王建梅[1]2003年在《弧菌和盐度胁迫下饵料中添加抗氧化物质对虾体的影响》文中进行了进一步梳理本文研究了弧菌和盐度胁迫下，饵料中添加抗氧化物质(维生素E、维生素C和中草药)对南美白对虾生长状况和抗氧化酶系统的影响。所测定的生理指标包括肝胰腺内抗坏血酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的含量，生长率、死亡率、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)。 1．饵料中添加维生素E可以提高虾体内抗氧化物质如维生素C和NAD的含量，从而增强虾体的抗氧化损伤能力。南美白对虾体内维生素C与NAD的含量之间存在一定的相关性，在不同盐度下二者在虾体内的含量变化趋于一致，二者之间存在一种相互影响、相互作用的机制。 2．在不同盐度条件下，虾体对维生素E的最适需求量不同。当盐度为30％时，在饵料中添加100mg／kg的维生素E即可满足机体正常生长发育的需要。 3．饵料中加入维生素E后，有效保护了抗氧化酶的活性，虾体表现出对盐度胁迫更好的适应性，虾体的抗氧化酶活性显着增强。 4．饵料中添加100mg／kg或600mg／kg维生素E均可显着提高对虾抗氧化酶的活性，但这两种添加量之间无显着性差异。在南美白对虾饵料中添加100mg／kg的维生素E就能显着改善机体的抗氧化防御能力。 5．饵料中维生素C、维生素E和中草药的加入在一定程度上促进了南美白对虾的生长，但与对照组相比差异不显着。实验组中对虾的死亡率显着低于对照组，证明饵料中抗氧化物质的加入有效地提高了对虾的存活率。实验组中各种抗氧化酶活力也显着高于对照组，表明实验组内南美白对虾对弧菌的抵抗力显着增加。
李二超[2]2008年在《盐度对凡纳滨对虾的生理影响及其营养调节》文中指出本项目结合水生动物养殖学、动物营养学、生物化学、分子生物学及组织学等研究手段，制定有限目标，较为系统和深入地研究不同养殖盐度下凡纳滨对虾基础营养生理学差异，并在此基础上从营养素(蛋白质和维生素)着手，研究了营养素对凡纳滨对虾生长速度和成活率提高方面的影响，探讨了营养素对凡纳滨对虾渗透调节的作用，初步阐明营养素对凡纳滨对虾渗透调节的调控机制，有针对性的对与凡纳滨对虾渗透调节相关的关键酶基因进性了定性和定量研究，研究成果不但可以为进一步了解甲壳动物渗透调节机理提供了一定的理论依据，也为进一步从分子生物学水平进行相关的研究建立了相关的检测平台，而且相关的营养学研究成果也为凡纳滨对虾的淡化养殖及相关的人工全价配饵提供更为准确的参考依据，具有十分重要的现实意义。1．盐度对凡纳滨对虾生长、体生化成份、呼吸及氨氮耐受性的影响在室内养殖条件下进行了凡纳滨对虾在高、中和低盐度下(分别为3．0、17．0和32．0‰)生长性能、成活率和体生化成分的研究，试验为期50天，期间投喂商用饲料，每个盐度设4个平行。结果表明，中盐度凡纳滨对虾增长率显着高于低盐度组，且低盐度组对虾成活率仅为70％左右，显着低于其它两处理组；然而，盐度对凡纳滨对虾肝体指数和肥满度却无显着影响。各盐度组凡纳滨对虾的体粗蛋白质和灰分含量无显着性差异，而对虾体水分含量却随盐度升高而升高，且高盐度组对虾的体粗脂肪含量显着低于其它两试验组。对不同盐度下凡纳滨对虾的呼吸率的研究发现，低盐度下对虾的耗氧率和吸收商显着高于中盐度和高盐度两试验组，而各盐度组对虾二氧化碳呼出率无显着性差异。此外，试验还研究了不同盐度下凡纳滨对虾对环境中氨氮耐受的差异，计算了低盐度下氨氮对凡纳滨对虾的半致死浓度，并与其它相关研究进行了比较。结果发现，低盐度下氨氮对凡纳滨对虾的半致死浓度(95％置信区间)为9．33(8．39-10．37)mg．l~(-1)，显着低于其它报道的半致死浓度。另外，本试验也发现，凡纳滨对虾对环境中氨氮的耐受力随盐度的升高而增强。综合以上述研究结果，可以看出，虽然凡纳滨对虾属广盐性虾类，对环境盐度范围非常广，但在低盐度下该对虾的养殖尚存在着生长速度低、成活率低和抗逆性低的“叁低”现象，因此，在凡纳滨对虾的低盐度养殖过程中除了满足凡纳滨对虾生长和渗透调节所需能量和营养物质之外，还应时刻监测对虾养殖环境中对对虾有害物质的动态变化。2．不同盐度下凡纳滨对虾抗氧化和消化酶活力、血蓝蛋白含量和肝胰腺组织学结构的比较在前期研究结果的基础上，进一步比较了叁个不同盐度(分别为3．0、17．0和32．0‰)下驯养50d后的凡纳滨对虾消化酶和抗氧化相关酶活力、血蓝蛋白含量及肝腺胰组织学结构的差异，探讨了凡纳滨对虾对不同盐度的生理适应性。结果发现，盐度3．0‰对虾组胰蛋白酶活力显着高于其它两个盐度实验组，盐度17．0‰对虾组总的淀粉酶活力却显着低于盐度3．0‰对虾组。各实验组脂肪酶和纤维素酶活力虽无显着性差异，但相比盐度17．0‰对虾组组，两者在高、低盐度下会有一定程度的升高趋势。低盐度还导致对虾氧合血蓝蛋白含量及氧合血蓝蛋白／总蛋白比值显着升高，提示凡纳滨对虾可通过提高对自身消化酶活力、代谢率和携氧能力，尽量满足低盐度下的高能量需要。此外，结果还发现低盐度下凡纳滨对虾肌肉和肝胰腺组织的超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活力显着高于盐度17．0‰对虾组，表明对虾机体抗氧化系统在长期处理低盐度应激下，已经开始启动用于最大程度地清除机体产生的自由基。相比盐度17．0‰对虾组，低盐度下凡纳滨对虾肝胰腺肝小体中分泌细胞(B细胞)数量增多，而高盐度下却表现出B细胞体积增大的趋势，在一定程度上佐证了对虾消化酶和抗氧化相关酶活力升高的现象，从组织学角度进一步证实了凡纳滨对虾对不同盐度的适应情况。3．盐度对凡纳滨对虾体组织蛋白质积累、氨基酸组成和转氨酶活性的影响研究了低、中和高叁个盐度水平(分别为3‰、17‰和32‰)对凡纳滨对虾各组织蛋白质的积累、肌肉谷草转氨酶和谷丙转氨酶活力、肌肉总氨基酸和游离氨基酸组成和含量的影响。结果显示，经过50d不同盐度水平的试验，低盐度组对虾的肝胰腺和血淋巴中可溶性蛋白质含量显着高于中、高盐度组(P(0．05)，而肌肉中可溶性蛋白质含量在各处理组间无显着性差异；低、高盐度均导致肌肉中谷丙转氨酶和谷草转氨酶活力升高，但是各处理间的差异不显着；低、高盐度组凡纳滨对虾肌肉总氨基酸和总必需氨基酸含量均显着高于中盐度组(P<0．05)，中、低盐度处理组非必需氨基酸含量差异不显着，而低盐度组对虾肌肉中蛋氨酸、丝氨酸、半胱氨酸和脯氨酸含量均显着低于中盐度组(P<0．05)，其中脯氨酸为常见的5种主要渗透调节氨基酸之一；低、高盐度组对虾肌肉总游离氨基酸含量显着高于中盐度组(P<0．05)，而盐度对机体绝大部分肌肉游离氨基酸含量的影响不显着(P>0．05)。结果显示，当环境盐度偏离凡纳滨对虾最适生长盐度时，机体可通过在肝胰腺和血淋巴中积累蛋白质，及提高自身转氨酶活力，来获得机体在渗透调节供能时所需的氨基酸，而这些氨基酸以脯氨酸为主。4．不同盐度下饵料蛋白质含量对凡纳滨对虾生长、体成份和肝胰腺组织结构的影响设计了蛋白质含量为20．61、30．52、40．43和50．34％的四种饵料(分别为CP20、CP30、CP40和CP50)，研究了饵料蛋白质含量对不同盐度下(分别为低盐度LS 2‰、中盐度MS22‰和高盐度HS32‰)凡纳滨对虾(0．0144±0．0047g)生长、成活及体成份的影响，测定了不同处理组对虾的肝胰腺指数(HIS)和肥满度(CF)，试验为期8周。结果显示：(1)盐度对凡纳滨对虾的生长、成活、肥满度和灰分含量均有显着影响，而对肝体指数、体粗蛋白、体粗脂肪和水分无显着影响，中盐度组对虾各指标均最高，其次为高盐度组，低盐度组最低；中、高盐度组对虾的增重率、特殊体重(长)增长率均显着高于低盐度组对虾，而中、高盐度组对虾的各生长指标无显着差异；(2)饵料蛋白质含量对凡纳滨对虾的各生长指标和体粗蛋白含量影响显着，对其它各指标影响不显着。