聊识君[1]2016年在《乳腺癌MCF-7抗原负载的DC联合CIK细胞对乳腺癌MCF-7细胞株体内外作用的研究》文中研究说明背景:乳腺癌是目前导致女性癌症死亡的主要原因之一。目前,针对乳腺癌的临床手段主要为手术、放疗、化疗、内分泌治疗以及分子靶向治疗等多种治疗方式。虽然乳腺癌总体治疗效果很好,但有部分患者在接受规范化治疗后,仍会出现复发转移,所以对于乳腺癌的长线治疗仍然是一项具有挑战性的工作,寻找新的乳腺癌治疗策略刻不容缓。近年来,逐步有研究发现以抗原—抗体免疫反应着手,通过调节抗肿瘤的免疫反应可以利用免疫系统鉴别和消灭肿瘤的能力,从而避免肿瘤复发和转移,但其于乳腺癌治疗方面并没有被完全认识。本实验拟利用提取乳腺癌MCF-7冻融抗原,联合来源于健康人外周血的DC与CIK细胞,并共同作用于乳腺癌MCF-7细胞,观察其在对于乳腺癌细胞活性,侵袭能力及细胞种植成瘤方面的影响。目的:通过对健康人外周血来源的DC进行乳腺癌MCF-7冻融抗原负载,联合CIK细胞作用,观察其在对于乳腺癌细胞活性、侵袭能力及细胞种植成瘤能力的影响,从而为乳腺癌新型细胞免疫治疗提供依据。方法:采用循环冻融法制备人乳腺癌MCF-7无菌冻融抗原。在严格无菌条件下采取健康人50ml外周静脉血,采用梯度密度区带离心法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),通过细胞因子rh GM-CSF和rh IL-4定向诱导,中间分组加入冻融抗原进行负载后运用TNF-α促进DC细胞成熟,并通过rh IFN-γ、rh IL-2诱导成熟的CIK细胞,两种细胞分组联合作用。以普通乳腺癌MCF-7细胞做对照,用CCK8、Transwell方法及裸鼠体内实验,联合肿瘤细胞种植皮下成瘤,分析抗原负载后对乳腺癌细胞毒作用的改变、细胞侵袭能力及成瘤能力的影响,最终评估MCF-7细胞冻融抗原负载的DC联同CIK细胞在乳腺癌治疗中的作用。结果:(1)乳腺癌细胞可于反复冻融状态下发生裂解并释放抗原。(2)CCK8实验结果显示:在DC细胞联合CIK细胞对乳腺癌细胞的体外杀伤作用中,DCM CF-7+CIK组在各效靶比下对于乳腺癌MCF-7细胞旳杀伤率均最高,且最佳作用效靶比为30:1,各组细胞杀伤作用有明显统计学差异(P<0.05)。(3)Transwell实验结果显示:DCMCF-7+CIK组对MCF-7细胞侵袭影响作用最大,对比其他组别,其结果差别具有统计学意义(F=61.604,P<0.05),同时进一步两两比较发现,DC+CIK组与CIK组对于MCF-7细胞侵袭水平影响的差异不大(P>0.05),无统计学意义。(4)体内实验中:各实验组裸鼠及对照组裸鼠成瘤体积存在显着性差异,DCMCF-7+CIK组裸鼠成瘤体积最小,各组间瘤体体积差别有统计学意义(F=33.549,P<0.05),DC+CIK组的成瘤体积与CIK组的成瘤体积差异不大(P>0.05),无统计学意义。结论:(1)外周血单个核细胞可在细胞因子的作用下成功诱导并分离DC细胞及CIK细胞。(2)经乳腺癌MCF-7抗原负载的DC细胞联同CIK细胞作用,可提高DC与CIK细胞介导的抗原抗体免疫反应,对乳腺癌MCF-7细胞具有细胞毒作用,可显着抑制乳腺癌MCF-7细胞活性,并下调其侵袭能力。并在体内环境可削弱乳腺癌MCF-7细胞成瘤的能力。(3)MCF-7冻融抗原负载于DC细胞与CIK作用,或可成为乳腺癌治疗手段的一种新方向。
马全[2]2005年在《黑色素瘤相关抗原基因及其抗原肽负载树突状细胞免疫治疗乳腺癌的实验研究》文中研究表明背景 自1991年发现第一个黑色素瘤相关抗原基因(Melanoma-associated Antigen Gene,Mage)及其抗原肽(MZ2-E)以来,多年来,人们已在不同肿瘤组织中,发现多个Mage基因,均定位于X染色体,有着一定的同源性,组成了一个Mage基因家族,分为A、B、C、D、E、F六个亚家族。进一步的研究发现,其中A、B、C叁个亚家族存在一些独特的特征,只在肿瘤、睾丸和胎盘组织中表达,在其它正常组织迄今为止还没有发现其表达。而且其表达产物是一种肿瘤排斥性抗原,细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)可以识别该抗原。这提示Mage基因有可能作为肿瘤相关的检测标志,有助于肿瘤的诊断与治疗,而其抗原有可能做为肿瘤免疫治疗的靶抗原进行免疫治疗。 树突状细胞(dendritic cells,DCs)是一类形态独特的MHC携带细胞,有强有力的免疫刺激力和抗原递呈能力,也是唯一能激活初始型T细胞、诱发初次免疫应答的抗原递呈细胞。越来越多的证据表明,DC诱发的细胞免疫尤其是CTL介导的免疫应答,在消除恶性肿瘤中起着重要作用。利用树突状细胞负载抗原进行细胞过继免疫治疗(adoptive cellular immunotherapy,ACI)受到广泛关注。 基于Mage基因及其抗原肽的特征,我们对Mage基因在乳腺癌中的表达,在隐匿肿瘤细胞(occult tumor cells,OTC)检测中的价值,以
