陈翔[1]2003年在《微流路医学诊断芯片的制作及研究》文中提出微全分析系统(u—TAS)研究是目前医用仪器发展的重要方向和前沿领域，在疾病检测、环境监测、药物筛选等方面有着重要的意义。尤其是在医学诊断方面，微全分析系统可有效的降低污染，减小试剂消耗，降低成本，实现自动化。目前，关于微全分析系统在医学疾病诊断方面的研究刚刚起步，本论文旨在对微全分析系统在医学诊断方面的应用进行探究。 用于医学诊断的微全分析系统主要可分为叁个部分：样品前处理，产物扩增检测(包括电泳或杂交检测)。其主要技术是制作微流路的生物芯片(Microfluidic Biochip)，针对这些，本文主要的研究内容如下： 1．制作了两类基于SPE(Solid Phase Pxtraction)法的DNA提取芯片-硅芯片和磁珠吸附的PDMS芯片。经实验证明：这两种方法都可有效的对PCR产物中的DNA进行回收，同时还利用硅芯片进行了酵母菌的DNA提取，取得了较好的结果。 2．对本室制作的PCR芯片进行了验证，主要是进行荧光PCR检测，建立了一套适宜做荧光PCR的方法和系统，为实时荧光检测研究创造了条件。 3．制作并研究了芯片上的免疫反应实验。在PDMS芯片上使用磁珠介导，成功的完成了人IgG在磁珠上的固定、人IgG和荧光标记的羊抗人IgG在芯片上的免疫反应。 4．制作并研究了PDMS芯片上的DNA分子杂交反应。针对PDMS新型材料，试验了两种DNA分子的固定方法，确定了生物素—亲和素介导的DNA分子固定化方法，并使用此芯片和固定方法进行了芯片上的DNA杂交反应。同时摸索出消除非特异性信号，提高反应特异性的方法，取得了较好的实验结果。
陈翔[2]2005年在《微流体及纳米磁珠在生物医学上的应用研究》文中认为随着微流体技术的发展，其在分析化学、免疫学、化学合成、基因测序、蛋白分离、蛋细胞分析等都得到了越来越广泛的应用。而纳米技术的出现，为微流体芯片的研究提供了新的手段，纳米颗粒做为固相载体、信号检测标记、反应增强剂等可以广泛的应用在微流体芯片上，增强了微流体芯片设计及操作的灵活性。 本报告在研究微流体基础理论、工艺制作及相关功能器件的同时，使用纳米磁珠，探索其与微流体相结合在生物医学上的应用。主要由以下工作组成： 1) 微流体中流体基础理论研究及数值仿真 2) 微流体重要工艺：叁维塑性材料芯片及UV-LIGA工艺的研究。 3) 微流体重要器件PCR微流体芯片的封装及测试研究。 4) 纳米磁珠与微流体的结合：磁珠介导的PDMS提取芯片、电磁场的磁珠微系统、新型纳米磁性光刻胶制作的磁分离芯片等功能器件的研究。
赵伟[3]2004年在《病毒性肝炎基因芯片诊断技术研究和临床应用》文中指出基因芯片，又称微型DNA阵列(microarry)，是按特定的排列方式，将大量基因探针/基因片段固定在硅片、玻片和塑料片上，通过计算机处理，高效、大规模获取相关生物信息。目前，该技术已用于基因表达谱分析、新基因发现、基因突变、基因多态性分析、药物筛选和基因测序及疾病的诊断。 中国是肝炎大国，有近1.2亿乙肝病毒携带者，1500万丙型肝炎患者。目前，对于肝炎病毒的检测，主要是通过测定抗原、抗体(病毒蛋白质)来完成，在诊断上存在免疫滞后性。对肝炎病毒基因亚型分型和基因突变检测，多用核苷酸测序的方法，该方法试剂昂贵，操作复杂。 我们将基因芯片技术应用到肝炎病毒的诊断上，通过生物医学数据库(美国生物技术信息中心NCBI)对乙型和丙型肝炎病毒基因进行检索和筛选，应用分子生物学软件，进行序列分析、引物及探针设计，制成病毒性肝炎基因诊断芯片，并在临床实践中应用，可快速、敏感、经济地完成对病人血清及肝组织中肝炎病毒DNA、RNA的基因诊断、亚型分型和基因突变检测。目前已完成以下工作，并得出主要研究结论如下： 1．