高秀华[1]2003年在《过量表达SOD2对拟南芥耐盐性的影响》文中研究表明盐胁迫下，植物细胞的离子均衡受到破坏，尤其是胞质中过多的Na~+，对植物细胞的代谢产生毒害。植物细胞为适应胁迫环境，一方面积累可溶性有机物质；另一方面，则通过Na~+外排或者区隔化、并调整K~+／Na~+比率的机制来消除Na~+的毒害。目前，拟南芥细胞内控制Na~+外排的基因SOS1及离子区隔化基因AtNHX1均已克隆，SOS1及AtNHX1在拟南芥中的过量表达显着提高了转基因植株的耐盐性，开创了降低Na~+毒害的基因操作新途径。SOD2在裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中编码位于质膜上的Na~+／H~+逆向转运蛋白，控制Na~+外排，对于保持裂殖酵母细胞的离子均衡非常重要。虽然SOD2基因已经克隆，但是SOD2在高等植物中异源表达及对其影响还未见报道，因此SOD2基因在拟南芥中过量表达，对研究细胞的离子均衡及运用基因工程手段有效地提高植物的抗逆性具有重要意义。 SOD2基因cDNA全长1404bp，编码一个约51kD的蛋白质。本实验将SOD2基因构建到植物表达载体pROKⅡ中，导入农杆菌后，进行植物遗传转化，实现其在拟南芥中过量表达，在含30mg／L的卡那霉素的培养基上筛选获得纯合转基因株系，自交一代获得足够的纯和转基因种子后，对其进行了分子生物学的验证及生理指标的检验。转基因植株的分子生物学检测如下： 1．PCR结果扩增出1.4kb的特异性条带，表明SOD2已整合进拟南芥中，PCR-Southern进一步证实了PCR结果的正确性。 2．Southern结果表明，野生型植株(对照)没有明显的杂交信号，转基因株系有强阳性信号，转基因植株中插入外源基因的拷贝数不同，既有单拷贝的，又有两个拷贝及多拷贝的，拷贝数从1-5不等。 3．Northern分析表明转基因植株均有杂交信号，野生型植株无明显信号，进一步说明SOD2基因整合到拟南芥的基因组后已正常转录表达，由信号的强弱来看，表达量有明显的不同，可能与整合的外源基因的拷贝数相关。 耐盐生理指标分析表明： 1．在含不同浓度的NaCl(0-200mmol／L)培养基上，SOD2基因的过量表达提高了转基因拟南芥的种子萌发率及幼苗的耐盐性。 2．对LiCl的耐性分析表明，转基因植株比对照的耐受性增强。 过量表达SODZ对拟南芥耐盐性的影响 3．在用不同浓度的NaCI（0－200mm。l／L）处理后，测其干、鲜重，结果表明转基因植株鲜重明显高于对照，干重差异不显着。 4．Na＼K”含量测定表明转基因植株的根中Na十的积累明显低于对照，且又含量较高，K“Ma十比值均高于对照；地上部分Na十的含量明显低于野生型植株，但K“含量差异不显着，K”／Na十比值均高于对照。 5．在对转基因植株及野生型植株用 100nunol／LNaCI处理六天后，Na”、K”的 x一射线微区分析，转基因植株根、叶中质外体 Na＋、K十含量变化不大，但共质体中 Na十含量明显降低，广含量高于对照。 6．对转基因植株及野生型植株光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、细胞间隙CO。的浓度（Ci）分析表明，盐胁迫下＊均下降，但在 200。oMaCI处理后转基因植株的PS显着高于对照：盐处理后GS变化不显着；Ci略有上升，但差异不显着。 7．在盐胁迫下，对脯氨酸的测定表明，野生型植株及转基因植株脯氨酸的含量都增加，但转基因植株略低于对照，两者差异不显着。 以上结果表明，盐胁迫下转基因植株可能利用Na十外排的策略，降低Na”含量，维持较高的K十含量，并保持较高的K”Ma十比，使植物免受过多的伤害，过量表达SODZ提高了转基因拟南芥的耐盐性。
周玲玲, 祝建波, 王爱英[2]2011年在《过量表达大叶补血草LgSOS1基因对拟南芥耐盐性的影响》文中研究表明将从盐生植物大叶补血草(Limonium.gmelinii(Willd.)Kuntze)中分离的质膜型Na+/H+逆向转运蛋白基因LgSOS1构建到pCAMBIA1301植物表达载体的CaMV35S启动子下游上,转化拟南芥,获得抗潮霉素的转基因植株。对该植株的PCR和RT-PCR检测表明,LgSOS1已整合到拟南芥基因组中并过量表达。对转化植株的耐盐性实验结果表明:盐胁迫下转基因植株长势明显好于对照;盐分测定表明,转基因植株地上部分的Na+积累显着低于野生型的,K+含量则显着高于野生型的。这表明LgSOS1过量表达提高了拟南芥植株的耐盐性。