范萍[3]2002年在《肿瘤抗原负载的树突状细胞免疫过继治疗乳腺癌的研究》文中进行了进一步梳理目的 树突状细胞(dendritic cells，DC)是人体内重要的抗原递呈细胞，其可以把肿瘤抗原特异性地递呈给免疫效应细胞而产生肿瘤特异性免疫反应。它有很强的摄取、处理、递呈抗原的能力以及高表达共刺激分子，自90年代以来已成为免疫治疗研究热点之一。本研究系统地探讨乳腺癌患者外周血中免疫细胞如T、B淋巴细胞、NK细胞等的变化，以及乳腺癌细胞表面分子的改变，进一步明确乳腺癌患者的免疫状况。希望乳腺癌抗原负载后的DC能够弥补乳腺癌患者的免疫缺陷，并探讨肿瘤抗原负载的DC免疫过继治疗乳腺癌动物模型的效果。 材料和方法 1、乳腺癌患者的免疫功能检测：随机抽选2001年3月至10月30例乳腺癌患者的外周血，采用流式细胞技术分析淋巴细胞表面CD3、CD4、CD8、CDl9、CD28的表达，单核细胞表面CD40、CD80、CD86的表达。 2、乳腺癌细胞表面分子的表达：采用流式细胞技术检测5株乳腺癌细月包MCF-7、SK-BR-3、T47D、MDA-MB-435s、ZR-75-30表面MHCⅡ类抗原与共刺激分子CD40、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)的表达，并与正常乳腺细胞HBL-100作比较。同时检 1汕k厂村人学博【：学位论义 渺J35仲憎L腺癌肿瘤标本这些分子的表达，并与乳腺良性病变标本 作比较。 3、人外周血中树突状细胞分离、培养与鉴定：采集健康成人外 周血 20人份，乳腺癌患者外周血 30人份，每份 10毫升，肝素 抗凝。用淋巴细胞分离液分离外周血，收集单个核细胞，调节细 J包浓度为 IO‘／ml，然后在 6 JL板上占壁，每JLh。Zml，2，J、时后 吸去悬浮细胞，加入新鲜营养液。每隔1天半量换液一次。用共 聚焦显微镜拍摄所培养的细胞，流式细胞枝术鉴定所培养的细 胞。 4、B：lb儿，J、鼠骨髓DC的培养：元菌操作取，J、鼠后肢股骨，用 注射针将髓腔中的骨髓细胞吹打出，用0．8％TriSNH人溶去红 细月后，PBS洗2次，用含mGM－CSF（．3ng／ml），lL＊20ng／ml） 和 10o，J、牛血清的 yMI 640 Z全培养基重悬至 l．0 xlo‘／ml， 铺于 6孔板上，ZmNL，第 3天轻轻晃动培养板，吸弃全部上清 （去除粒细胞），及时补入含细胞因子浓度相同的完全培养基， 第 6天轻轻吹吸下疏松粘附于培养板底的聚集体，置于新的培养 板中，并加入等量的上述完全培养基，继续培养24小时，用于 免疫标记鉴定、分泌细胞因子检测及生物学活性的研究。 5、B：lb七，J、鼠乳腺癌模型的建立：选择对数生长期的 TM40D， 用 0．25％胰 蛋白酶消 化，PBS洗涤2次；细胞浓度调至 10‘．10‘／ml。 在 Balb七小鼠胸壁第 56肋间或腹壁第 4对乳腺处皮下接种肿瘤 go胞0．1m1，相当于10’1～胞／X小鼠。每天观察肿瘤的生长情 况，用游标卡尺测量肿块的大小。 6、肿瘤抗原负载的DC免疫过继治疗B：lb止。J、鼠乳腺癌模型： 动物分为 3组，每组 10 ．q小鼠，皆于腹壁右侧第 4对乳腺处皮 下接种对数生长期的 TM40D细胞，IX 10‘／只，在肿瘤细胞接种 7 内水厂村人学博卜学位沦义后第 3天，于同侧腹股沟皮下接种 TM40D负载的 DC（2 XIO‘／只／次），以后分别于第10，门，24天每组动物接受与第一次同样的治疗。观察肿瘤的生长、动物存活率以及肿瘤的转移情况。 结 果l、乳腺癌患者外周血中 CD3、CD4、CDS、CD16、CD19阳性的淋巴细胞与对照组相比无显着性差异…功刀5八但是CD28阳性 T i田胞少于对照组（p＜0．05），特别是CD4／CD28双阳性 T兰胞明显少于对ig组（p功．005）。手术后7天左右CD28阳性T细胞就恢复到正常，与对照组相比无显着性差异（p＞0刀5），说明乳腺癌患者免疫细胞减少与肿瘤负荷有关。乳腺癌患者单核细胞、表达共刺激分子 CD80（p＜0．05）、CD86（p＜0．00L CD40表达与对照组相比无显着性差异巾叩刀5）。2、5株乳腺癌细胞MHC H类分子表达都与HB卜mo有显着性差异（p＜0．05），MCF－7 i田胞表达水平最低，约为 HBL－100勺 1／5。MDA－MB－4355与 ZR刁5S0细包表达水平是HBLl 的 2倍，MDA．MB．4355荧光强度也比HBLl0O及其它乳腺癌细胞高。但MDA－MB－4355 i田包表＠CD40分子表达水平最低，约为 MCF－7与HBL－mo CD4O分子表达水平的m％。MDA－MB．4355细月CD80、CD86分子表达水平与 HBL－100才当（p＞0．05），另 4株乳腺癌细月 CD80、CD86分子表达者比 HBL－100｛（p＜0．05）。乳腺癌原代细胞 CD40表达水平与对照组相比无显着性差异 （p＞0刀5），＊＊0、＊＊6白
张伟静[4]2012年在《CIK联合DC细胞免疫治疗在转移性乳腺癌中的临床应用》文中研究说明目的：通过比较对照组（单纯化疗组）与联合治疗组（DC-CIK细胞免疫治疗联合化疗组）的疗效及毒副作用，客观地评价DC-CIK细胞免疫疗法治疗转移性乳腺癌的临床疗效，为转移性乳腺癌的个体化综合治疗模式提供新的思路，获得更好的临床疗效。方法：本研究对41例转移性乳腺癌患者进行研究，所有患者均已行手术治疗及术后辅助化疗，有明确的组织病理学检查，均由B超、CT、MRI及骨扫描确诊证实为转移性乳腺癌的女性患者。入选患者被随机分为单纯化疗组，即应用多西他赛联合表阿霉素（TA）方案化疗，与联合治疗组（DC-CIK细胞免疫治疗联合TA方案治疗），联合治疗组采用常规化疗与DC-CIK细胞免疫治疗间隔进行的方法。对两组的治疗有效率（RR）、疾病控制率（DCR）、毒副反应、治疗前后T淋巴细胞亚群的变化及生活质量进行比较。疗效评价按照近年普遍应用的实体瘤疗效评价标准(RECIST)评价疗效。化疗反应按照WHO标准分为0~Ⅳ度，利用SPSS13.0软件包进行数据处理。结果：（1）单纯化疗组经过TA方案化疗后，RR为60.0%，DCR为75.0%。（2）DC-CIK细胞免疫治疗联合化疗组经过治疗后，RR为71.4%，DCR为85.7%。联合治疗组RR及DCR有所提高，但无统计学差异，（p＞0.05）。