本科研通过生物信息方法从基因库中筛选出代表乙型、丙型病毒性肝炎的基因特征序列，按照检测目的，设计出不同的寡核苷酸探针阵列，用点样仪将探针固定在经过特殊处理的玻璃载片上，制成3种特殊的病毒性肝炎基因诊断芯片：①．乙型肝炎基因诊断芯片，可以检测乙肝病毒有无，对病毒进行基因分型。对用贺普丁治疗后的YMDD变异进行突变检测。②．丙型肝炎基因诊断芯片，设计20条特异性寡核苷酸探针阵列，可对丙型肝炎6个主要基因型1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、4b、5a、6a，10个亚型进行分型诊断。③．乙型、丙型肝炎双检基因芯片，可对乙型、丙型肝炎同时定性检测。 2．用研制的基因诊断芯片开展临床检测，对40列乙型肝炎病人血清中的HBVDNA，20例丙型肝炎血清中的RNA与健康人血清同时进行双盲检测，与检测乙肝病毒标志物金标准美国雅培试剂微粒子免疫发光定量测定的HBsAg、HBeAg及light cycle核酸定量仪检测的HBVDNA、HCVRNA进行对比，确定肝炎基因诊断芯片的准确性和假阳性、假阴性率。
高英堂[4]2003年在《肝炎病毒（HBV、HCV）基因诊断芯片的研制和新型肝炎病毒SENV的实验研究》文中进行了进一步梳理HBV和HCV是临床上最常见、危害最大的两种肝炎病毒,其长期持续的慢性感染与肝硬化、肝癌的发生发展密切相关。随着人们对肝炎病毒认识的不断深入,尤其是肝炎病毒基因组学研究的进展,使临床上现有的血清免疫学方法和以单一PCR技术为主的检测方法其局限性越来越明显,由于不能真实、全面地反映患者体内病毒基因组的各种变异和动态变化,对患者个体的针对性诊断和治疗也受到很大限制。为及时将肝炎病毒的基因研究成果应用于临床实践,需要利用新的分子生物医学技术,研究和开发肝炎病毒的新型诊断方法和诊断试剂。据此,我们重点研究了HBV和HCV基因诊断芯片的制备、应用,以及新型肝炎病毒SENV的实验研究。本文涉及的实验方法包括生物信息学分析(即芯片上探针和PCR引物的设计、测序序列的检索和比对)、探针和PCR引物的合成、PCR产物直接测序、基因芯片上探针的点样制备方法、血清中病毒的提取方法、PCR扩增和地高辛标记、分子杂交及显色、芯片杂交结果的数据处理等。芯片制备过程中的优化环节包括:尼龙膜型号和探针固定照射剂量的选择,探针3′末端加尾碱基数的确定,利用探针的互补寡核苷酸序列和部分PCR产物的测序验证芯片杂交的特异性,利用PCR扩增直接参入地高辛信号分子,分析其长度、浓度及杂交时间对杂交信号的影响,比较了HBV标本的不同处理方法和不同PCR引物组合的扩增效率。经过二年多的反复实验研究,初步完成HBV基因芯片、HCV基因芯片和HBV、HCV联检芯片的制备。在HBV基因芯片的研制过程中,先后制备了HBV-450S、HBV-90S、HBV-120S、HBV-P/S区75S和HBV-C/X区25S等不同点阵数的基因芯片。最早的HBV-450S芯片包含的基因信息最丰富,理论上可检测HBV的7种基因型、4种血清亚型、4个P基因耐药相关的突变位点、2个S抗原突变位点、6个C区变异和X区的缺失突变,但部分探针特异性较差。在随后的改进中,HBV-P/S区75S是目前临床实验研究较好的芯片,对基因型、血清亚型和拉米夫定耐药突变均能特异检测。同时,利用制备的HBV基因芯片,对45例纳入葛兰素威康公司评价新药拉米夫定疗效临床研究的乙肝患者、270例叁中心医院的门诊慢性乙型肝炎患者和466例来自6个