各盐度下，对虾生长和体粗蛋白含量均随饵料蛋白质含量升高而升高，投喂CP20的对虾组显着低于其它各处理组；肥满度和肝体指数均先随饵料蛋白质含量升高至40．43％而升高，然后稍有下降；饵料蛋白质含量对各盐度下对虾成活率影响均不显着。(3)双因素方差分析结果显示，盐度和饵料蛋白质含量，除对体灰分含量存着着显着的交互作用外，对其它体生化成份含量、生长及体形态指标的交互作用均不显着。(4)饲料蛋白质含量明显影响了凡纳滨对虾肝胰腺的组织结构，投喂CP30和CP40饵料的对虾肝小体基膜完整，投喂CP40对虾的肝小体中还出现了大量的存储细胞(R细胞)；而投喂CP20饵料的对虾肝小体分布松散，R细胞数量较小，并且部分肝小体基膜破损；而投喂CP50饵料的对虾的肝小体排列紧密，且B细胞内出现大量内容物质。结果提示，提高饵料蛋白质含量虽然在一定程度上加快对虾的生长速度和增加肥满度，但是并不能提高低盐底下凡纳滨对虾的成活率。饲料中不适宜的蛋白质含量，尤其是含量过低，会导致对虾肝胰腺的结构发生变化，甚至发生不同程度的病理变化。5．盐度和饵料动植物蛋白比对凡纳滨对虾生长、成活和肝胰腺可溶性蛋白质含量的交互作用试验以鱼粉和大豆浓缩蛋白为蛋白源，配制了6种不同饵料动植物蛋白比的饵料，研究了饵料不同动植物蛋白比对凡纳滨对虾生长、成活和肝胰腺可溶性蛋白质含量的影响，试验为期40天。结果显示：1)饵料动植物蛋白比可显着影响凡纳滨对虾增重率、成活率、肝体指数、肥满度和肝胰腺可溶性蛋白质含量。增重率随饵料动植物蛋白升高而升高，但当饵料中动物性蛋白比至29／8时，增重速率不再明显升高，其它指标均先随饵料动植物蛋白升高至一定程度后，稍有下降；2)220‰盐度组对虾的增重率、成活率和肥满度显着高于3‰盐度组对虾，而肝体指数却显着低于3‰盐度组，且盐度对凡纳滨对虾肝胰腺可溶性蛋白含量的影响不显着；3)双因素方差分析结果显示，盐度和饵料动植物蛋白比对凡纳滨对虾增重率、成活率和肝体指数存在交互作用；4)Broken-Line模型分析结果显示，3‰盐度下凡纳滨对虾最适饵料蛋白比为分别29．12／7．79-30．29／6．71，盐度为22‰时为26．05／10．95-29．03／7．97。结果提示，由于不同蛋白源的氨基酸组成和含量不同，配饵中适当的动植物蛋白可以满足凡纳滨对各种氨基酸的适宜需求，且不同盐度下凡纳滨对虾对饵料中动植物蛋白比要求不同。因此，在养殖过程中，一定要结合实际的养殖环境和饵料蛋白源种类，来确定适合自身的饵料配方，才能达到低本高效的养殖目的。6．低盐度下凡纳滨对虾对饵料维生素B_6的营养需求研究了凡纳滨对虾对饵料中维生素B_6的最适需求含量。试验根据凡纳滨对虾的营养需求，以不含维生素的酪蛋白比为蛋白源配制成试验用基础饵料，在基础饵料中分别以0、35、70、105、140和200mg／kg饵料的比例添加维生素B_6配制成6种不同维生素B_6含量的试验用饵料，饵料中维生素B_6含量的实际测量值分别为2．17、32．43、65．79、96．97、137．13和189．56mg／kg饵料。用试验用饵料投喂体重为0．014±0．005g凡纳滨对虾幼虾，每一饵料组设3个平行，试验为期30天。结果表明，饵料中维生素B6含量可显着影响凡纳滨对虾的增重率、特殊体重和体长增长率、成活率和肥满度，而对于对虾的肝体指数却无显着影响。对虾增重率、特殊体重和体长增长率及肥满度均随饵料中维生素B_6含量升高而升高，但当饵料中维生素B_6含量升高到137．13mg／kg饵料后，各指标虽继续随饵料中维生B_6含量升高而提高，但各组之间无显着性差异。对虾成活率总体上是先随饵料中维生素B_6含量升高而升高，饵料中维生素B_6含量为137．13mg／kg时，成活率达到最大值，而当饵料中维生素B_6含量升高至189．56mg／kg饵料时，对虾成活率却稍有下降，但137．13和189．56rag／kg饵料两试验组的成活无显着差异。饵料中维生素B_6含量对凡纳滨对虾肌肉中谷草转氨酶和谷丙转氨酶活力影响显着，两转氨酶活力变化呈现相同的变化趋势，即先随饵料中维生素B_6含量升高而缓慢升高，而当饵料中维生素B_6含量从65．79mg／kg升高至96．97mg／kg时，对虾肌肉中转氨酶活力急速升高至最大值。之后，凡纳滨对虾肌肉中转氨酶活力却随着饵料中维生素B_6含量升高呈稍下降的趋势，但于96．97、137．13和189．56mg／kg叁试验组之间无显着性差异，且均显着高于另外叁试验组。采用Broken-line模型对凡纳滨对虾饵料中最适维生素B_6需求的分析结果范围为106．96-151．92 mg／kg饵料，平均值±标准差为129．94±18．86mg／kg饵料。7．低盐度下饵料中蛋白质和维生素B_6对凡纳滨对虾生长、成活和转氨酶活力交互作用研究了低盐度3．0‰下饵料中维生素B_6和蛋白质对凡纳滨对虾生长成活、体形态学参数及肌肉中转氨酶活力的交互作用。根据凡纳滨对虾的营养需求，以不含维生素的酪蛋白为蛋白源配制成蛋白质含量分别为25％和40％的两种等能试验用基础饵料，在基础饵料中分别以0和200mg／kg饵料的比例添加维生素B_6配制成4种不同试验用饵料。用试验用饵料投喂体重为0．014±0．005g凡纳滨对虾幼虾，每一饵料组设3个平行，试验为期30天。结果表明，饵料中添加维生素B_6可以显着提高凡纳滨对虾的增重率、成活率、肥满度及谷草和谷丙两转氨酶活力，但该饵料组对虾的肝体指数却显着低于不添加维生素B_6饵料组对虾；饵料蛋白质对凡纳滨对虾增重率、体形态学参数和转氨酶活力均不显着影响，但40％饵料组对虾成活率显着高于25％组对虾组；双因素方差分析结果显示饵料中维生素Be和蛋白质对低盐度下凡纳滨对虾各测定指标均无显着交互作用。结果提示，维生素B_6和蛋白质对低盐度下凡纳滨对虾具有不同的营养作用，配制饵料时应同时满足凡纳滨对虾对两者的营养需求量，只通过满足或者提高两者之一而节约另外一种营养素的方式，来获得凡纳滨对虾的最佳生长和成活率是不可行的。8．凡纳滨对虾谷氨酶脱氢基因的定性研究谷氨酸脱氢酶在甲壳动物游离氨基酸中，尤其是在脯氨酸和丙氨酸的合成代谢中扮演着十分重要的角色。由于脯氨酸和丙氨酸是甲壳动物常见的起渗透调节作用的游离氨基酸，因此谷氨酸脱氢酶在甲壳动物渗透调节中的作用应受到重视。本研究对凡纳滨对虾谷氨酸脱氢酶基因进行了定性的研究，结果发现凡纳滨对虾中存在两种谷氨酸脱氢酶基因，其编码的氨基酸的长度分别为474和552个氨基酸，两氨基酸序列中前461个氨基酸完全相同，从第462个氨基酸两者不同。与其它物种谷氨酸脱氢酶编码的氨基酸序列进行比较发现，凡纳滨对虾谷氨酸脱氢酶是一种相对保守的蛋白质，两种凡纳滨对虾谷氨酸脱氢酶氨基酸序列均与果蝇表现出较大的同源性。以不同物种cDNA序列建立的系统树，也可以得到较理想的系统进化物，在所有的选择的物种中，凡纳滨对虾与果蝇表现出较近的亲缘关系。通过比较凡纳滨对虾谷氨酸脱氢酶cDNA序列和基因全序列比较，发现在凡纳滨对虾两谷氨酸脱氢酶基因中均存在叁个内含子，长别分别为202、333和256bp，且相位判断结果发现叁个内含子均为0相位内含子。而与其它物种相比较，只有长度为256bp的第叁个内含子在各物中均存在，提示内含子在研究系统进化中可能具有重要的作用。本文研究结果为以后凡纳滨对虾该基因的进一步定性和定量研究提供了基础资料。9．