（3）单纯化疗组的毒副反应主要表现为脱发及白细胞减少，发生率分别为80.0%及85.0%，联合治疗组的主要毒副反应同样表现为脱发及白细胞减少，发生率分别为76.2%及71.4%，两组之间差异无统计学意义，（p＞0.05）。经过DC-CIK细胞免疫治疗后有2例患者出现一过性发热，未观察到明显的不良反应。（4）联合治疗组患者经过DC-CIK细胞免疫治疗后，T淋巴细胞亚群发生变化，CD3~+、CD3~+/CD4~+、CD3~+/CD8~+、CD4~+/CD8~+、CD3-/CD16~+56~+上升，CD3~+/CD8~+明显下降，机体免疫力提升，治疗前后相比差异有统计学意义，（p＜0.05）。（5）联合治疗组患者经过DC-CIK细胞免疫治疗后，在疲倦乏力、食欲不振、失眠盗汗方面明显缓解，与单纯化疗组相比，差异有统计学差异，（p＜0.05）。结论：与单纯化疗组相比，DC-CIK细胞免疫治疗联合化疗组有效率（RR）和疾病控制率（DCR）有所提高，近期疗效较好，除一过性发热外，未观察到明显毒副反应。同时联合治疗组患者经过DC-CIK免疫治疗后，T淋巴细胞亚群发生变化，免疫抑制状态得到改善，机体免疫力提升，生活质量显着提高，DC-CIK细胞免疫治疗在转移性乳腺癌中有较好的疗效。
张燕[5]2010年在《肿瘤免疫治疗中CTL细胞、Treg细胞及其相关性研究》文中认为目的:恶性肿瘤发病率增高,严重危害人类健康。目前针对肿瘤手术、放疗、化疗叁大常规治疗方法却远远不能改变肿瘤治疗的现状。近年来随着分子生物学技术的发展、免疫学理论不断丰富,现代免疫学技术也在不断地推陈出新,人们从细胞和分子水平上对肿瘤与免疫系统的关系有了更深刻的认识,为肿瘤免疫疗法在临床上的应用奠定了坚实的基础。过继性细胞免疫疗法(adoptive cell immunotherapy ACI)已经成为继手术、放疗和化疗后的第四种治疗模式。过继性细胞免疫疗法是指向肿瘤患者转输具有抗肿瘤活性的免疫细胞,直接杀伤肿瘤或激发机体免疫反应来杀伤肿瘤细胞,达到治疗肿瘤的目的。目前以抗体疗法、T细胞疗法和肿瘤疫苗为代表的肿瘤被动免疫和主动免疫治疗,己经取得显着的进展,作为肿瘤治疗的辅助手段在临床上显示出光明的应用前景。过继免疫治疗的关键在于筛选具有肿瘤特异性杀伤作用的效应细胞,对靶细胞即肿瘤细胞产生致命的杀伤,以实现过继免疫治疗高效低毒的特点。具有肿瘤特异性的细胞毒T细胞(cytotoxic T lymphocyte CTL)具有杀瘤谱广、杀瘤活性高、增殖能力强等特点成为过继免疫治疗中常用效应细胞而倍受关注。如何提高CTL细胞数量及活性、增强其抗肿瘤特异性是提高过继免疫治疗效果的关键。树突状细胞(DC)是迄今为止发现的效力最强的抗原递呈细胞,具有高效摄取、加工、递呈肿瘤相关抗原,并激活初始免疫反应的独特功能。本实验利用C57BL/6小鼠DC细胞与T细胞共同培养,并且负载B16黑色素瘤特异性抗原,以便获得数量更多、杀伤活性更高,更具有特异性的抗肿瘤效应细胞DC-CTL。但是在体内试验中发现,抗肿瘤效应细胞在肿瘤微环境中通常被诱导进入“免疫无能”(immune anergy)状态,因此不能有效地识别和杀伤肿瘤细胞,出现效应细胞与肿瘤细胞大量共存的尴尬局面。消除体内的免疫抑制细胞,充分发挥效应细胞的功能,对于提高肿瘤的治疗效果具有重要意义。CD4~+CD25~+Treg细胞CD4~+细胞的新成员,目前较为常用的是根据产生的途径不同将CD4~+CD25~+Treg细胞分为自然产生的调节性T细胞(natural regulatory T cells nTreg)和诱导产生的调节性T细胞(induced regulatory T cells iTreg)两类。大量研究发现在胃癌、肺癌、乳腺癌等癌症患者的外周血、肿瘤浸润淋巴结中都可以检测出CD4~+CD25~+Treg细胞。CD4~+CD25~+Treg细胞可能通过识别肿瘤抗原后活化发挥其免疫抑制作用。CD4~+CD25~+Treg通过细胞间相互接触或分泌细胞因子等机制,抑制机体抗肿瘤免疫应答的产生,使机体处于对肿瘤低应答或无应答状态。这些研究说明CD4~+CD25~+Treg细胞对于肿瘤的免疫治疗是一个重要的障碍。因此寻找既能增强免疫效应细胞的抗肿瘤作用又能抑制或清除CD4~+CD25~+Treg细胞阻抑作用的方法,将是提高和改善肿瘤免疫治疗的一个崭新途径。本研究将B16黑色素瘤特异性抗原致敏的成熟DC与T细胞共同培养,诱导生成具有肿瘤特异性免疫效应细胞DC-CTL。而且应用免疫磁珠分选的方法(magnetic cell sorting,MACS)去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分,从体外杀伤试验、体内的抑瘤效果、细胞形态学变化、对细胞增殖和凋亡的影响等多方面观察DC-CTL细胞的杀伤效果。同时比较于T细胞分化形成CTL的不同时期删除CD4~+CD25~+Treg细胞成分对DC-CTL特异性杀伤效果的影响。从而探究DC-CTL细胞、Treg细胞在抗肿瘤免疫中所起的作用以及相互关系,为肿瘤的免疫治疗提供理论基础及实验室资料。方法:本实验以C57BL/6小鼠的B16黑色素瘤动物模型作为研究对象,制备黑色素瘤动物模型,并应用60Coγ对小鼠黑色素瘤动物模型进行照射,使小鼠机体达到非髓性淋巴细胞删除状态,则C57BL/6小鼠的黑色素瘤动物模型的免疫细胞丧失。便于效应细胞回输完成免疫重建。取小鼠脾脏制备DC和T细胞,B16黑色素瘤细胞采用冻融法制备肿瘤全抗原。将B16黑色素瘤抗原致敏DC细胞完成肿瘤全抗原的负载。将DC与T共同培养,诱导T细胞分化产生效应细胞CTL。并通过流氏细胞术检测DC细胞的免疫表型,确定DC细胞成熟活性。