（浙江省嘉兴市第二医院儿科 浙江 嘉兴 314000）
【摘要】 HIBD是新生儿神经发育异常和死亡的主要原因之一，严重者留有永久性神经系统缺陷，如脑瘫、智力低下。其发病机制及神经细胞损伤后修复机制尚不完全清楚，临床缺乏特异治疗方法。目前临床上用于对新生儿HIBD血清标志物敏感性和特异性均较差，因而寻找新的生物学指标具有重要的意义。检测Micro RNA有望在基因转录水平早期诊断HIBD，将来也可能作为HIBD治疗的新靶点。
【关键词】 微小RNA；新生儿缺氧缺血性脑损伤；诊断；靶点治疗
【中图分类号】R742 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）25-0005-03
The research progress of small RNA with neonatal hypoxic ischemic brain damage
Zhang Shijie, He Mengzao, Teng YiQun (communication). Jiaxing Second Hospital, Zhejiang Province, Jiaxing 314000, China
【Abstract】HIBD is abnormal neonatal neurological development and one of the main causes of death, severe cases will leave permanent neurological defects, such as cerebral palsy, mental retardation. Its pathogenesis and repair after injury of nerve cells in the mechanism is not fully clear, clinical lack of specific treatment. So looking for a new biological indicator has the vital significance. Detection of Micro RNA is expected to early diagnosis of HIBD in gene transcription level, may also be in the future as a new target of HIBD treatment.
【Key words】Small RNA; Neonatal hypoxic ischemic brain damage; Diagnosis; Targets for treatment
新生儿缺氧缺血性脑损伤（HIBD）是指各种围生期窒息引起的部分或完全缺氧、脑血流减少或暂停所致的新生儿脑损伤。HIBD是新生儿神经发育异常和死亡的主要原因之一，发病率为1/1000～2/1000活产足月儿，其中15%～20%在新生儿期死亡，存活者中的25%～30%留有永久性神经系统缺陷，如脑瘫、智力低下[1]。其发病机制及神经细胞损伤后修复机制尚不完全清楚，临床缺乏特异治疗方法。因此，探讨缺氧缺血性脑病的发病及修复机制，对临床治疗HIBD具有重要意义。目前临床上用于对新生儿HIBD的一些血清标志物 如神经元特异性烯醇化酶、血清肌酸激酶及其同工酶、S-100b蛋白等的检测敏感性和特异性均较差，因而寻找新的生物学指标具有重要的意义。Micro RNA（miRNA）是目前的研究热点，在许多神经系统疾病如帕金森病、脑肿瘤、脊髓小脑共济失调、tourette氏综合征、精神分裂症的发生、发展等过程中发挥重要作用[2]。本文就近年miRNA在HIBD中功能研究进展作一个详细阐述，其目的是为人们全面阐明miRNA在HIBD中的作用及以miRNA为潜在治疗靶点提供依据。
1.Micro RNA介绍
1.1 Micro RNA发现