潘静[5]2006年在《基于超顺磁的生物大分子微球的制备及在微流控系统分析中的应用》文中认为免疫分析是生物学中最重要的分析方法之一,广泛应用于临床诊断和生物学研究中。常规免疫分析技术存在的一些缺陷限制了其在现场快速检验中的应用。微流控分析作为一种新的微型化分析平台,通过微细加工技术在芯片上构建由各种微功能元件构成的微流路系统,于芯片上进行一种或连续多种的反应,达到对样品高通量快速分析的目的。将微流控芯片用于免疫分析,可以改善免疫分析性能:①.易于集成化便携化,有希望用于各类现场分析;②.试剂消耗已降低至数微升水平,并随着技术水平的提高,还有可能进一步减少,这降低了分析费用和贵重的单克隆抗体和抗原的消耗;③.微流控分析系统具有极高的效率,许多微流控芯片可在数秒至数十秒完成测定、分离或其他更复杂的操作。但目前的微流控免疫分析都是一次性使用,导致检测成本过高,由于加工工艺的限制不同芯片之间的差异也会导致检测的系统误差增大;另外大部分微流控分析芯片将抗体直接固定在微通道内,这种固定方法可能会使抗体变性以及增加非特异性吸附,使分析的灵敏度降低。本研究根据超顺磁性微球的特性,以超顺磁性微球为抗原抗体的固相载体,通过在芯片系统中构建电磁场来实现磁性微球的富积,免疫反应的定位,以便微流控芯片的重复使用。将微流控芯片、超顺磁性微球技术、化学发光技术相结合,研制一种基于微流控芯片的免疫分析系统,使检测仪器的体积更小,检测速度更快,操作更简便。满足免疫检测的现场化及野战条件的特殊需要。获得的主要结果和结论如下:一、自制了超顺磁性聚苯乙烯高分子微球。采用化学共沉淀法制备Fe_3O_4磁流体,测定了其粒径分布,磁响应性,优化了制作条件,制作的磁流体粒径1.2μm-1.5μm以下,能达到本研究的超顺磁性及粒径的要求;制作了羧基化高分子磁性微球,磁响应性良好,粒径分布均匀,都在2μm以下。为本研究及将来的相关研究创造了条件。二、通过在聚苯乙烯磁性微球上固化葡萄糖氧化酶、IgG及AFP抗体,得到了很好的固化率,在对酶及抗体的生物活性无影响的情况下,对酶和抗体的固化条件都进行了优化,建立了稳定、高效的免疫磁性微球的固化条件,为在微流控分析系统中进行免疫分析奠定技术基础。
黄辉[6]2006年在《基于磁性微球的PMMA微流控免疫分析芯片系统的研究》文中研究说明随着分析化学、生物学、电子学、计算机技术等领域的快速发展,新的分析仪器不断应用于检验医学,使检验医学得到了快速的发展。近年来检验医学形成了一个新的分支-现场快速检验,现场快速检验使用微型的便携式仪器或者快速简便的检测方法在病床、家庭或者野外等场所实现对各种标本快速的测定。现场快速检验由于其简便、快速及相当高的准确性,将是未来医学检验发展的主力,现场快速检验的高速发展将对检验医学带来新的发展机遇。免疫分析技术作为生物学中一种重要的分析方法,由于具有高度的特异性和敏感性,已广泛用于临床医学诊断、药学分析、环境监测及生物学研究等领域,但目前常规免疫分析方法存在分析时间长、操作繁琐等缺点,限制了其在现场快速检验中的运用。商品化的自动分析仪器虽然分析效率高、分析准确度好,但这类仪器体积比较大,价格昂贵,分析成本高,目前只在一部分大型医院使用。因此研制一种适合于中小型医院和基层医疗单位及各种现场检测的微型化、便携化的免疫分析仪器成为人们关注的焦点。微流控分析作为一种新的微型化分析平台,通过微细加工技术在芯片上构建由各种微功能元件构成的微流路系统,于芯片上进行一种或连续多种的反应,达到对样品高通量快速分析的目的。将微流控芯片用于免疫分析,可以改善免疫分析性能:①缩短反应时间,提高分析效率。许多微流控芯片可在数秒至数十秒完成测定、分离或其他更复杂的操作。②节约试剂和样本,微流控芯片分析的试样与试剂消耗已降低至数微升水平,并随着技术水平的提高,还有可能进一步减少,这降低了分析费用和贵重的单克隆抗体和抗原的消耗。③易于集成化便携化、操作简便,更易实现自动化,有希望用于各类现场分析。