谷氨酸脱氢酶和Na~+-K~+ ATPase酶基因在凡纳滨对虾不同组织中的特异表达试验设计了用于定量研究凡纳滨对虾渗透调节两种主要相关酶，即谷氨酸脱氢酶和Na~+-K~+ ATPase酶的引物和实时定量PCR的反应程序，研究了两种基因在凡纳滨对虾不同组织中的特异性表达。结果表明：1)采用本试验设计的所有引物和反应程度均可成功的扩增出目的基因片段，且Na~+-K~+ ATPase酶和谷氨酸脱氢酶基因的表达均表现出组织特异性：2)Na~+-K~+ ATPase酶基因在凡纳滨对虾鳃组织中表达量显着高于其它4个组织的表达量，而该基因在对虾肌肉和上皮组织中的表达量次之，但显着高于肝胰腺和眼柄两组织中的表达量，该酶基因在肝胰腺和眼柄两组织中的表达量最低；3)谷氨酸脱氢酶基因A和基因B在凡纳滨对虾不同组织中的表达量稍有不同，但两者均在对虾肌肉组织中的表达量最高，且在肝胰腺组织中的表达量均最低，在其它3组织的表达量介于肌肉和肝胰腺两者之间；4)谷氨酸脱氢酶基因B与基因A两者表达量比值在凡纳滨对虾各组织之间虽然不显着性差异，但基因B的表达量却显着高于基因A在各组织的表达量，比值介于在眼柄中的32．04和肌肉中的64．52之间。结果提示，研究凡纳滨对虾渗透调节主要相关酶谷氨酸脱氢酶和Na~+-k~+ ATPase酶基因表达时，对虾肌肉和鳃是比较理想的研究靶点，肝胰腺与其它各组织相比则不适合作为研究该基因表达的靶组织。10．谷氨酸脱氢酶、Na~+-K~+ ATPase和淀粉酶基因在凡纳滨对虾不同发育阶段中的定量表达采用实时定量PCR技术研究了谷氨酸脱氢酶、Na~+-K~+ ATPase和淀粉酶基因在凡纳滨对虾不同发育阶段中的定量表达情况。结果发现，凡纳滨对虾两谷氨酸脱氢酶基因表达量均随着对虾的发育而呈现缓慢升高的趋势，但直到凡纳滨对虾发育到后期幼体后，两谷氨酸脱氢酶基因表达量才表现出显着的升高趋势。谷氨酸脱氢酶B与A基因表达量的比值在对虾卵中最高，但至无节幼体各阶段，两基因表达量的比值一直呈降低的趋势，而待对虾发育至潘状幼体时，比值开始稍有升高到一定水平，并在糠虾中保持较稳定的状态，但待对虾发育至后期幼体2时，比值稍有下降，而后又呈稍上升。Na~+-K~+ ATPase基因表达随着凡纳滨对虾的发育，一直保持在一个稳定的水平，直到对虾发育到后期幼体16，其表达量才急速升高。淀粉酶基因在凡纳滨对虾发育过程中的卵和无节幼体的表达量非常低，且虽然在溞状幼体中表达量稍有升高，但是表达量却依然保持在很低的水平，直到对虾发育到糠虾幼体，淀粉酶基因表达量才开始骤然升高。由于谷氨酸脱氢酶和Na~+-K~+ATPase均在凡纳滨对虾渗透调节过程中起着重要的作用，但两者基因表达量均在对虾发育阶段后期幼体的后期才有大幅度地升高，说明凡纳滨对虾只有发育到后期幼体后的某一个阶段，才开始具有较强的渗透调节能力。所以，在这一阶段之前的幼体培养过程中应该保持对虾幼体最适的盐度环境。而淀粉酶基因表达的变化规律说明凡纳滨对虾只有发育到糠虾阶段时，对外源食物的消化吸收能力才开始加强。因为结合两方面的试验结果，可以初步认为，如果想要通过营养强化的方式来提高对虾幼体的渗透调节能力，以期提高对虾在养成过程中的成活率，要待对虾发育至糠虾幼体阶段再开始进行营养调节为宜。
葛红星[3]2014年在《两种主要无机氮胁迫下凡纳滨对虾免疫因子变化及其对副溶血弧菌易感性的研究》文中进行了进一步梳理氨氮和亚硝酸盐氮是对虾养殖水体中最主要的胁迫因子。水体中氨氮和亚硝酸盐氮胁迫可诱导对虾正常生理生化因子和组织结构的改变，并能改变与对虾非特异性免疫能力相关酶类活性的改变，导致对虾免疫能力下降，增加对病原体的易感性。针对2009年以来在亚洲地区爆发的凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死综合征(Acute HepatopancreasNecrosis Syndrome, AHPNS)的致病原是副溶血弧菌的报道，本文研究了不同浓度氨氮和亚硝酸盐氮胁迫下人工感染副溶血弧菌后，凡纳滨对虾相关免疫酶活性和死亡率的变化，阐明了氨氮和亚硝酸盐氮胁迫下凡纳滨对虾对副溶血弧菌易感性机理，并且探讨了生物絮团技术在室内工厂化养殖凡纳滨对虾水体中氨氮、亚硝酸盐氮清除效果和生长的影响，为研究凡纳滨对虾AHPNS爆发的环境机制提供相关资料，也为通过调控养殖环境防治该病的爆发提供理论依据。为研究养殖水体中总氨氮胁迫对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)急性肝胰腺坏死综合征（Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome,AHPNS）发生的影响，设置了1个对照组和4个不同质量浓度氨氮实验组，即砂滤海水对照组（0.03mg·L-1）、2.5、5.0、7.5和10.0mg·L-1，胁迫20d后对虾腹肌注射副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)进行感染。凡纳滨对虾感染后6-24h，各实验组均出现死亡高峰，24h后5.0，7.5和10mg·L-1实验组对虾累积死亡率均高于2.5mg·L-1实验组，且在同一取样时间各实验组对虾累积死亡率随着氨氮浓度的升高而升高，48h后各实验组对虾不再死亡，其累计死亡率分别为0%、8%、12%、20%和36%。PO活性呈现先升高再降低的趋势，对照组、2.5和5.0mg·L-1实验组PO活性差异性不显着(P>0.05)，7.5和10mg·L-1实验组除12h外均显着低于对照组(P<0.05)。SOD活性呈现先升高后下降的趋势，7.5和10mg·L-1实验组SOD活性在感染后除24h外均显着高于对照组(P<0.05)，而2.5mg·L-1实验组与对照组差异性不显着(P>0.05)。对照组和2.5mg·L-1实验组对虾LSZ活性在各取样时间点差异性不显着(P>0.05)，7.5和10mg·L-1实验组对虾LSZ活性在3h，6h，24h，48h时间点显着低于对照组(P<0.05)。感染6h后各实验组对虾肝胰腺中LvLT mRNA表达量开始上升，24h后开始下调，至72h恢复至原水平。实验结果表明，氨氮胁迫能降低凡纳滨对虾的非特异性免疫酶活性，影响对虾肝胰腺中LvLT mRNA对病原刺激的应答反应，增加对副溶血弧菌的易感性，为预防凡纳滨对虾AHPNS的爆发，养殖水体中总氨氮浓度应控制在2.5mg·L-1以下。为研究养殖水体中亚硝酸盐氮胁迫对凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)急性肝胰腺坏死综合征（Acute Hepatopancreatic NecrosisSyndrome, AHPNS）发生的影响，设置了1个砂滤海水对照组和4个不同质量浓度亚硝酸盐氮实验组，即对照组(0.02mg·L-1)、2.0、4.0、6.0和10.0mg·L-1，胁迫20d后对虾腹肌注射副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)进行感染。凡纳滨对虾感染后9-24h，各实验组出现死亡高峰，濒死对虾表现出AHPNS相同的临床症状，48h后，各实验组对虾不再死亡，对照组和各实验组对虾累计死亡率分别为0、4%、8%、16%和24%。其中，4.0mg·L-1实验组对虾累积死亡率和2.0mg·L-1实验组差异性不显着(P>0.05)但显着低于6.0和10.0mg·L-1实验组(P<0.05)。感染副溶血弧菌后，对照组、2.0和4.0mg·L-1实验组凡纳滨对虾血清中ALT先上升后下降，6.0和10.0mg·L-1实验组持续上升。对照组和2.0mg·L-1实验组对虾血清AST先上升、96h后开始下降，4.0、6.0和10.0mg·L-1实验组持续升高。