用MACS法分别于DC细胞与T细胞共同培养前后删除CD4~+CD25~+Treg细胞成分,便得到培养前删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞与培养后删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞2组。另设未删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞组及对照组2组。然后再将NMLD状态的B16黑色素瘤C57BL/6小鼠80只,按随机数字表法分为4组并经鼠尾静脉进行效应细胞DC-CTL回输。第1组:培养前删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞组。第2组:培养后删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞组。第3组:未删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞组。第四组:对照组。采用MTT染色法检测4组的体外杀伤实验,观察效应细胞DC-CTL对B16黑色素瘤的杀伤效果。同时观察体内回输DC-CTL效应细胞后小鼠的生活习性、肿瘤的临床特征、DC-CTL细胞及靶细胞的超微结构与细胞增殖与凋亡特征等形态学表现。证实特异性抗原负载的DC-CTL细胞对肿瘤的杀伤效能。最后,运用流氏细胞术(FACS)及酶联免疫吸附实验(ELISA)检测人体内Treg细胞、TNF-α及IL-12含量变化,证实化疗药物的抗肿瘤机制及对机体免疫系统的影响。结果:DC细胞诱导负载B16黑色素瘤肿瘤抗原的DC-CTL细胞活化时可见细胞增大、胞质丰富、活力良好。与肿瘤细胞接触后则诱导肿瘤细胞出现凋亡及胀亡表现,高效杀伤肿瘤细胞。培养前删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞组、培养后删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞组、未删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞组MTT法体外杀伤试验:叁组效应细胞对肿瘤细胞都有较强的杀伤作用。培养前删除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CTL细胞组和培养后删除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CTL细胞组对B16黑色素细胞的杀伤作用明显高于(P<0.05)未删除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CTL细胞组。且随效靶比升高杀伤作用增强。培养前后删除CD4~+CD25~+Treg细胞的DC-CTL组间比较对B16黑色素细胞的杀伤作用没有显着性差异(P >0.05)。B16黑色素瘤的体内抑瘤试验叁组实验组DC-CTL细胞均可使瘤体缩小。抑瘤率明显高于对照组(P<0.05);2组删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞组抑瘤率明显高于未删除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CTL效应细胞组(P<0.05),培养前后删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞组间比较没有明显差异(P >0.05)。流氏细胞术检测肿瘤细胞增殖周期的变化;3组实验组与对照组比较G0/G1期细胞比率、AI显着升高,S期无明显变化,G2/M期细胞比率、PI显着下降(P<0.05);删除CD4~+CD25~+Treg细胞成分两组G0/G1期细胞比率、AI明显高于未删除CD4~+CD25~+Treg组,G2/M期细胞比率、PI显着低于未删除CD4~+CD25~+Treg组,S期无明显变化(P<0.05)。删除CD4~+CD25~+Treg细胞成分两组之间比较G0/G1期、S期、G2/M期细胞比率和AI、PI均没有明显差异(P >0.05)。化疗药物改变肿瘤患者体内Treg细胞、TNF-α及IL-12含量,叁种指标不仅说明化疗药物对机体免疫机能有显着影响,而且还可以做为评估化疗效果的指标。结论:1、特异性抗原致敏的DC-CTL细胞对B16黑色素瘤细胞有较强的杀伤作用。特异性抗原致敏的DC-CTL细胞可以作用于肿瘤细胞的细胞周期,影响肿瘤细胞的增殖与凋亡。充分说明DC-CTL细胞是一种具有强大肿瘤杀伤能力且具有肿瘤特异性的过继免疫治疗的效应细胞。2、删除CD4~+CD25~+Treg细胞成分后的特异性抗原致敏的DC-CTL细胞抗肿瘤免疫效应更具特异性与高效。说明CD4~+CD25~+Treg能够抑制具有肿瘤特异性的效应细胞DC-CTL。去除CD4~+CD25~+Treg细胞,重新募集效应性T细胞能够增强机体的抗肿瘤作用,必将成为一种可行的肿瘤免疫治疗方法。3、不同时间删除CD4~+CD25~+Treg细胞后,从抑瘤作用、对肿瘤细胞细胞周期的影响和对肿瘤细胞的杀伤作用上都有一定的差异,但没有统计学意义,说明CD4~+CD25~+Treg细胞各个亚群的来源和作用机制还需要进一步的研究。4、化疗药物改变机体内CD4~+CD25~+Treg、TNF-α及IL-12含量,对机体免疫系统有显着影响。同时也是评估化疗效果的指标。联合使用中药可以减轻其毒副作用。
