrificaton has fine survival rate，and provides a good method for human oocyte preservation.
Key words：human oocyte，vitrification
人类卵母细胞冷是人体体积最大的细胞，含有丰富的水分，由于其对冷冻保护剂通透性低等特点[1，2]，玻璃化冷冻效果明显优于慢速程序化冷冻[3，4]，但是到目前为止，还没有一个好的冷冻方法使得卵母细胞冷冻得到广泛临床应用。在卵母细胞在玻璃化冷冻解冻过程中所受的损伤可以分冰晶形成、冷损伤、冷冻保护剂毒性、渗透压损伤等，早期改善卵母细胞玻璃化冷冻的焦点主要集中在提高冷冻速度及解冻速度以防止冷冻解冻过程中冰晶的形成，甚至采用泥氮来提高冷冻速度[5，6]，而近期对于减低卵母细胞损伤的焦点主要集中在渗透压上，通过设计特定的冷冻装置，实现冷冻保护剂连续渗透压的变化，以达到减低渗透压变化对卵母细胞的影响[7，8]。本研究通过减低冷冻保护剂浓度及渗透压来实现减低渗透压对卵母细胞冷冻的影响。
1 材料和方法
1.1 人类卵母细胞获取
收集2016月至2017年3月间接受辅助生殖技术治疗患者未受精成熟卵母细胞M2，卵母细胞形态规则，折光性好着用于实验，共收集到卵母细胞120枚。
1.2 人类卵母细胞冷冻与解冻试剂的配方
基础缓冲液A液：MHTF 8ml+2ml SSS；冷冻保护剂平衡液ES液：7ml MHTF +2ml SSS+0.5ml DMSO（sigma）+0.5ml EG（sigma）；玻璃化冷冻保护剂VS：3.85ml MHTF +2ml SSS +1.5ml DMSO+1.5ml EG+1.98g蔗糖；解冻液B液：MHTF 6.5ml+2ml SSS+3.4g 蔗糖。
1.3 人类卵母细胞冷冻
人类卵母细胞冷冻操作在室温下进行以液滴形式进行冷冻（液滴大小40-50微升）。首先将卵母细胞置于A液滴中1分钟，去除所携带的油滴。然后采用融滴法（A液、ES液、ES液呈正三角形排列）将M2置于A液滴中，连接A液滴与ES液滴，平衡2分钟，再连接融滴与ES液滴，平衡2分钟。将M2置于ES液滴中5分钟；将M2过渡到5号液滴中（2个5号液滴过渡），置于5号液滴40秒；将M2过渡到VS液滴中（2个VS液滴过渡），置于VS液滴40秒；将卵母细胞置于冷冻载体上，吸除多余液体，插入液氮中保存。
1.4 卵细胞解冻操作
37℃预热B液（双井皿中央空1.2ml）备用，将保存在液氮中的载体上卵母细胞迅速置于预热的B液中，维持1分钟，再轻轻将卵母细胞由B液转移到AB液体（体积比：A液：B液=1：1）中，维持3分钟，将卵母细胞由AB液转移到1/2浓度的AB液体中，维持3分钟。将卵母细胞液转移到A液体中，维持5分钟，将卵母细胞由A液转移到A液体中，维持5分钟。最后将解冻后的人类卵母胞置于培养液G1中。
人类卵母细胞存活的形态学标准：细胞膜完整，细胞质遮光性强。解冻后立即观察记录卵母细胞存活情况，24小时后再次观察记录卵母细胞存活情况。
2 结果
2.1 卵母细胞在冷冻保护液中的形态变化
卵母细胞在液滴首次融合后，高浓度液滴向低浓度液滴渗透，推动卵母细胞向低浓度液滴周边移动，卵母细胞脱水，细胞体积变小。第二液滴融合后，卵母细胞稍皱缩，在ES液体中平衡后的最终体积为0.695±0.008，见图1B；在5/8VS液中，卵母细胞体积发生局别变化，细胞皱缩严重，体积比：0.497±0.007，见图1C；在VS液中的变化情况，卵母细胞体积进一步缩小，体积比：0.483±0.04，见图
卵母细胞置于等渗A液滴中形态（图1A），细胞膜完整，折光性强，卵周隙小；卵母细胞置于ES液滴共9分钟后的形态（图1B），冷冻保护剂进入细胞后，细胞体积稍缩小；卵母细胞置于5/8VS液体40秒后，细胞体积急剧缩小（图1C）；卵母细胞置于VS液滴中40秒，细胞进一步缩小（图1D）；解冻后（图1E）及解冻后24小时（图1F），卵母细胞细胞膜完整，折光性强，卵周隙小。
2.2 卵母细胞解冻后存活
共解冻120枚卵母细胞，未发现卵细胞发生解冻后瓦解，解冻后卵母细胞存活率为100%，继续培养24小时后，解冻后卵母细胞仍存活，见图1E，细胞膜完整，折光性强，见图1F。
3 讨论
人类卵母细胞冷冻在人类生育力冷冻中占有重要的地位，自采用玻璃化冷冻以后，人类卵母细胞技术得到了极大的提高，但是离临床应用还存在一定的差距。国内外学者对人类卵母细胞冷冻进行了多方面的改进[9]，尤其是Kuwayama在2005年首创的人类卵母细胞冷冻配方[10]。最近，对人类卵母细胞冷冻的焦点集中在冷冻保护剂渗透压上来，连续渗透压梯度可以降低卵母细胞形态的剧烈变化，Lai等发现连续密度浓度梯度中，蔗糖对小鼠卵细胞形态的维持具有重要作用[11]，其解冻后小鼠卵母细胞存活率为100%，人类未受精卵母细胞同样可以达到100%存活率（存活标准参考Seki 2012）。本研究采用新的改良冷冻方法，改良集中在初始渗透性冷冻保护剂浓度较低（5%Vs 7.5%），可以减低冷冻保护剂对卵母细胞的毒性损伤，重点改良的是增加了一个VS液浓度的过渡，降低高渗透压对细胞冷冻解冻的损伤，为人类卵母细胞实现简便高效冷冻提供一种新的方法。