Micro RNA(miRNA)是生物体内一类较短(约22个核苷酸)的非编码单链小分RNA，进化上高度保守，存在于动物、植物、病毒等多种生物中，并广泛参与生物体生长、发育、凋亡等生理或病理过程。1993年Lee等[3]在秀丽新小杆线虫内首次发现非编码蛋白质但能时序调控其胚胎后期发育基因表达的小分子RNA:lin-4。2000年Reinhart等[4]在对线虫的发育调控研究中发现第二种miRNA:Let-7，接着人们相继在细菌、果蝇、线虫、斑马鱼、动植物与人体内发现大量的miRNA 编码基因，研究证实miRNA主要通过调控其靶基因mRNA 在转录后水平调控蛋白表达，也有研究报道miRNA也能在转录水平调控基因表达[5]。miRNA可与一种或多种mRNA的特定序列互补，从而在转录后水平对基因表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制。至少20％～30％的人类编码蛋白的基因受到miRNA的调节[6]。
1.2 Micro RNA表达情况
miRNA在组织中表达情况与其功能密切相关，如[7]肝脏组织特异性表达miRNA-122，横纹肌组织特异性表达miRNA-1/206和miRNA-133，这些miRNA表达特异性与相应组织器官特殊的生理结构和功能密切相关。有研究报道[8]脑组织特有4种miRNA(miRNA-9、miRNA-124a、miRNA-124b、miRNA-135)和4种脑组织内富含的miRNA(miRNA-9、miRNA-125a、miRNA-125b、miRNA-128)，这些miRNA与脑组织的发育、神经元的分化和高级神经功能(如学习、记忆等)有关。动物研究发现[9]，成年小鼠中枢神经系统不同部位(脊髓、小脑、延髓、脑桥、中脑、丘脑、下丘脑、海马、杏仁体、新皮质、嗅球、垂体)miRNA表达情况亦不相同，miR-195、miR-497和miR-30b高表达于小脑，miR-34a、miR45l、miR-219、miR-338和miR-10a于延髓，miR-10b、miR-7和miR-7b高表达于下丘脑，miR-218、miR-22l、miR-222、miR-26a、miR-128a／b、miR-138和let-7c高表达于海马，miR-7、miR-7b、miR-375、miR-141和miR-200a高表达于垂体。人类中枢神经系统脑组织和脊髓miRNA表达分布情况尚无详细报道。
2.微小RNA与新生儿缺氧缺血性脑损伤关系
2.1 HIBD模型中miRNA表达情况
目前miRNA在HIBD领域中研究主要以动物实验为主。Jeyaseelan等[10]采用局灶性脑缺血模型(MCAO模型)发现再灌注24和48h后，let-7、miR-7、-27a、-29、-30c、-98、-101a、-137、-148b、-204、-218、-301、-338、-335、-369-5p、-376和- 424表达下调；miR-210、-215、-324-3p、-422b、-451、-497、-134等上调。结合DNA基因芯片，miR-124a、-290、-494调节VSNL1蛋白基因的表达；miR-223、-290、-292-5p、-327、-494调节水通道蛋白1、4、5、6和11基因的表达；miR-125a、-132、-290、-338、-664调节MMP-9基因的表达。也有国外学者[11]通过基因芯片分析发现，缺氧缺血条件下有变化的miR主要集中在：①细胞凋亡基因。如凋亡基因PAR-4(miR-26、-30、-181)，PCDC10(miR-103/107、miR-181)，BID（miR-23），BIM（miR-24），CASP3（miR-30），CASP7(miR-23)，APAF1(miR-27)等；②细胞周期基因。如cdc25A（miR-21、miR-103/107），cyclin D2(miR-26、miR-103/107)，cyclin E1(miR-26)，cyclin H(miR-23)，cdk6（miR-26、miR-103/107)；③VEGF基因。let-7b、miR-16、-20、-17-5p、-27、-106、-107、-193、-210、-320和-361等。我国学者 [12]亦通过基因芯片技术发现缺氧缺血性脑损伤新生大鼠大脑皮层脑组织中有27个已知miRNA表达上调2倍以上，60个表达下调2倍以上，实时定量PCR检测选择的9个miRNA（miR-126、-26a、-674-5p、-21、-25、-290和miR-124、-125b-5p、-9a等）结果与miRNA芯片结果具有相同趋势。该研究亦发现HIBD也存在前述的促进凋亡和影响细胞周期的miRNA表达变化，如miR-23、-24、-26、-30、-103、-107等显著上调，以及与神经干或前体细胞的分化有关let-7、miR-124、-128、-9等。以上研究均提示miRNA在HIBD模型中表达有明显差异，这些改变可能在HIBD的病理生理中起着重要作用，综合国内外研究发现，是否存在某一项或者几项miRNA表达情况能够支持HIBD诊断、判断病情及预后情况，还有待于临床病例的积累。