崔莹莹[6]2010年在《冻融抗原负载的DC-CIK细胞对SKOV3的杀伤作用》文中提出目的：探讨负载人卵巢癌细胞株SKOV3冻融抗原(Ag)的树突状细胞(DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共培养后,对DC及CIK细胞增殖的影响；探讨与负载人卵巢癌细胞株SKOV3或COC1冻融Ag的DC共培养的CIK细胞对SKOV3杀伤作用的影响。方法：选择12例上皮性卵巢癌患者,分离其外周血,获得单个核细胞(PBMC),用相应的诱导因子体外诱导出DC与CIK细胞。分别收集处于对数生长期的SKOV3及COC1细胞,用细胞冻融法提取Ag,并于DC培养的第5天将Ag加入DC中培养,使之成为负载Ag的DC。将经Ag负载的DC与未经Ag负载的DC分别和CIK细胞共培养后分组：实验组：将经Ag负载的DC与CIK细胞共培养作为实验组(SKOV3Ag-DC+CIK组、COC1 Ag-DC+CIK组)。对照组：(1)将未经Ag负载的DC与CIK共培养作为对照组1(DC+CIK组)；(2)CIK细胞单独培养作为对照组2(CIK组)；(3)DC单独培养作为对照组3(DC组)；(4)负载抗原的DC为对照组4(Ag-DC组)。自培养第1天到第20天,用台盼兰拒染法动态监测CIK细胞的增殖情况,观察DC及Ag负载的DC对CIK细胞增殖的影响。用流式细胞技术分析DC组、SKOV3Ag-DC组、SKOV3Ag-DC-CIK组中DC细胞的表型,观察负载Ag及CIK对其增殖的影响。分析CIK组、DC-CIK组、SKOV3Ag-DC-CIK组中CIK细胞表型,观察DC及Ag-DC对CIK细胞增殖的影响。用乳酸脱氢酶释放法检测CIK组、DC-CIK组、Ag-DC-CIK组(包括SKOV3-DC-CIK及COC1 -DC-CIK组)对SKOV3的杀伤活性,对比观察DC、SKOV3Ag-DC及COC1Ag -DC对CIK细胞杀伤活性的影响。结果：与DC共培养后的CIK细胞的增殖速率大于单CIK细胞,但与同负载抗原的DC共培养的CIK细胞增殖率相比,差异无统计学意义(P>0.05)；Ag-DC-CIK组中DC细胞成熟表型高于DC组及Ag-DC组(P<0.01)；Ag-DC-CIK组中CIK细胞成熟表型高于CIK组及DC-CIK组(P<0.01)；SKOV3-DC-CIK组对SKOV3杀伤率高于CIK组、DC-CIK组及COC1-DC-CIK组(P<0.01)。结论：(1)DC及负载SKOV3冻融Ag的DC与CIK共培养可促进DC、CIK细胞的成熟,但负载SKOV3冻融Ag的DC与DC相比,不能明显提高CIK细胞的增殖率；(2)负载SKOV3冻融Ag的DC可增强CIK细胞对SKOV3的特异性杀伤作用。
马全, 武正炎, 查小明, 郑伟[7]2006年在《Mage-A3抗原肽负载DC过继免疫治疗乳腺癌的实验研究》文中指出目的研究Mage-A3抗原肽负载DC对小鼠乳腺癌的治疗作用。方法体外培养小鼠骨髓来源的DC,并经孵育携带Mage-A3抗原肽,在乳腺癌小鼠模型中进行试验性治疗。结果治疗组与对照组肿瘤体积差异显着(P<0.05),冻融上清负载组和Mage-A3抗原肽负载组没有显着性差异。结论负载Mage-A3抗原肽的DC可以诱导特异性的CTL免疫应答,对小鼠乳腺癌有良好的免疫治疗作用。
朱一蓓[8]2004年在《肿瘤特异性DCs体外诱导调节因素及其生物学功能研究》文中研究表明树突状细胞(dendritic cells，DCs)是机体内最重要的、功能最强的一群专职性抗原提呈细胞(APC)，能有效摄取、加工及提呈抗原，刺激初始型T细胞(naive T cell)的增殖和活化，是启动、调控并维持免疫应答的中心环节。近年来，DCs在肿瘤免疫、移植免疫和抗感染免疫等方面日益受到人们的重视。DCs的分化成熟经历了一系列复杂而精细的过程，进一步探讨调节DCs分化、成熟和功能的生物因子、影响因素及其机制，将有助于以DCs为佐剂的生物治疗的开展。 本研究首先分析了人外周血单核细胞来源的DCs(MDDC)分化成熟过程中，共刺激分子、趋化因子受体的表达及其相互作用，比较CD40和TNF-α两条信号途径对MDDC分化成熟及功能的影响，并探讨IL-2及其受体在DCs活化和功能介导中的作用；继而以CD40和TNF-α信号激发的DCs联合细胞因子体外激发、扩增肿瘤特异性CTL，探讨共刺激信号对肿瘤特异性CTL生物学功能的影响及其机制，评价肿瘤特异性CTL体外趋化和杀伤肿瘤细胞的能力：最后研究肿瘤患者外周血单核细胞来源的DCs的体外诱导及其功能，分析IL-10对DCs分化和功能介导的影响及其机制，以此为恶性肿瘤的免疫治疗提供实验和理论依据。 第一部分 共刺激分子和趋化因子受体在树突状细胞中的表达及其相关生物学效应 目的：比较分析在TNF-α和CD40两种信号途径下，相关共刺激分子和趋化因子受体在人外周血单核细胞来源的DCs分化成熟过程中的表达，探讨共刺激信号和IL-2在肿瘤抗原特异性DCs生物学行为中的作用及其机制。 方法：采用透射电镜观察DCs超微结构：免疫荧光标记检测DCs分化发育过程中共刺激分子和趋化因子受体的表达：RT-PCR和Realtime-PCR检测PD-L1、PD-L2、4-1BB肿瘤特异性DCs体外诱导调节因素及其生物学功能研究中文提要和4一IBBL n1RNA的转录;ELISA检测IL一2、IL一12、IL一10的分泌水平;肠朋swell实验评价DCs对T细胞的趋化能力;Westem一blotting检测IL一2受体丫链的表达。