对照组、2.0和4.0mg·L-1实验组对虾ALP活性呈现先升高后降低的趋势，6.0和10.0mg·L-1实验组对虾ALP活性持续降低。对照组对虾LSZ活性在各取样时间点显着高于6.0和10.0mg·L-1实验组(P<0.05)而与2.0和4.0mg·L-1实验组差异性不显着(P>0.05)。结果表明，亚硝酸盐氮胁迫能降低凡纳滨对虾的免疫力，增加对副溶血弧菌的易感性。因此，为预防AHPNS的爆发，养殖水体中亚硝酸盐氮浓度应控制在4.0mg·L-1以下。为研究生物絮团技术对室内工厂化养殖凡纳滨对虾水体中氨氮、亚硝酸盐氮清除效果和抗病力及生长的影响，定期向高密度(300尾·m-2、360尾·m-2和450尾·m-2)凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)工厂化养殖水体中泼洒麦麸、蔗糖和枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)发酵液，另外以300尾·m-2不添加发酵液为对照组。结果显示，各实验组水体pH值波动较小。氨氮、亚硝酸盐氮浓度缓慢上升，实验结束时，各实验组显着低于对照组(P<0.01)。其中，300和360尾·m-2实验组水体中氨氮浓度始终低于2.5·m-2而对照组和450尾·m-2实验组在实验结束时氨氮浓度均高于2.5mg·L-1。养殖中后期，各实验组水体中出现较多轮虫和多种原生动物，而对照组水体中桡足类始终是优势种。各实验组对虾的血清蛋白含量均高于对照组。300尾·m-2和450尾·m-2组对虾溶菌酶活力显着高于对照组(P<0.01)。各实验组对虾酚氧化酶比活力和超氧化物歧化酶比活力无显着差异(P>0.05)。与对照组相比，实验组对虾的排氨率分别提高了25.8%、9.7%和19.3%。各实验组产量均高于对照组。实验结果表明，凡纳滨对虾工厂化养殖过程中，定期向养殖体中添加麦麸、蔗糖和芽孢杆菌发酵液，可以有效降低养殖水体中氨氮、亚硝酸盐氮浓度，而且有助于丰富凡纳滨对虾的饵料来源，提高对虾新陈代谢活动，提高凡纳滨对虾免疫力，增强其抗病力。但养殖密度不超过360尾·m-2为宜。
沈振华[4]2017年在《饲料中添加镁、硒和虾青素对中华绒螯蟹幼蟹抗环境胁迫效应的研究》文中提出中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)是我国重要的经济型甲壳动物,随着集约化、规模化人工养殖模式的推广,河蟹养殖产业得到了迅猛的发展。然而水环境污染导致河蟹生长减慢、病害频繁发生,养殖效益显着下降,严重阻碍了河蟹养殖产业的健康发展。为此,寻求消除或者缓解环境胁迫影响的途径成为当前河蟹产业可持续发展的一个重要课题。本文研究在环境胁迫下,饲料中补充重要无机盐镁、硒和虾青素对中华绒螯蟹幼蟹生长性能、抗氧化和感染能力的影响,以期为补充中华绒螯蟹的营养生理资料、完善人工配方和饲料研制提供参考。主要的研究结果和结论如下:1亚硝酸盐胁迫下饲料补充镁对中华绒螯蟹幼蟹生长、抗氧化性能的影响本实验以纯化饲料为基础饲料,在基础饲料上添加不同浓度镁(以L-天门冬氨酸镁形式分别添加0、5、10 g/kg)配置成叁种不同实验饲料,在亚硝酸盐浓度为0和1.0mg/L两种不同水环境下,选择初始体重为(3.15±0.02g)的中华绒螯蟹幼蟹,饲养8周,探究饲料补充添加镁对缓解亚硝酸盐胁迫的不良影响。结果表明:(1)在水体亚硝酸盐胁迫下,未补充添加镁处理组增重率最低,随着添加镁含量的增多,增重率呈上升趋势,饲料补充镁10 g/kg处理组获得了最高的增重率,但各组之间没有显着差异(P>0.05)。未添加镁处理组的存活率显着低于正常水体下未添加镁组(P<0.05),且随着镁的添加,存活率呈升高趋势。同样的,饲料系数最高值也出现在未补充镁组,饲料补充镁5 g/kg和10 g/kg处理组饲料系数显着降低(P<0.05)。(2)体成分分析发现,和对照组相比,水分含量各处理组之间没有显着差异(P>0.05)。未添加镁处理组粗脂肪和粗蛋白显着降低(P<0.05),当饲料补充镁5g/kg和10g/kg后,粗蛋白和粗脂肪均显着升高(P<0.05),并与对照组无显着差异(P>0.05)。(3)血清中SOD活力在胁迫下出现了升高趋势,添加镁10 g/kg处理组组显着高于未胁迫下各组(P<0.05),MDA含量在未添加镁处理组达到最高值,显着高于其他各组(P<0.05)。肝胰腺中SOD各组之间没有显着差异,胁迫下MDA含量显着增加(P<0.05),且随着饲料镁添加量的增加呈显着下降趋势(P<0.05)。结果表明:在亚硝酸盐胁迫下幼蟹增重率、存活率、饲料利用和抗氧化性能都受到显着的抑制作用,饲料补充添加镁可以显着提高幼蟹存活率,增强机体抗氧化能力,有效的缓解环境亚硝酸盐所带来的不利影响,保证幼蟹的健康生长,建议饲料中添加量为10 g/kg。2亚硝酸盐胁迫下饲料补充硒对中华绒螯蟹幼蟹生长、抗氧化和非特异性免疫的影响性能以实用饲料为基础饲料,分别添加硒0、0.5、和1.0 mg/kg,配置3组实验饲料,在两种不同亚硝酸盐浓度(0、2.0 mg/L)水体条件下,投喂初始体重为(2.19±0.05)g的中华绒螯蟹幼蟹,试验为期8周。结果发现:(1)各组之间增重率和存活率均没有显着差异(P>0.05),亚硝酸盐胁迫下随着硒添加量的增加,蟹的增重率有升高趋势。和对照组(正常水体饲喂基础饲料组)相比,未补充添加硒处理组的饲料系数显着升高(P<0.05),达到最高值,当饲料补充添加硒1.0mg/kg后,饲料系数显着降低(P<0.05),且与对照组无显着差异(P>0.05)。(2)和对照组相比,胁迫下未添加硒处理组血清和肝胰腺中SOD活力均显着降低(P<0.05),补充添加硒0.5 mg/kg处理组达最高值,且显着高于其他各组(P<0.05)。幼蟹血清和肝胰腺中MDA含量均显着升高(P<0.05),随着饲料中硒添加量的增加,呈显着下降趋势(P<0.05)。和对照组相比,血清中GPX没有显着差异(P>0.05),肝胰腺中显着提高(P<0.05),补充添加硒0.5mg/kg和1.0 mg/kg处理组血清和肝胰腺中GPX均显着高于其他各组(P<0.05)。(3)胁迫下幼蟹血细胞总数和耗氧率呈下降趋势,但没有显着差异(P>0.05),补充添加硒0.5mg/kg处理组,血细胞总数显着增加(P<0.05)。血清中LZM、ACP和AKP均显着降低(P<0.05),补充添加硒0.5mg/kg和1.0mg/kg后,除AKP均显着升高(P<0.05)。结果提示,养殖水体中亚硝酸盐浓度过高会对河蟹幼蟹生长、抗氧化性能和非特异性免疫力产生较大的负面影响,饲料中补充添加适量的硒可以改善幼蟹生长性能,提高机体抗氧化能力和非特异性免疫相关酶活,缓解环境亚硝酸盐带来的不利影响。3高pH胁迫下饲料虾青素和硒对中华绒螯蟹幼蟹生长、抗氧化能力和非特异性免疫性能的影响本实验在实用饲料中分别添加虾青素和硒,制成虾青素和硒含量分别为0、0mg/kg;120、0mg/kg;0、0.9mg/kg;和 120、0.9mg/kg 的四组实验饲料,饲喂pH(8.0)以及高pH(9.5)胁迫下初重为(3.26±0.05g)的河蟹。8周饲养结束后发现:(1)和对照组(pH8.0,饲喂基础饲料组)相比,高pH胁迫下基础饲料组增重率有所降低,但无显着差异(P>0.05),饲料补充添加虾青素或硒处理组增重率显着升高(P<0.05),但两者同时添加组增重率最低。饲料系数显着增高(P<0.05),添加虾青素或硒以及同时添加组和对照组均没有显着差异(P>0.05)。