2.2 加重或减轻HIBD的miRNA
动物实验[13]研究显示新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)后早期脑组织中Nogo-66受体(NgR)表达即明显增高，但若应用特异性小干扰RNA(siRNA)干扰NgR的表达，可阻断髓磷脂相关抑制物与其受体的结合，从而减轻其抑制作用，促进HIBD神经功能的修复，且化学合成siRNA 转染细胞72h基因沉默效果最显著，抑制作用持续6天左右[14]。肖钢明[15]等通过对HIBD大鼠模型脑室注射化学合成特异性siRNA，应用水迷宫实验相比对照组，发现注射组大鼠逃生时间明显缩短，提示siRNA能够干扰新生大鼠脑组织NgR表达，并在一定程度上促进大鼠神经再生和神经功能恢复，这无疑为HIE的治疗提供了一个新的方向，但对于新生儿是否治疗有效，其安全性和有效性值得商榷。在缺氧缺血脑损伤病理过程中，Casp6可通过激活死亡受体6裂解细胞骨架蛋白介导细胞死亡[16]。研究发现敲除Casp6基因能减轻缺血引起的神经损害OGD组细胞凋亡指数明显高于常氧组（P<0.01），抑制BC088414表达后，PC12细胞的凋亡指数明显低于OGD组（P<0.05）。经OGD处理后，PC12细胞中BC088414、Adrb2和Casp6 mRNA 表达水平较常氧组均明显增加（P<0.05）；抑制BC088414表达，可导致PC12细胞中Adrb2和Casp6 mRNA 表达水平较常氧组降低，且可抑制OGD诱导的Adrb2和Casp6 mRNA表达上调（P<0.05）。结长链非编码RNA BC088414可能通过Adrb2和Casp6 促进凋亡，加重缺氧缺血引起的神经细胞损伤[17]。亦有研究人员[18]通过基因芯片技术筛查了缺氧缺血大鼠脑组织和假手术大鼠脑组织中Inc RNA和mRNA的表达，发现缺氧缺血后脑组织中lnc RNA和mRNA的表达谱发生了显著改变，Inc RNA BC088414和Adrb2、Casp6 mRNA的表达均增加。编码-非编码基因共表达网络分析结果表明，BC088414与Adrb2和Casp6的表达呈正相关这些结果进一步证实，在缺氧缺血神经细胞中Inc RNA BC088414表达上调，BC088414可促进Adrb2和Casp6 mRNA表达。上述动物实验中，并未有亚低温治疗和促红细胞生成素、营养神经制剂如鼠神经生长因子等干预治疗对照试验，可作为一个新的思路探讨这些治疗措施在保护脑神经方面的作用机制。
2.3 miRNA作为HIBD新型生物标记物
大量的研究已鉴定出众多与HIBD发生发展相关的分子标志物，包括S100钙结合蛋白B(S100 calcium-binding protein B，S100B)、神经原特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)、白介素6(interleukin-6，IL-6)、血清脑型肌酸磷酸激酶(serum creatinine phosphokinase BB，CPK-BB)、胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)、人磷酸化神经丝H(pNF-H)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF或VEGFA)等[19-20]，但检测敏感性和特异性均较差，因而寻找新的生物学指标具有重要的意义。血浆miRNA由于其稳定性、疾病特异性和样本易获得性，其作为生物标志物的潜力逐渐被人们发现[21-22]。血浆miRNA在肿瘤诊断、疗效的判断、监测复发、肿瘤细胞的迁移生物学行为上的作用已得到证实[23]。Chen[24]等用单分子微阵列技术(Solexa技术)对健康中国人的血清所有miRNA进行测序，分别在男性和女性中发现了超过100种和91种血清miRNA。肺癌、结直肠癌和糖尿病患者均存在疾病特异性血清miRNA表达谱。在肺癌患者的血清中有63种miRNA是健康人血清中所不存在的，而有28种健康人血清中的miRNA却没有被检出。相对于传统影像学检测，体液检测miRNA具有灵敏度高、样本收集程序简便、一个样本可同时检测多项参数等优点，因此miRNA可用于缺血性脑损伤的诊断和预后的评判。如Gan[25]等研究发现脑缺血病人的血循环miR-145表达量增加，可作为临床上诊断缺血性脑卒中的一个新生物学标记。但脑脊液miRNA表达谱研究，国内外相关文献不多，HIBD患者是否可以通过基因芯片技术和RT-PCR技术查外周血和脑脊液找到生物标记物将是未来一个新的方向。