结果:在CD4OmAb(5Cll)和TNF一a刺激成熟的人MDDC中，CD40、CD80、CD86、HLA一DR、GL50、PD一LI和PD一LZ等随着DCs成熟均逐渐上调表达，4一IBB和4一IBBL在抗原负载的 DCs上呈现共表达;CD40mAb激发的DCs中CD25和CD83的表达明显高于TNF一a组且高表达PD一LZ、中度表达PD一Ll(p<0.05);CD40mAb激发的DCs分泌IL一2和IL一12的量明显高于TNF一a组(P<0.05):CD40mAb诱导的Dcs适度表达CXCR4和CCR7，对T细胞的趋化能力明显高于TNF一a组护<0.05);DCs表达功能性几一2助链，IL一2能促进DCs增殖和分泌IFN一Y。结论:共刺激分子和趋化因子受体在人MDDC的分化、成熟和功能介导中起着重要的调节作用，CD40信号对人MDDC分化成熟起到至关重要的作用，DCs表达功能性IL一ZRY链，IL一2及其受体在DCs活化和功能介导中有重要意义。DCs通过4一IBB/4一IBBL共表达的形式可建立激发DCs和功能介导的新途径。
许悦[9]2012年在《Her-2致敏的DCIK细胞对难治性乳腺癌细胞免疫治疗的实验研究》文中研究表明目的：1.建立能诱导生成CTL的Her2多肽负载的CIK-DC共培养体系(即DCIK-P细胞)2.比较DCIK、DCIK-P细胞、表阿霉素、赫赛汀对乳腺癌细胞的杀伤作用3.比较DCIK、DCIK-P细胞对Her-2阳性乳腺癌细胞和Her-2阴性乳腺癌细胞的杀伤作用4.探讨DCIK-P细胞特异性杀伤作用的可能机制方法：1.利用细胞生物学技术体外培养DCIK和DCIK-P细胞。2.流式细胞技术分析DCIK和DCIK-P细胞的表型以及RT-PCR分析细胞的基因型。3.CCK-8法检测DCIK、DCIK-P细胞、表阿霉素、赫赛汀对乳腺癌细胞(SK-BR-3、MCF-7)的杀伤作用。4.采用Si-RNA干扰技术以及基因转染技术调节SK-BR-3、MCF-7细胞的Her-2表达情况,再次用CCK-8法检测DCIK-P细胞对调节后的乳腺癌细胞杀伤作用。结果：1.建立了DCIK-P共培养体系,流式细胞仪分析提示DCIK细胞有很高的NKT细胞含量并且加强了向CTL细胞分化的能力。并筛选出实验所需的HLA-A2型细胞；筛选了具有不同特征的两株乳腺癌细胞即SK-BR-3和MCF-7,它们分别为HLA-A2+Her2+、HLA-A2+Her2-;2. DCIK细胞、DCIK-P细胞、表阿霉素、赫赛汀对乳腺癌细胞的杀伤作用负载Her2的DCIK-P细胞对于高表达相关抗原的肿瘤细胞的杀伤活性明显高于叁个对照组,而对于低表达或不表达相关抗原的肿瘤细胞杀伤活性无明显提高,表明DCIK-P细胞对肿瘤细胞具有抗原特异性杀伤作用。3. DCIK-P细胞对Her-2表达不同的乳腺癌细胞杀伤作用可能机制采用SiRNA干扰技术下调SK-BR-3细胞Her-2表达量、同时采用基因转染技术上调MCF-7细胞Her-2表达量,再次用CCK-8法检测DCIK-P细胞对调节后的乳腺癌细胞杀伤作用,对两株乳腺癌细胞的杀伤率变化差别都有统计学意义,证明DCIK-P细胞对Her-2表达不同的乳腺癌细胞杀伤作用可能是通过调节Her-2这一靶点达到的。结论：1.和表阿霉素、赫赛汀以及DCIK细胞相比,DCIK-P细胞能明显提高对Her-2阳性乳腺癌细胞的杀伤力。2. DCIK-P细胞对乳腺癌细胞的杀伤作用与细胞表达Her-2情况有关。3. DCIK-P细胞对Her-2表达不同的乳腺癌细胞的特异性杀伤作用机制可能是通过调节Her-2靶点达到的。
任鹏涛[10]2009年在《肿瘤免疫治疗中CIK细胞、Treg细胞及其相关性研究》文中研究说明目的:用免疫活性细胞输注的过继性细胞免疫疗法(adoptive cell immunotherapy ACI)是肿瘤生物治疗的研究热点之一。此治疗方法不仅是常规手术、放疗、化疗等抗肿瘤治疗的补充,它对于促进患者免疫系统的重建、消除残留病变等都有良好的效果。更为晚期不适于手术治疗或无法承受放、化疗所带来的副作用的患者开辟了一个新的治疗途径,成为人类抗肿瘤治疗最有希望的措施之一。细胞因子诱导的杀伤细胞CIK(cytokine induced killer,CIK),作为一种新型高效的免疫活性细胞因其具有增殖能力强、杀瘤谱广、杀瘤活性强等其它一些效应细胞无法比拟的优越特性,在过继性细胞免疫治疗中得到了广泛的应用。如何提高CIK细胞的数量、增强其抗肿瘤杀伤活性以及抗肿瘤特异性等方面是目前针对于CIK细胞的研究关键。树突状细胞(DC)是迄今为止发现的效力最强的抗原递呈细胞,具有高效摄取、加工、递呈肿瘤相关抗原,并激活初始免疫反应的独特功能。本实验利用DC细胞与CIK细胞共同培养,并且负载特异性抗原,以便获得数量更多、杀伤活性更高,更具有特异性的抗肿瘤效应细胞。但是在实际应用过程中,抗肿瘤效应细胞在肿瘤微环境中通常被诱导进入"免疫无能"(immune anergy)状态,因此不能有效地识别和杀伤肿瘤细胞。去除体内的免疫抑制细胞,充分发挥效应细胞的功能,对于提高肿瘤的治疗效果具有重要意义。CD4~+CD25~+Treg细胞是新发现的具有免疫抑制作用的细胞群,目前较为常用的是根据产生的途径不同将CD4~+CD25~+ T细胞分为自然产生的调节性T细胞(natural regulatory T cells nTreg)和诱导产生的调节性T细胞(induced regulatory T cells iTreg)两类。大量研究发现在胃癌、肺癌、乳腺癌等癌症患者的外周血、肿瘤浸润淋巴结中都可以检测出CD4~+CD25~+T细胞,CD4~+CD25~+T细胞可能通过识别肿瘤抗原,活化后发挥其免疫抑制作用,抑制机体抗肿瘤免疫应答的产生,使机体处于对肿瘤低应答或无应答的一种状态。这些研究说明CD4~+CD25~+Treg细胞对于肿瘤的免疫治疗是一个重要的障碍。