(2)胁迫下鳃中Na+-K+-ATPase活力均显着下降(P<0.05),基础饲料组最低,显着低于其他各组(P<0.05),添加虾青素或硒后均显着提高,但两者同时添加组效果不如单一添加组效果好。总氨基酸的变化和Na+-K+-ATP酶的变化相类似。(3)和对照组相比,高pH胁迫下饲喂基础饲料组血清和肝胰腺中SOD活力都显着升高(P<0.05),但MDA含量最高值也出现在该组,显着高于其他各组(P<0.05),补充添加虾青素和硒后,血清和肝胰腺中MDA含量均显着降低(P<0.05),血清和肝胰腺中GPX及T-AOC也均显着下降(P<0.05),补充添加虾青素或硒后均显着升高(P<0.05)。(4)血细胞总数在高pH胁迫下饲料基础饲料组和对照组相比显着降低(P<0.05),耗氧率显着升高(P<0.05),补充添加虾青素后和对照组均无显着差异(P>0.05)。和对照组相比,高pH胁迫下饲喂基础饲料组幼蟹肝胰腺中LZM、ACP和AKP均显着降低(P<0.05),补充添加虾青素或硒后显着升高(P<0.05),但同时添加组效果不如单一添加组。养殖结束后使用嗜水气单胞菌进行攻毒发现:和对照组相比,高pH胁迫下饲喂基础饲料组在12h时死亡率显着升高,168h累计死亡率高达90%以上,显着高于其他各组。结果表明,高pH胁迫会对中华绒螯蟹幼蟹生长性能、抗氧化能力、渗透压调节以及免疫抗病力等造成不良影响,当饲料补充添加虾青素或硒可以增强机体抗氧化能力,提高ACP等酶活,增强机体非特异性免疫抗病力来应对这种不良影响,但两者同时添加效果并无协同效应,生产中不建议同时添加。
谢剑华[5]2008年在《虾青素对日本沼虾生理生化特征的影响》文中研究表明本文从雨生红球藻中提取虾青素粗提液,高效液相色谱法测定其虾青素的含量,以此粗提液添加到日本沼虾的配合饲料中。分别从最适添加量的确定、对血细胞密度及吞噬活力(吞噬百分比和吞噬指数)的影响、对抗环境胁迫能力的影响和光保护作用等四个方面研究虾青素对日本沼虾的影响,并初步探讨其作用机理。在最适添加量的实验中,虾青素分为0、20、40、60、80和100 mg／kg等6个浓度梯度添加到日本沼虾的基础饲料中,在实验室条件下饲养7周。结果表明,添加量为40、60 mg／kg组的日本沼虾存活率显着增加(P<0.05),尤其以添加量60 mg／kg组为最高。20、60、80 mg／kg组,增重率显着高于对照组(P<0.05)。故虾青素作为免疫添加剂其对日本沼虾的最适剂量为60 mg／kg。虾青素对日本沼虾抗氧化体系(CAT、SOD、总抗氧化能力)各指标的影响不同,综合60 mg／kg组虾青素对日本沼虾抗氧化体系的影响,确定最适投喂时间为3周。采用上述最适添加浓度和投喂时间展开下面的实验。以血淋巴细胞密度、吞噬百分比和吞噬指数为指标,评价了虾青素对日本沼虾非特异免疫的影响,该条件下日本沼虾的血细胞密度和血细胞吞噬活力(以吞噬百分比和吞噬指数表示)均显着提高(p<0.05),表明添加虾青素可显着提高日本沼虾的非特异性免疫力。在温度突变胁迫(18℃-28℃72 h)、氨氮胁迫(18.7 mg／L、18℃84 h)下测定日本沼虾的存活率及其抗氧化水平在胁迫前后的变化,以衡量虾青素作为一种免疫添加剂对日本沼虾抗环境胁迫的影响。实验结果显示添加虾青素可显着提高日本沼虾的存活率、总抗氧化能力、SOD酶活性(P<0.05),证明添加虾青素的日本沼虾对温度突变胁迫、氨氮胁迫的适应能力显着提高。在饲料中添加虾青素,取血细胞进行培养,UVA照射后通过单细胞凝胶电泳实验评价DNA损伤程度。结果显示,添加虾青素的实验组沼虾血细胞DNA损伤程度显着降低,证明虾青素具有强抗氧化性,可作为潜在的光保护剂,使细胞免受UVA所造成的损伤。综上所述,虾青素作为一种免疫添加剂,在添加量为60 mg／kg时可显着提高日本沼虾的存活率和增重率、血细胞密度和血细胞吞噬活力以及抗环境胁迫能力,并可保护细胞免受UVA的损伤。
饶玉才[6]2007年在《外界刺激与环境胁迫对背角无齿蚌免疫因子的影响》文中进行了进一步梳理近年来养殖贝病频频爆发,严重制约了贝类养殖健康持续发展。目前认为,机体抗病力的下降是导致流行性死亡的主要原因之一。因此,深入研究贝类免疫防御特性,有助于了解和解决贝类养殖中的病害问题。本文以我国广泛分布的背角无齿蚌(Anodonta woodiana)为对象,研究了环境因子变化和外源刺激对其体内一些体液性免疫因子的影响,以期更好地了解贝类的防御机制,为淡水贝类病害防治提供资料。研究结果如下;1.以嗜水气单胞菌(1.6×10~8 cell/mL)注射到背角无齿蚌体内,测定了蚌的血清和肝胰腺中超氧化物歧化酶(SOD)、酚氧化酶(PO)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)及过氧化氢酶(CAT)活力的变化。结果表明,在注射3h,6h,12h,24h,48h后,SOD和PO的活力变化显着,其中SOD活力明显升高,血清PO活力先升后降,肝胰腺PO活力也一直增高;但ACP、AKP及CAT活性变化不明显。本研究表明,SOD、PO活性可作为背角无齿蚌免疫抗病功能指标参数,而ACP、AKP及CAT活性能否作该参数还有待于进一步研究。2.检测和探讨了嗜水气单胞菌(3.0×10~9cell/mL)与枯草芽孢杆菌(5.92×10~9cell/mL)感染对背角无齿蚌血淋巴中一氧化氮(NO)浓度、过氧化氢(H_2O_2)含量、抗菌活力(Ua)、溶菌活力(UL)及溶血素活力的变化。试验表明,注射6h、24h、48h和72h后,嗜水气单胞菌对蚌血细胞抗菌活力无明显影响,但对背角无齿蚌血淋巴其它免疫因子均有不同程度增高作用;枯草芽孢杆菌也能有效提高背角无齿蚌血清中NO浓度、H_2O_2含量、溶血素活力及血清溶菌活力,但对血清和血细胞中抗菌活力与血细胞溶菌活力有所抑制,表明这两种菌对无齿蚌可能存在着不同的作用机理。3.研究了注射不同剂量(30ug/g和50ug/g)V_c对无齿蚌体内NO浓度、总抗氧化能力(T-AOC)、溶菌酶(LSZ)和CAT活性的影响。结果表明,注射Vc后12、36、60和72h,两实验组蚌体内NO浓度与LSZ活性都明显升高,而T-AOC与CAT活性则有所下降。且Vc对30ug/g组各种因子的刺激效果比50ug/g组更好,说明50u/g的剂量已对无齿蚌产生一定毒性,需经代谢消耗一部分后才能起到抗氧化作用。本研究表明,Vc可有效增强该蚌免疫活性,且因剂量不同而有差异。4.检测分析了升温刺激对背角无齿蚌中SOD、CAT活性及MDA含量的影响情况。结果发现,养殖水温从20℃分别缓慢升高到30℃和33℃两天后能明显提高蚌体内SOD活性、MDA含量及肝胰腺CAT活性,但对血清CAT活性影响不显着。结果还发现,高温胁迫下蚌血清及肝胰腺中脂质过氧化程度与SOD及CAT等抗氧化酶活性变化无必然联系。实验表明,高温胁迫会使机体受到损伤,从而导致免疫防御力下降。5.利用不同pH值(6.0,6.5,6.8,7.5,8.0,8.5)的环境胁迫背角无齿蚌,7d后,蚌体内SOD、CAT、ACP、AKP活性及MDA含量等五种免疫指标有明显变化。结果表明;在实验范围内,当pH高于正常组(pH 6.8)时,上述SOD、CAT活性随pH值的增加而明显降低,ACP及AKP活性则呈降升降起伏式变化;但MDA含量升高;当pH低于正常组时,四种酶活性随pH值增加呈不同程度上升趋势,而MDA含量则持续降低。结果说明,pH对背角无齿蚌免疫活性有明显的刺激作用,且在高强度pH刺激下,蚌免疫活性呈现出负调节,这种负调节可能与高强度刺激引起的免疫机能疲劳或损伤有关。6.测定了镉离子(1.25mg/L)暴露对背角无齿蚌的T-AOC、CAT、PO活性以及MDA含量的影响。结果表明,在镉离子暴露1d、3d、5d后,蚌血清与肝胰腺中除T-AOC活力明显降低外,其中CAT活力、PO活性与MDA含量均显着升高。说明镉离子对蚌体抗氧化等机能造成损伤,导致脂质过氧化产物形成。7.研究了不同浓度(2.5、5.0、10、20、40mg/L)的氨氮胁迫背角无齿蚌,7d后,蚌的SOD与CAT两种抗氧化性酶及ACP、AKP和LSZ叁种水解酶活性的变化。结果表明,氨氮胁迫下蚌血清和肝胰腺中SOD、LSZ与血清ACP、AKP活力均被诱导增强,而肝胰腺ACP、AKP及血清及肝胰腺中CAT活力被明显抑制。实验表明,氨氮刺激可明显影响无齿蚌的免疫防御机能,并在一定程度导致抗病力下降。