但目前的微流控免疫分析都是一次性使用,导致检测成本过高,由于加工工艺的限制不同芯片之间的差异也会导致检测的系统误差增大;另外大部分微流控分析芯片将抗体直接固定在微通道内,这种固定方法可能会使抗体变性以及增加非特异性吸附,使分析的灵敏度降低。本研究根据超顺磁性微球的特性,以超顺磁性微球为抗原抗体的固相载体,并在其表面进行免疫反应,通过在芯片系统中构建微型电磁场来实现超顺磁性微球在芯片中的定位和释放,实现微流控芯片的重复使用。研究将微流控芯片、超顺磁性微球技术、化学发光技术结合起来,试图研究一种基于微流控芯片的免疫分析系统,以满足能够基层医院及在军事等特殊条件下进行免疫分析的需要。在本项目研究中,我们所获得的主要结果和结论归纳如下:
张登科[7]2006年在《悬浮式生物芯片检测中的图像处理研究》文中提出生物芯片是近年来生命科学领域一项新兴的尖端应用技术,人们在基因组研究、疾病诊断与防治、药物合成及药理药效分析、司法鉴定等领域对其深为重视。目前采用悬浮技术的生物芯片与传统的固态基板平面式生物芯片相比有较大优势,正逐渐成为研究的热点。而悬浮式生物芯片的检测通过图像处理来获得分析结果,目前国内外尚缺少相应的研究。 本论文对悬浮式生物芯片检测中的图像处理进行了研究,首次提出了较为完整的图像处理解决方案,并使用虚拟仪器开发环境LabVIEW具体实现。另外本文还对检测系统中承载悬浮试液的微通道中的流场运动情况进行了研究,将粒子图像测速技术PIV应用到本系统的通道分析中,能够指导通道的加工并提高悬浮式生物芯片分析的可靠性。 论文首先介绍了生物芯片的原理,对悬浮式生物芯片并行检测方法中各模块进行了分析。在此基础上,提出了完整的图像处理解决方案,包括预处理、目标定位、提取信号强度、确定背景等,重点分析了样点的识别定位技术。利用LabVIEW的模块化和数据流编程方法进行了软件实现。接着,分析了检测通道中流场运动情况对最终分析结果的影响,研究了PIV无扰动测速技术,着重分析了处理软件的设计。论文给出了Spherotech公司的荧光微球的检测实验结果并进行了分析,验证了悬浮式生物芯片并行检测方法的可行性和图像处理方案的效果。另外还给出了对系统液流通道进行PIV分析的初步结果,并对实验结果进行了分析。最后对课题的研究进行了总结,并对后续研究作了展望。
梁振普[8]2004年在《XNA微阵列、HaSNPV bacmid构建以及HzAM1细胞RpL21基因的研究》文中指出本论文共包括4章内容。 第1章综述了生物芯片、电化学分析、杆状病毒、Cre/LoxP系统和核糖体的研究情况。 第2章分讨论基于纳米金表面XNA微阵列平台制作的一种新颖的生物电极。电化学分析表明，单分子层修饰生物电极在以二茂铁为指示剂的情况下可以得到相对较高的响应信号。二茂铁可以激活亚铁氰化钾在电极表面的电化学活性。当足量的DNA被固定在单分子层表面时，电化学信号只有微小的降低。重复性实验证明单分子层在纳米金表面的固定是非常牢固的。该生物电极和XNA微阵列分析平台为不同生物样品的分析提供了通用的工具。 论文的第3章是为构建HaSNPV含LoxP位点的bacmid开展的一系列前期研究。首先利用3’RACE的方法证明了ORF6和ORF7之间的区域可能为非功能区，可以作为原核复制子的插入位点。其次，将pBluelox的SV40-lacZ基因换成了hsp70-lacZ基因，并消除了质粒上的BamHI酶切位点，获得了中间质粒pBluelox2。在pBluelox2上进一步克隆了ORF6及带LoxP位点的ORF7，成功地构建了转移载体pBlueLZP。目前线性化的pBlueLZP与HaSNPV基因组的同源重组实验仍在进行中。 第4章从HzAM1细胞的mRNA和基因组DNA中分别克隆了RpL21的cDNA及全基因。该基因全长775bp,包括一个295bp的内含子，编码159个氨基酸的蛋白质，推定其分子量为17.97kDa，等电点为10.996。该蛋白质具有3个磷酸化位点和1个糖基化位点，在C端具有一个α螺旋区，氨基酸序列与其它物种的RpL21蛋白具有较高的同源性，整个序列中有两段保守区域， N端的保守性大于C端。利用RpL21氨基酸序列所做的进化树能够较好地反映物种间的亲缘关系。