因此寻找既能增强免疫效应细胞的抗肿瘤作用又能抑制或清除CD4~+CD25~+T细胞作用的方法,将为提高和改善肿瘤免疫治疗提供一个崭新的途径。本实验将特异性抗原致敏的成熟DC与CIK细胞共同培养,作为抗肿瘤免疫效应细胞,从形态学、对细胞增殖和凋亡的影响以及对肿瘤细胞杀伤活性等不同方面观察不同的阶段应用免疫磁珠分选去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原致敏的DC-CIK细胞对B16黑色素瘤动物模型的作用,来探讨和分析CIK细胞、Treg细胞在抗肿瘤免疫中所起的作用以及相互关系,来为抗肿瘤免疫治疗的临床应用提供更多的治疗思路和理论基础。方法:本实验以C57BL/6小鼠的黑色素瘤动物模型作为研究对象,制备黑色素瘤动物模型,并应用放射性钴60对小鼠黑色素瘤动物模型进行照射,使小鼠机体内形成非髓性淋巴细胞删除状态,使C57BL/6小鼠的黑色素瘤动物模型的免疫机制丧失。取小鼠外周血单个核细胞(PBMC)制备树突状细胞和CIK细胞,将两者共同培养,并且负载肿瘤特异性抗原,并检测其免疫表型。以免疫磁珠分选方法分别在培养前及培养后去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分。分别得到去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分再经体外诱导产生的特异性抗原负载的DC-CIK效应细胞、经体外诱导产生肿瘤特异性抗原负载的DC-CIK效应细胞,再用磁珠分选方法去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原负载的DC-CIK效应细胞和未去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原负载的DC-CIK效应细胞共叁组抗肿瘤免疫效应细胞。然后再将制备好的达到非髓性淋巴细胞删除状态的C57BL/6小鼠的黑色素瘤动物模型随机分为4组。第一组:回输先通过磁珠分选去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分再经体外诱导产生的特异性抗原负载的DC-CIK效应细胞,第二组:回输先经体外诱导产生肿瘤特异性抗原负载的DC-CIK效应细胞,再用磁珠分选方法去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原负载的DC-CIK效应细胞。第叁组:回输未去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的DC-CIK细胞组。第四组:对照组。通过测量各组的肿瘤体积、重量、计算抑瘤率,比较其抑瘤作用,并应用透射电镜观察特异性抗原负载的DC-CIK细胞及杀伤肿瘤细胞的形态学表现。应用流氏细胞技术(FCM)检测各组肿瘤细胞的增殖周期中G0/G1期、S期、G2/M期细胞比率、细胞增殖指数(proliferation Index,PI)和细胞凋亡指数(apoptosis Index ,AI)的变化,观察特异性抗原负载的DC-CIK对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。采用MTT染色法检测培养前去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原负载的DC-CIK细胞组、培养后去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原负载的DC-CIK细胞组、未去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原负载的DC-CIK细胞组叁组抗肿瘤免疫效应细胞对B16黑色素瘤肿瘤细胞的杀伤效应。结果:采用特异性肿瘤抗原致敏的DC细胞与CIK细胞共同培养,分析其免疫表型,透射电镜观察特异性抗原负载的DC-CIK细胞体积增大,核有切迹,细胞质内细胞器丰富,粗面内质网扩张,细胞表面有突起,与肿瘤细胞密切接触,大量肿瘤细胞凋亡、坏死。培养前去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原负载的DC-CIK细胞组肿瘤平均体积0.0377±0.0128cm3 ,培养后去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原负载的DC-CIK细胞组肿瘤平均体积0.0359±0.0131cm3,未去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原负载的DC-CIK细胞组肿瘤平均体积0.1278±0.0362 cm3,而对照组肿瘤平均体积0.4052±0.0429cm3。叁组实验组肿瘤体积均明显小于对照组(P<0.05),不同阶段去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的两组之间比较,虽然培养前去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原负载的DC-CIK细胞组较培养后去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分组体积略小,但没有显着性差异(P >0.05)。但两组与未去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原负载的DC-CIK细胞组比较肿瘤体积有统计学差异(P<0.05)。