王慧春[7]2010年在《虾青素对凡纳滨对虾的免疫防护及对虾养殖的水质监测和WSSV检测》文中研究说明将虾青素添加到凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)配合饲料中,从抗氧化角度入手,在个体、细胞和分子水平研究虾青素对凡纳滨对虾免疫防护和抗氧化酶基因的影响,以期全面评价虾青素在改善凡纳滨对虾的生理功能和提高凡纳滨对虾抗病力等方面的作用,进而推测虾青素的作用机理。虾青素对感染WSSV的凡纳滨对虾的免疫防护作用。评价指标有：血液免疫指标(血细胞计数、血细胞吞噬百分比、血细胞吞噬指数、血清抗菌活力、血清溶菌活力、血清酚氧化酶活力、血清抗超氧阴离子自由基活力),WSSV感染后的累积死亡率及相对免疫保护率。实验证明：饲料中添加80 mg/kg虾青素可显着提高实验组对虾的血液学指标(p<0.05)；实验组中感染WSSV的凡纳滨对虾累计死亡率为76.3%,免疫保护率为23.7%：虾青素对凡纳滨对虾抗氧化酶基因转录的影响。采用β-actin作为内参,用半定量PCR法研究添加虾青素作为抗氧化剂对凡纳滨对虾肝胰腺MnSOD、CAT和GPX 3种抗氧化酶基因转录水平的影响。结果表明,饲料中添加80mg/kg虾青素能明显提高抗氧化物酶系统包括SOD、CAT、GPX的mRNA水平(p<0.05)。针对养殖对虾病害频发的现状,本实验还初步研究了中国明对虾(Fenaeus chinensis)养殖水体理化因子变化与对虾白斑综合症病毒(WSSV)感染率的相关性。通过对养成池的水质监测及对虾WSSV检测,发现在WSSV感染率较高的的8月份,水体溶解氧迅速下降,温度处于WSSV易感的温度范围,pH值变化剧烈,,铵盐和硝酸盐含量骤然升高。这说明恶化的水体环境能增加对虾WSSV的易感性,或使潜伏感染WSSV的对虾产生应激反应引起急性感染死亡
刘志鸿[8]2004年在《海洋双壳贝类的免疫特性及调节》文中提出贝类养殖业是我国海洋经济的支柱性产业，由于近年来养殖贝类的大规模死亡现象时有发生，病害日渐严重，已成为贝类养殖业发展的瓶颈问题。贝类的免疫防御系统在防御疾病中扮演着极重要的角色。因此，研究贝类免疫学，以更好地了解和解决贝类养殖中的病害问题已经非常迫切。本文就贝类的血细胞分类和细胞免疫功能，贝类血清凝集素的凝集特性，重金属对贝类免疫活性的影响和免疫调节剂对扇贝免疫活性的调节作用，以及叁倍体扇贝免疫功能进行了系统全面的研究，以期更好的了解贝类的防御机制，并力图从免疫学角度提高贝类的防御能力，服务于生产。 由于血细胞在抵御外来病原中起着重要的作用，因此对血细胞的形态、结构和功能有一个细致的了解对更好的研究免疫防御机制是非常必要的。用流式细胞仪和细胞化学染色方法对毛蚶和栉孔扇贝的血细胞进行了分类研究，并在光学显微镜下对血细胞进行观察。毛蚶的血细胞主要有四种组成，其中以红细胞为主，直径为18.4+0.97μm；透明细胞为5.63±1.49μm，核染色深，瑞氏染色胞质内光镜下未见颗粒；颗粒细胞胞质中含有着色颗粒，瑞氏染液染色后一种为桔红色，8±1.06μm，另一种为兰色，6.3±1.25μm；另外还有极少量血细胞几乎没有细胞质，细胞大小为5.17±1.69μm。栉孔扇贝的血细胞主要有两种组成，分别为透明细胞和颗粒细胞，其中透明细胞瑞氏吉姆萨染液染色细胞质内几乎没有光学显微镜下能够观察到的颗粒，核质比大，直径为7.3±0.97μm；颗粒细胞细胞质中有颗粒，核质比较小，直径为10.24±0.64μm。 对毛蚶和栉孔扇贝血细胞的体外吞噬作用进行研究，结果表明，毛蚶的血细胞能够对白色念珠菌进行体外吞噬，并首次发现在贝类中除了颗粒细胞和透明细胞外，红细胞也能够进行吞噬作用，并在这3种细胞中起主导作用。30℃可以作为毛蚶血细胞体外吞噬作用的最佳反应条件，吞噬百分率可达到62.11％。利用鳗弧菌Vibrio anguillirum对毛蚶进行免疫刺激后，毛蚶血细胞的吞噬能力与对照组相比明显增加。扇贝血细胞也可以在体外吞噬白色念珠菌，光学显微镜下可中国海洋大学博士学位论文摘要以观察到有些白色念珠菌粘附在血细胞膜外部，有些血细胞膜在白色念珠菌粘附处已经形成凹陷，有些血细胞正在伸出伪足正在进行吞噬白色念珠菌。本实验中发现伪足在扇贝的吞噬作用中起着重要的作用。20℃可以作为栉孔扇贝血细胞体外吞噬作用的适宜反应条件，温度对比实验中吞噬百分率最高达到38.05%。 利用改进的NBT法检测栉孔扇贝血细胞活性氧的产生，NBT阴性血细胞呈浅粉红色，无暗蓝色沉淀颗粒。NBT阳性血细胞有光学显微镜可观察到的暗蓝色沉淀物Formazan。实验发现，在自然状态下，栉孔扇贝有能够检测到的活性氧产生，本实验检测的栉孔扇贝的NBT阳性细胞占血细胞总数的20一35%。 分别对海湾扇贝、虾夷扇贝、栉孔扇贝的叁种血细胞胞内酶:碱性磷酸酶(ALP)、过氧化物酶(P OD)、酚氧化酶(PO)进行了免疫细胞化学定位，并对血细胞酶反应阳性率作了统计。结果表明:叁种扇贝血细胞ALP阳性率相差不大，海湾扇贝为46.6%，虾夷扇贝为42.4%，栉孔扇贝为36.8%;叁种扇贝血细胞POD阳性率相差较大，栉孔扇贝阳性率高达502%，海湾扇贝为44.2%，虾夷扇贝仅为17.2%;叁种扇贝血细胞PO孵育反应后，由于海湾扇贝、虾夷扇贝PO反应活性很低，瑞氏染液复染后，无法区分阴性、阳性细胞。实验中对栉孔扇贝PO阳性率进行了统计，栉孔扇贝血细胞PO阳性率为39.3%。 凝集素作为贝类体内参与体液免疫的非特异性免疫因子，在免疫防御活动中发挥着对异体成分进行识别、调理和促吞噬等重要作用。以毛蜡为实验材料，对其血清中的外源凝集素进行研究。毛蜡血清外源凝集素对人的A、B、O血型血细胞、鸡和小鼠的血细胞均有凝集作用，凝集效价分别为256、256、8、16、64;同时它还能对白色念珠菌、啤酒酵母、溶藻胶弧菌等微生物细胞具有凝集作用。毛蜡血清外源凝集素具有一定的pH稳定性和热稳定性。在选用的12种单糖和寡糖中，L一鼠李糖、L一树胶醛糖、麦芽糖、D一半乳糖、蔗糖对毛蜡血清的凝集活性有明显的抑制作用。用弧菌对毛蜡进行免疫刺激，其血清对血细胞的凝集效价明显增加。 溶酶体在贝类的免疫防御中起着重要的作用，在亚细胞水平，溶酶体通常被作为污染物等毒性物质作用的目标，溶酶体的病理性变化也是检测环境胁迫对海洋生物影响的指标。本文以栉孔扇贝为材料，以重金属Cu2+胁迫栉孔扇贝，通过NRR法来检测重金属离子对扇贝血细胞溶酶体膜的损伤，同时结合血细胞活中国海洋大学博士学位论文摘要性氧和血清过氧化氢酶活性的变化趋势，从细胞器的损伤、超氧化物的增加和抗氧化作用的变化关系来研究Cu2+对栉孔扇贝免疫系统的作用。在光学显微镜下可观察到栉孔扇贝血细胞在受到中性红作用后，达到一定量和时间后，血细胞内有小的红色球状液滴，随着作用时间的延长，液滴逐渐膨大，血细胞也由不规则形状而逐渐变圆，膨大，最后可观察到整个血细胞的细胞质成为粉红色。结果表明，Cu2+的胁迫会导致溶酶体膜完整性的降低?