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2.4 miRNA药物治疗HIBD
miRNA在疾病发生发展中起重要作用，因此可以通过改变miRNA的表达来调控基因表达、蛋白转录后的翻译从而达到控制疾病的进展、判断药物疗效及评估预后的目的。血液中的miRNA可以被特定的细胞识别，并在受体细胞中发挥作用，使体外给药并针对miRNA的特异性治疗成为可能。对于在疾病过程中表达增多的miRNA，静脉给予相应抗体可以达到治疗的目的。Krutzfeldt[26]等在小鼠体内静脉注射抗miR-16、抗miR-122、抗miR-192、抗miR-194抗体后引起小鼠体内相miRNA减少。而在疾病过程中表达减少的miRNA则通过载体将其传递至细胞内，研究发现适合做载体的有编码miRNA病毒和脂质体，病毒作为载体具有高表达的优势，但其安全性还有待深入研究；脂质体则与病毒相反，安全性较高，但表达不高。miRNA药物开发已取得重大进展，部分miRNA激动剂或拮抗剂在动物实验中已证实其安全性及有效性。针对于肝炎的miR-122[27]、心血管疾病的miR-21[28]等药物已进入临床或临床前期试验。相对于传统亚低温治疗，这无疑为未来HIBD靶点治疗提供了新的方向。
2.5 其他
研究发现重度抑郁症患者出现失眠等节律紊乱现象与miRNA-182前体形成异常，从影响成熟mi RNA-182的表达有关[29]。而HIBD患儿存在远期睡眠节律紊乱情况，最新研究发现[30]7日龄SD大鼠mi RNA-182在松果体组织中高浓度表达，HIBD模型组后24h、48h mi RNA-182的表达水平高于对应时间点的假手术组（P<0.05）；与对应时间点的假手术组相比，且HIBD后0h Clock mRNA表达水平升高，48h时降低，72h后明显升高，mi RNA-182可能参与了HIBD后昼夜节律紊乱的病理生理过程。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是近年来确定的一种促进血管内皮细胞增殖和血管生成的细胞因子，它通过与VEGF受体的结合从而诱导多种细胞反应，包括促进细胞的迁移和有丝分裂、促进血管新生、促进细胞增殖同时抑制细胞凋亡等[31]。研究表明，缺氧可以诱导VEGF的表达[32]。研究发现[33]HIBD患儿较正常新生儿研究发现外周血单个核细胞，miR-125b表达显著降低，血浆中VEGF水平显著升高，且二者却呈显著负相关。进一步表明VEGF表达受miR-125b的调控，而且这种调控作用只在缺氧缺血条件下存在。
3.展望
每个miRNA有多个靶mRNA，每个mRNA受到不同miRNA的调控，外源性miRNA作用于疾病复杂的病理生理网，较传统的针对单一基因产物的治疗具有一定的优势miRNAs可以通过影响或调控细胞增殖、分化过程当中信使RNA和关键蛋白来参与调控肺部相关疾病的多个环节。目前，miRNA已经成为生物医学界研究的焦点。但是，目前已经鉴定的miRNAs数目非常有限，还有许多关键的miRNA有待于发现。在未来，miRNAs模拟物或拮抗剂可能会被作为新一代的诊断和治疗工具。因此，进一步阐明miRNA及其靶基因的作用机制，鉴定特定病理条件下miRNA的特异性表达谱，将有利于新生儿缺氧缺血性脑损伤的诊断和治疗。
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基金项目：浙江省科技厅社会发展项目（2013C33218）
论文作者:张世杰,何梦藻,滕懿群（通讯作者）
论文发表刊物:《医药前沿》2016年9月第25期
论文发表时间:2016/9/6
标签：缺血性论文; 特异性论文; 基因论文; 新生儿论文; 细胞论文; 组织论文; 血清论文; 《医药前沿》2016年9月第25期论文;