叁组特异性抗原致敏的DC-CIK效应细胞组抑瘤率明显高于对照组(P<0.05);去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分两组抑瘤率明显高于未去除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CIK效应细胞组(P<0.05),但两组之间没有明显差异(P >0.05)。瘤体重量对照组3.361±1.07g,培养前去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原负载的DC-CIK细胞组0.958±0.32g,培养后去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原负载的DC-CIK细胞组0.939±0.41g,未去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的特异性抗原负载的DC-CIK细胞组1.651±0.57g。同样叁实验组瘤体重量均明显小于对照组(P<0.05)。但不同阶段去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的两组肿瘤重量都小于未去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分组,并且有统计学差异(P<0.05)。不同阶段去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分的两组之间则没有显着性差异(P >0.05)。透射电镜可以观察到特异性抗原负载的DC-CIK细胞能促进肿瘤细胞凋亡超微结构的改变。流式细胞(FCM)检测癌细胞增殖周期中的变化;实验组叁组与对照组比较G0/G1期细胞比率、AI显着升高,S期无明显变化,G2/M期细胞比率、PI显着下降;去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分两组G0/G1期细胞比率、AI明显高于未去除CD4~+CD25~+Treg组,G2/M期细胞比率、PI显着低于未去除CD4~+CD25~+Treg组,S期无明显变化。去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分两组之间比较G0/G1期、S期、G2/M期细胞比率和AI、PI均没有明显差异(P >0.05)。采用MTT法检测培养前去除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CIK细胞组,培养后去除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CIK细胞组和未去除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CIK细胞组叁组效应细胞对于B16黑色素瘤细胞的杀伤作用,结果表明叁组效应细胞对肿瘤细胞都有较强的杀伤作用。培养前去除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CIK细胞组和培养后去除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CIK细胞组对B16黑色素细胞的杀伤作用明显高于(P<0.05)未去除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CIK细胞组。且不同效靶比之间比较,效靶比越高杀伤作用越强。培养前去除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CIK细胞组和培养后去除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CIK细胞组两组之间比较对B16黑色素细胞的杀伤作用没有显着性差异(P >0.05)。结论:1、特异性抗原致敏的DC-CIK细胞对B16黑色素瘤具有明显的抑瘤作用,并且对B16黑色素瘤的肿瘤细胞有较强的杀伤作用。特异性抗原致敏的DC-CIK细胞可以影响肿瘤细胞的细胞周期,并且具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。说明CIK细胞是一种具有强大肿瘤杀伤能力的新一代过继免疫抗肿瘤细胞。2、去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分后的特异性抗原致敏的DC-CIK细胞抗肿瘤免疫的作用更加高效而且特异,说明CD4~+CD25~+Treg细胞能够对特异性抗原致敏的DC-CIK细胞杀伤肿瘤细胞的活性形成明显的抑制。去除CD4~+CD25~+Treg细胞,重新募集效应性T细胞能够增强机体的抗肿瘤作用,这将成为一种可行的肿瘤免疫治疗方法。3、不同时段去除CD4~+CD25~+Treg细胞后,从抑瘤作用、对于肿瘤细胞的细胞周期的影响和对肿瘤细胞的杀伤作用上都有一定的差异,但没有统计学意义,说明CD4~+CD25~+Treg细胞各个亚群的来源和作用机制还需要进一步的研究。
参考文献：
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[10]. 肿瘤免疫治疗中CIK细胞、Treg细胞及其相关性研究[D]. 任鹏涛. 河北医科大学. 2009
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