谭崇桂[9]2012年在《几种添加剂对凡纳滨对虾生长、血清非特异性免疫及抗病力的影响》文中认为试验一：饲料中添加Azomite对凡纳滨对虾生长、血清非特异性免疫及抗病力的影响选取初始质量(4.55±0.08)g的凡纳滨对虾(Litopnnaus vannamei)1000尾，随机分成5组，每组4重复，每重复50尾虾，饲喂Azomite(一种天然火山沉积物)添加量为0%(对照组)、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的5组饲料，在20个网箱(2.5m×1.2m×1m)中养殖6周时间，考查Azomite对凡纳滨对虾生长性能、血清非特异性免疫、消化酶活性及抗病力的影响。结果表明：与对照组相比，添加0.2%、0.4%Azomite分别提高凡纳滨对虾增重率13.98%、10.01%(P<0.05)，降低饲料系数0.11、0.09(P<0.05)；Azomite对凡纳滨对虾肌肉水分、灰分、粗脂肪和粗蛋白含量均无影响(P>0.05)。在血清非特异性免疫指标方面，0.2%Azomite组超氧气化物歧化酶，0.4%、0.6%Azomite组碱性磷酸酶活性均较对照组显着提高(P<0.05)；各Azomite添加组均提高凡纳滨对虾血清溶菌酶及酚氧化酶活性（P<0.05）；各组血清丙二醛含量无显着差异(P>0.05)；在消化酶方面，0.2%、0.4%Azomite组胃蛋白酶及肝胰脏脂肪酶，0.2%Azomite组肝胰脏蛋白酶活力均显着高于对照组(P<0.05)；低氧胁迫试验中，各Azomite添加组对虾开始死亡时间及全部死亡时间均比对照组延长，0.2%、0.4%及0.6%Azomite组半数死亡时间较对照组延长；在溶藻弧菌（V.alginolyticus）的攻毒试验中，0.4%Azomite组的累积死亡率显着低于对照组(P<0.05)。综上所述，饲料中添加Azomite可提高凡纳滨对虾生长性能、消化酶活性、血清非特异性免疫和抗病力，建议添加量为0.2%-0.4%。试验二：多糖、寡糖、蛋白酶对凡纳滨对虾生长、消化酶活性及血清非特异性免疫的影响选取初始体重为4.55±0.08g的凡纳滨对虾（Litopnnaus vannamei）1000尾，随机分成5组，每组4重复，每重复50尾虾，分别饲喂0.0%(对照组)、0.2%β-葡聚糖、0.05%黄芪多糖、0.4%甘露寡糖以及175mg/kg蛋白酶PT的五组饲料，在20个网箱(2.5m×1.2m×1m)中养殖6周时间，考察多糖、寡糖、蛋白酶对凡纳滨对虾生长性能、血清非特异性免疫及消化酶活性的影响。结果表明：与对照组相比，饲料中添加0.2%β-葡聚糖、0.4%甘露寡糖及175mg/kg蛋白酶PT可分别提高凡纳滨对虾增重率16.19%、12.78%、11.25%（P<0.05），提高蛋白质效率8.67%、8.32%、8.04%，降低饲料系数0.10、0.09、0.09（P<0.05)。各处理组在肌肉水分、灰分、粗脂肪和粗蛋白含量上无显着差异(P>0.05)。在血清非特异性免疫方面，各添加剂组均显着提高酚氧化酶活力（P<0.05），但在丙二醛含量方面无显着差异(P>0.05)；添加0.4%甘露寡糖可提高溶菌酶、碱性磷酸酶活力（P<0.05），添加0.2%β-葡聚糖、0.4%甘露寡糖可显着提高超氧化物歧化酶活力（P<0.05）。在消化酶活性方面，添加0.05%黄芪多糖及175mg/kg蛋白酶PT可显着提高肝胰脏蛋白酶活性（P<0.05），添加175mg/kg蛋白酶PT显着提高肠蛋白酶活性（P<0.05），添加0.2%β-葡聚糖及0.4%甘露寡糖显着提高胃蛋白酶活性（P<0.05），添加0.2%β-葡聚糖、0.4%甘露寡糖及175mg/kg蛋白酶PT显着提高肝胰脏脂肪酶活性（P<0.05）。上述结果表明，饲料中添加0.2%β-葡聚糖、0.4%甘露寡糖可提高凡纳滨对虾生长性能、血清非特异性免疫，改善消化酶活性；添加175mg/kg蛋白酶PT可提高凡纳滨对虾增重率，改善消化酶活性；添加0.05%黄芪多糖对凡纳滨对虾增重率、血清非特异免疫和消化酶活性无显着影响。试验叁：β-葡聚糖、甘露寡糖、柠檬酸、Azomite复合物对凡纳滨对虾生长、血清非特异性免疫及抗病力的影响选取初始体重为4.55±0.08g的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）1000尾，随机分成5组，每组4重复，每重复50尾虾，分别饲喂0.0%(对照组，F0)、0.4%甘露寡糖＋0.4%Azomite（F1）、0.4%甘露寡糖＋0.3%柠檬酸（F2）、0.2%β-葡聚糖＋03%柠檬酸（F3）、0.2%β-葡聚糖＋0.4%Azomite（F4）的五组饲料，在20个网箱(2.5m×1.2m×1m)中养殖6周时间，考察几种添加剂复合物对凡纳滨对虾生长性能、血清非特异性免疫、消化酶活性及抗病力的影响。结果表明：与对照组相比，饲料中添加F1、F4增重率分别提高16.24%、13.61%(P<0.05),饲料系数分别降低0.11、0.09(P<0.05)。在血清非特异性免疫指标方面，F1溶菌酶活力，F1、F2碱性磷酸酶活力(P<0.05)，F1、F4超氧化物歧化酶活力显着高于对照组(P<0.05)；F1组丙二醛含量显着低于对照组(P<0.05)；各添加剂组酚氧化酶活性均显着高于对照组(P<0.05)。在消化酶活性方面，F1、F4肝胰脏蛋白酶、肠蛋白酶、胃蛋白酶及肝胰脏脂肪酶活性均显着高于对照组(P<0.05)。低氧胁迫试验中，各添加剂组对虾开始死亡时间及全部死亡时间均比对照组延长，F3、F4半数死亡时间较对照组延长；在溶藻弧菌（V.alginolyticus）的攻毒试验中，各添加剂组对虾累积死亡率显着低于对照组(P<0.05)。结论：饲料中添加0.2β-葡聚糖+0.4%Azomite、0.4%甘露寡糖+0.4%Azomite能提高凡纳滨对虾生长性能，血清非特异性免疫，改善消化酶活性，提高抗溶藻弧菌及耐低氧能力；添加0.4%甘露寡糖＋0.3%柠檬酸、0.2β-葡聚糖+0.3%柠檬酸可提高凡纳滨对虾抗溶藻弧菌及耐低氧能力。
明建华[10]2011年在《大黄素和维生素C对团头鲂生长、非特异性免疫以及抗应激的影响》文中进行了进一步梳理大黄素(Emodin)是从中草药大黄(Rheum officinale Baill)根茎中提取的主要有效成分,具有抗菌消炎、抗病毒、抗氧化以及清除氧自由基、降血脂、保护肝脏和免疫调节等多种功效。维生素C(Vc)是鱼类必需的营养素,兼有免疫增强和抗氧化的双重功效,但大多数鱼类缺乏合成Vc所需的L-古洛糖酸内酯氧化酶(L-gulonolactone oxidase, GLO),必须从食物中摄取Vc。为了研究大黄素和高剂量Vc对鱼类生长、非特异性免疫以及抗应激的影响,选用我国主要淡水养殖鱼类之一的团头鲂(Megalobrama amblycephala, Yih)作为研究对象,首先分离、克隆出团头鲂两种热休克蛋白70 cDNA的全长序列,并对其基因结构和表达特征进行了分析。然后,在此基础上构建了团头鲂两种HSP70s的原核表达系统,并优化了表达条件,对表达产物进行了纯化和鉴定。同时,选取1200尾健康的团头鲂,体质量(133.44±2.11)g,随机分成4组,其中1组为对照组,投喂基础日粮(Vc含量50.3mg/kg),另外3组为试验组,投喂饲料是在基础日粮中分别添加60 mg/kg大黄素、700 mg/kg Vc、60 mg/kg大黄素+700 mg/kg Vc,每组设3个重复。连续投喂60 d后结束饲养试验,取鱼进行拥挤胁迫、高温应激和感染嗜水气单胞菌的应激试验。1团头鲂两种热休克蛋白70基因克隆与序列分析采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法(rapid amplification of cDNA ends, RACE),分别从室温和34℃热激团头鲂的肝脏中克隆到两种热休克蛋白70基因,分别命名为Ma-HSC70和Ma-HSP70基因。它们的cDNA全长分别为2336和2224 bp[不包括poly(A)],分别含有1950和1932 bp的开放阅读框,编码649和643个氨基酸,分子量约为71.24和70.52 kD,理论等电点为5.25和5.30。Ma-HSC70基因在编码区含有7段内含子,所有内含子均遵守GT/AG法则,为组成型HSC70,而Ma-HSP70基因在编码区不含内含子,为诱导型HSP70。氨基酸序列分析表明,Ma-HSC70和Ma-HSP70均含有HSP70家族的3个签名序列,两个部分重迭的双向核定位信号序列(nuclear localization signal sequence, NLS)以及胞质的特征基序EEVD等。