汤建新[9]2005年在《活版印刷DNA芯片原位合成新方法及新基材研究》文中进行了进一步梳理DNA芯片作为一种高通量DNA分析检测手段,在基因表达、疾病诊断、药物筛选等领域具有广泛应用。目前,DNA芯片发展有两大趋势:其一是以Affymetrix公司为代表的向高密度基因芯片发展,争取把人类所有基因探针都固定在一块芯片上,其发展将对生物学的基础研究起到革命性的推动,并有可能在将来引发新的革命;另一种发展是以Nanogen公司为代表的过程集成化趋势,由于在实际临床诊断及军事、司法应用中,大多数情况下并不需要高密度的DNA芯片,而是要求便携式、灵活、速度快和成本低,因此,发展这种高集成、中低密度的DNA芯片可以在近几年进入市场并发挥社会效益。随着人类基因组计划的完成以及功能基因组研究的深入,要求对大量的基因信息进行高灵敏度、高特异性、定量化的检测。这对DNA芯片技术提出了挑战,同时也为DNA芯片技术的发展提供了机遇。然而,基因芯片的制备还存在着成本高、合成效率低等缺陷。例如,探针数量稍高传统的基因芯片价格在$150,000(US$1,220) to $350,000之间,价格十分昂贵;Affymetrix’s特有的光脱保护原位合成方法需要制作一系列特定的光掩模,成本高,不适合小批量需求,并且对不同的用户需求和不同的基因芯片必须重新设计光掩模。尚有待于完善,为此,我们提出了一种中、低密度DNA芯片原位合成方法—活版印刷法,它完全摒弃了原位合成中烦琐而昂贵的掩模制备过程及点样法中昂贵的探针修饰或标记,而是应用纳米微通道管状纤维载体材料按照预先设计的探针,排列组合成所需的一系列快速印刷母版,每一张母版对应于一种合成单体试剂。具有操作简单、成本低、单步合成产率高等优点。本论文的主要贡献如下:1.本文提出了一种适合于制备活版印刷法原位合成基因芯片的片基的方法——在0.01 mol/L NaOH/(H2O-CH3OH)的介质中水解微孔尼龙6膜,使其表面漏出活性氨基,然后直接用于DNA原位合成,可得到一种中、低密度原位合成基因芯片新片基。红外光谱和光电子能谱表征结果表明:在尼龙6膜表面形成了大量氨基;紫外光谱优化了水解条件:pH值为12、水解回流时间36小时、甲醇催化;该水解膜连接到391-DNA合成仪上,按照一定的程序合成5’-AAC CAC CAA ACA CAC-3’探针,收集每一步脱除的DMT溶液,测其紫外光谱,可计算其偶联效率大于98%。2.使用低温等离子体处理技术,制备了第二种适合于活版印刷法原位合成基因芯片的片基——以H2和N2混合气体等离子体处理了聚丙烯微孔膜,采用扫描电镜观察了处理前后膜的形貌变化;真空全反射红外光谱和X射线光电子能谱证实在其表面接枝了大量活性氨基;用紫外光谱定量计算得知,所接枝的氨基浓度大约为0.5μmol/cm2。该改性膜可直接用于DNA的原位合成,其合成的DNA探针密度远高于功能化玻璃片基的探针密度,并可得到98%以上的偶联效率。3.本论文分别采用氢气/氮气、氨气和氧气叁种不同气氛的等离子体处理了聚丙烯片基,然后分别进行寡核苷酸原位合成。光电子能谱(XPS)证实了在其表面分别接枝了大量氨基和羟基。荧光扫描分析了在叁种方法处理的聚丙烯片基上合成的寡核苷酸与靶序列杂交的荧光强度。结果表明:叁种方法处理的聚丙烯片基都可用于DNA原位合成,但从处理工艺和荧光分析结果来看,均以氮气/氢气等离子体处理的聚丙烯片基最佳。