参考文献：
[1].Newton H，Pegg DE，Barrass R，Gosden RG.Osmotically inactive volume，hydraulic conductivity，and permeability to dimethyl sulphoxide of human mature oocytes.Reprod Fertil.1999；117（1）：27-33.
[2].Edashige K.The movement of water and cryoprotectants across the plasma membrane of mammalian oocytes and embryos and its relevance to vitrification.J Reprod Dev.2016；62（4）：317-21.
[3]Cobo A，García-Velasco JA，Coello A，Domingo J，Pellicer A，Remohí J.Oocyte vitrification as an efficient option for elective fertility preservation.Fertil Steril.2016；105（3）：755-764.e8.
[4]Katayama KP，Stehlik J，Kuwayama M，Kato O，Stehlik E1.High survival rate of vitrified human oocytes results in clinical pregnancy.Fertil Steril.2003 Jul；80（1）：223-4.
[5]．Chian RC1，Wang Y，Li YR.Oocyte vitrification：advances，progress and future goals.J Assist Reprod Genet.2014；31（4）：411-20.
[6]．Gook DA1，Edgar DH.Human oocyte cryopreservation.Hum Reprod Update.2007；13（6）：591-605.
[7]．Heo YS1，Lee HJ，Hassell BA，Irimia D，Toth TL，Elmoazzen H，Toner M.Controlled loading of cryoprotectants（CPAs）to oocyte with linear and complex CPA profiles on a microfluidic platform.Lab Chip.2011；11（20）：3530-7.
[8]．Song YS1，Moon S，Hulli L，Hasan SK，Kayaalp E，Demirci U.Microfluidics for cryopreservation.Lab Chip.2009；9（13）：1874-81.
[9]． Zhang L1，2，Xue X3，Yan J1，2，Yan LY1，4，Jin XH1，2，Zhu XH1，2，He ZZ3，Liu J2，5，Li R1，4，Qiao J1，4.L-proline：a highly effective cryoprotectant for mouse oocyte vitrification.Sci Rep.2016；6：26326.doi：10.1038/srep26326.
[10]．Kuwayama M1，Vajta G，Kato O，Leibo SP.Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes.Reprod Biomed Online.2005；11（3）：300-8.
[11]．Lai D1，Ding J2，Smith GW3，Smith GD4，Takayama S5.Slow and steady cell shrinkage reduces osmotic stress in bovine and murine oocyte and zygote vitrification.Hum Reprod.2015；30（1）：37-45.
论文作者:罗树伟,谢舜,毛增辉
论文发表刊物:《中国蒙医药》2017年第5期
论文发表时间:2017/5/18
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