同源性分析表明,Ma-HSC70与异育银鲫等脊椎动物HSC70的氨基酸序列相似性高达93.0%以上,而Ma-HSP70与鲫鱼等脊椎动物HSP70氨基酸序列的相似性高达85.0%以上,它们之间氨基酸序列相似性为86.5%。生物信息学分析显示,团头鲂两种HSP70s基因所编码的蛋白以亲水性区域为主,均具有丰富的B细胞抗原位点,无信号肽,为非典型的分泌型蛋白,无明显的跨膜区域；同时还含有众多的蛋白激酶C磷酸化位点、N-肉豆蔻酰化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和N-糖基化位点,推测这些位点在蛋白质折迭,转运,细胞内定位以及细胞信号转导与调控中发挥重要作用。这两种蛋白的二级结构均以a-螺旋和无规卷曲为主,空间结构包括N端ATPase功能域和C端多肽结合功能域。2大黄素和维生素C对团头鲂生长、生理生化指标以及两种HSP70s mRNA表达的影响饲养试验结束后,测定团头鲂的生长性能,并采样检测鱼的肌肉成分、血液和肝脏生化指标以及肝脏两种HSP70s mRNA的表达水平。结果表明,与对照组相比,大黄素、Vc组显着提高了鱼体增重率和特定生长率,血清中总蛋白(TP)、溶菌酶(LSZ)和碱性磷酸酶(AKP)的水平,肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)的活性和诱导型HSP70 mRNA的基础表达水平,降低了饵料系数、死亡率、血清中皮质醇(COR)、甘油叁酯(TG)以及肝脏丙二醛(MDA)的含量(P<0.05)；配伍组虽然血清中TP、LSZ的含量以及肝脏HSP70 mRNA的水平显着升高,肝脏MDA的含量也显着降低(P<0.05),但均未表现出协同增效作用。此外,与对照组相比,大黄素组还显着提高了团头鲂肝脏过氧化氢酶(CAT)的活性(P<0.05),而Vc和配伍组CAT的活性与对照组的差异不显着(P>0.05)；其它一些指标如血清中葡萄糖(GLu)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、胆固醇(CHOL)、肝脏组成型HSC70 mRNA的表达水平、鱼体形体指标以及肌肉组成成分等各组之间差异均不显着(P>0.05)。3大黄素和维生素C对团头鲂在拥挤胁迫下的生化指标及两种HSP70s mRNA表达的影响饲养试验结束后,从各池中取25尾规格基本一致的团头鲂,进行连续48 h的拥挤胁迫(100g/L)试验,分别于0h、12h、24h、48h取样分析团头鲂血液和肝脏的生化指标以及肝脏两种HSP70s mRNA的表达水平,并统计各组鱼的累积死亡率。结果表明,在拥挤胁迫后,与对照组相比,大黄素、Vc组不同程度地提高了团头鲂血清中TP和AKP的水平,肝脏中SOD和CAT的活性以及HSC70和HSP70 mRNAs的表达水平,降低了血清中COR、GLU、GPT、GOT、TG以及肝脏MDA的水平,而LSZ的活性表现为先下降后升高；配伍组中,这些指标虽然有类似以上的变化趋势,但大多差异不显着(P>0.05),且同样未表现出协同增效作用。此外,各组鱼血清CHOL的水平在拥挤胁迫前后的差异均不显着(P>0.05)。统计表明,大黄素和Vc组鱼的累积死亡率在拥挤胁迫24h、48h均显着低于对照组(P<0.05),而配伍组与对照组的差异均不显着(P>0.05)。4大黄素和维生素C对团头鲂在高温应激下的生化指标及两种HSP70s mRNA表达的影响饲养试验结束后,从各池中取25尾规格基本一致的鱼进行高温应激(34℃)试验。取样检测团头鲂在高温应激前后血液和肝脏的生化指标以及肝脏两种HSP70s mRNA的表达水平,并统计各组鱼在高温应激下的累积死亡率。结果表明,在高温应激后,与对照组相比,大黄素、Vc组不同程度地提高了团头鲂血清TP、LSZ和AKP的水平,肝脏SOD和CAT的活性以及HSC70和HSP70 mRNAs的表达水平,降低了血清COR、GLU、GPT、GOT、TG以及肝脏MDA的水平；配伍组中,这些指标虽然也有类似以上的变化趋势,但大多差异不显着(P>0.05),且未表现出协同增效作用。此外,各组鱼血清胆固醇的含量在高温应激前后的差异均不显着(P>0.05)。统计表明,在高温应激下,Vc组鱼的累积死亡率均显着低于对照组,大黄素组鱼的累积死亡率除6h外,也显着低于对照组(P<0.05),而配伍组与对照组的差异均不显着(P>0.05)。5大黄素和维生素C对团头鲂感染嗜水气单胞菌后的生化指标及两种HSP70s mRNA表达的影响饲养试验结束后,从各池中取15尾团头鲂进行腹腔注射感染嗜水气单胞菌试验,并在攻毒前后采样检测团头鲂血液和肝脏的生化指标以及肝脏两种HSP70s mRNA的表达水平；另从各池中取10尾鱼进行同样的攻毒试验,并统计攻毒后鱼的累积死亡率。结果表明,经攻毒后,与对照组相比,大黄素、Vc组不同程度地提高了团头鲂血清TP.LSZ和AKP的水平,肝脏SOD和CAT的活性以及HSC70和HSP70 mRNAs的表达水平,降低了血清COR、GLU、GPT、GOT、TG以及肝脏MDA的水平；配伍组中,这些指标虽然有类似上述的变化趋势,但大多与对照组的差异不显着(P>0.05),且未表现出协同增效作用。此外,各组鱼血清胆固醇的含量在攻毒前后的差异均不显着(P>0.05)。统计也表明,经攻毒后,大黄素和Vc组鱼的累积死亡率在24 h、48 h均显着低于对照组(P<0.05),而配伍组鱼的累积死亡率与对照组的差异均不显着(P>0.05)。6团头鲂两种热休克蛋白70的原核表达、纯化及鉴定采用PCR方法扩增团头鲂组成型HSC70和诱导型HSP70基因完整的编码区片段,并分别克隆到原核表达载体pET-22b(+)中,经双酶切和DNA测序鉴定后,将这两种重组表达质粒分别转化大肠杆菌BL21 (DE3),用1 mmol/L IPTG在不同温度及时间下进行诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE分析,建立最佳诱导表达条件。采用Ni-NTA His Bind Resins亲和层析和DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱层析对目的蛋白进行纯化,并进行Western-blotting验证。结果表明,成功构建了团头鲂两种重组表达质粒pET-22b(+)/Ma-HSC70和pET-22b(+)/Ma-HSP70,表达融合蛋白的相对分子量均约为72 kD,并能与兔抗人HSP70多抗进行特异性结合,这两种HSP70s融合蛋白经纯化后的纯度均达到95%以上。在较高温度(37℃)下,有利于融合蛋白的快速大量表达,但易形成包涵体；在较低温度(25℃)下,有利于融合蛋白的可溶性表达,但也会降低融合蛋白的表达速度。综合各种因素,本实验选择融合蛋白Ma-HSC70在25℃和Ma-HSP70在30℃下分别诱导7h作为可溶性表达的最佳条件。总之,本研究首次从团头鲂肝脏中克隆到两种HSP70s基因,并对该基因的结构和表达特征进行了分析,确定Ma-HSC70基因为组成型,而Ma-HSP70基因为诱导型。在此基础上成功构建了团头鲂两种HSP70s的原核表达系统,并优化了表达条件,最后得到了纯度在95%以上的两种热休克蛋白70的融合蛋白。这些为进一步研究这两种蛋白的结构和功能以及相应抗体的制备打下了基础。饲养和应激试验则表明,在基础日粮中添加大黄素60mg/kg或Vc 700 mg/kg可促进团头鲂的生长,降低饵料系数,提高鱼体的非特异性免疫力、抗氧化和抗应激能力,减少应激死亡率。二者配伍则效果不佳,其相互作用的机理还有待于进一步的研究。
参考文献：
[1]. 弧菌和盐度胁迫下饵料中添加抗氧化物质对虾体的影响[D]. 王建梅. 河北大学. 2003
[2]. 盐度对凡纳滨对虾的生理影响及其营养调节[D]. 李二超. 华东师范大学. 2008
[3]. 两种主要无机氮胁迫下凡纳滨对虾免疫因子变化及其对副溶血弧菌易感性的研究[D]. 葛红星. 上海海洋大学. 2014
[4]. 饲料中添加镁、硒和虾青素对中华绒螯蟹幼蟹抗环境胁迫效应的研究[D]. 沈振华. 华东师范大学. 2017
[5]. 虾青素对日本沼虾生理生化特征的影响[D]. 谢剑华. 河北大学. 2008
[6]. 外界刺激与环境胁迫对背角无齿蚌免疫因子的影响[D]. 饶玉才. 南昌大学. 2007
[7]. 虾青素对凡纳滨对虾的免疫防护及对虾养殖的水质监测和WSSV检测[D]. 王慧春. 河北大学. 2010
[8]. 海洋双壳贝类的免疫特性及调节[D]. 刘志鸿. 中国海洋大学. 2004
[9]. 几种添加剂对凡纳滨对虾生长、血清非特异性免疫及抗病力的影响[D]. 谭崇桂. 上海海洋大学. 2012
[10]. 大黄素和维生素C对团头鲂生长、非特异性免疫以及抗应激的影响[D]. 明建华. 南京农业大学. 2011
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