4.本文将微流体装置连接到391 DNA合成仪上,在H2/N2等离子体处理的聚四氟乙烯表面直接原位合成了四条DNA探针,通过与荧光标记的靶序列杂交后,得到了一个32个点阵的寡核苷酸阵列。X射线光电子能谱证实了经等离子体处理的聚四氟乙烯表面接枝大量活性氨基;荧光扫描分析比较了在等离子处理的聚四氟乙烯片基上合成的四条寡核苷酸序列与靶序列杂交后的荧光强度,其互补序列(S1)、错配1、2和3个碱基的序列(S2 S3 S4)的荧光强度比值为117.8:78.4:13.89:7.97.结果表明:以H2和N2混合气体等离子体处理的聚四氟乙烯可以直接用于寡核苷酸原位合成,且具有很好的杂交特异性,有望成为一类高密度基因芯片新型片基。5.本文研究了活版印刷法DNA芯片制备原理与工艺流程:探讨了寡核苷酸的压印原理、固相合成方法以及手动活版印刷法DNA芯片制备设备,从反应池模具设计、纤维管的选择及合成工艺都做了详细描述。并对活版印刷法寡核苷酸原位合成条件进行了优化:对合成中各试剂的性质及其对偶联反应的影响;封闭试剂对寡核苷酸偶联效率的影响;四唑和核苷酸单体混合液的反应活性等因素进行了详细的探讨。通过上述工艺的研究,我们成功地应用活版印刷技术制备出了16个和160个位点的寡核酸阵列的芯片,各阵点上寡核苷酸的杂交荧光强度基本一致;通过与靶序列杂交,成功地获得了预想的结果,实现了单个碱基错配的检测。并将活版印刷法与点样法制备的160个位点的寡核酸阵列进行了比较。
周笑伶, 曹勤, 王生余[10]2019年在《HPV检测方法及微流控芯片技术的应用》文中研究说明人乳头瘤病毒(HPV)引起的黏膜感染是宫颈癌的主要致病因素,鉴于病毒流行广泛,感染反复和潜伏时间较长等特点,亟待发展新的、低成本的技术和方法,进行有效的人口水平筛查和监测。近些年,随着检测宫颈癌和HPV-DNA的方法与技术的发展,出现了集成核酸提取、扩增和检测一体化的微流控芯片技术,该技术由于具有微型化、成本低廉、信号稳定、灵敏度高和特异度强等优势而被视为宫颈癌和HPV-DNA的理想的筛查平台。微流控芯片技术的出现为低资源配置下的癌症筛选、诊断、疫苗接种和术后反应的监测提供了理论依据和技术支持。
参考文献：
[1]. 微流路医学诊断芯片的制作及研究[D]. 陈翔. 中国科学院研究生院（电子学研究所）. 2003
[2]. 微流体及纳米磁珠在生物医学上的应用研究[D]. 陈翔. 中国科学院研究生院（上海微系统与信息技术研究所）. 2005
[3]. 病毒性肝炎基因芯片诊断技术研究和临床应用[D]. 赵伟. 南京农业大学. 2004
[4]. 肝炎病毒（HBV、HCV）基因诊断芯片的研制和新型肝炎病毒SENV的实验研究[D]. 高英堂. 南开大学. 2003
[5]. 基于超顺磁的生物大分子微球的制备及在微流控系统分析中的应用[D]. 潘静. 第叁军医大学. 2006
[6]. 基于磁性微球的PMMA微流控免疫分析芯片系统的研究[D]. 黄辉. 重庆大学. 2006
[7]. 悬浮式生物芯片检测中的图像处理研究[D]. 张登科. 浙江大学. 2006
[8]. XNA微阵列、HaSNPV bacmid构建以及HzAM1细胞RpL21基因的研究[D]. 梁振普. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）. 2004
[9]. 活版印刷DNA芯片原位合成新方法及新基材研究[D]. 汤建新. 东南大学. 2005
[10]. HPV检测方法及微流控芯片技术的应用[J]. 周笑伶, 曹勤, 王生余. 国际检验医学杂志. 2019
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