窦伟红[3]2014年在《泌盐植物中华补血草SOS1基因的克隆及其功能研究》文中进行了进一步梳理盐胁迫是严重影响植物生长发育的非生物因素之一。土壤盐渍化会引起大多数植物体内Na+过量积累，进而影响植物的生长。盐生植物能在盐渍环境下正常生长，因此，克隆盐生植物的耐盐性关键基因并研究其功能，有助于深入理解植物的耐盐机制，利用相关的基因资源，培育转基因耐盐植物，有效地改善和利用盐渍化土地。本实验以泌盐盐生植物中华补血草(Limonium sinense Kuntze)为材料，首先研究了补血草幼苗在不同盐浓度下的胁迫响应、SOS1基因的表达变化及中华补血草叶片中抗氧化酶的活性变化；其次，克隆了中华补血草SOS1基因（LsSOS1），构建了过量表达载体、融合基因表达载体及沉默干扰表达载体，在拟南芥中将LsSOS1基因进行了过量表达和LsSOS1-GFP融合基因的表达并在中华补血草中做了LsSOS1RNAi遗传转化。对获得的纯合转基因拟南芥及LsSOS1沉默转基因中华补血草进行分子鉴定、耐盐性分析、LsSOS1表达产物定位观察及LsSOS1基因的表达变化研究。进一步了解LsSOS1基因在盐生植物中华补血草耐盐过程中的重要作用。实验主要结果如下：(1)中华补血草幼苗在不同盐浓度下的胁迫响应及LsSOS1基因的表达变化弯根实验中，低盐浓度下补血草根的生长情况好于对照，随着盐浓度的升高，根的生长逐渐受到抑制。NaCl浓度高于200mmol/L时，中华补血草受到盐胁迫，LsSOS1基因的表达量升高，根部高于叶片。(2)盐胁迫下中华补血草叶片中抗氧化酶的活性变化中华补血草在低盐处理下，酶促活性氧自由基清除系统的各种酶活性与对照相比没有明显变化。但是，随着NaCl浓度的增加，中华补血草受到盐胁迫，活性氧清除酶类（SOD、POD、APX、CAT）的酶活性上升。说明在一定的浓度范围内，补血草可以通过调节自身的抗氧化酶系统及其独特的泌盐、耐盐机制来抵御盐胁迫带来的损伤，维持正常的生长。(3)中华补血草LsSOS1基因的克隆及序列分析根据其他物种中保守的SOS1基因序列，设计简并引物，利用RACE的方法克隆得到LsSOS1基因序列，开放阅读框包含3456个核苷酸，推导编码的蛋白质有1152个氨基酸残基组成，与大叶补血草SOS1基因（Limonium gmelinii SOS1）的同源性最高，达到了97%，编码一种Na+/H+逆向转运蛋白。(4) LsSOS1基因异源过量表达研究筛选得到了10个过表达LsSOS1的转基因拟南芥株系，选用叁个纯合转基因株系进行分子研究和生理生化分析。通过Real-time PCR分析LsSOS1基因在拟南芥中表达量的差异。在不同浓度NaCl胁迫下，转基因植株的萌发和生长情况要优于野生型，转基因植株比野生型植株的耐盐性有所提高，转基因植株的鲜重、干重及K+/Na+比率高于野生型，但是转基因植株间的差异并不明显。(5) LsSOS1表达产物亚细胞定位分析筛选得到过量表达P35S::LsSOS1-GFP的转基因拟南芥。在共聚焦显微镜下通过观察GFP的绿色荧光确定LsSOS1表达产物的定位。初步确定了LsSOS1在细胞膜或细胞壁上表达，而不是在液泡膜或细胞质中。为了进一步确认是在细胞质膜上，可以用甘露醇将细胞皱缩质壁分离，再进行观察。(6) LsSOS1RNAi沉默转基因中华补血草耐逆性分析通过优化遗传转化体系，外植体的转化率达到了20%，筛选获得了30株LsSOS1RNAi沉默转基因株系。对其中的3个株系进行LsSOS1基因的表达研究和生理生化指标的测定。通过Real-time PCR分析发现沉默转基因中华补血草SOS1基因的表达量低于野生型。在NaCl处理下，转基因植株的长势不如野生型，耐盐性降低，转基因植株的鲜重、干重及K+/Na+比率低于野生型。
程玉祥[4]2008年在《过量表达星星草PtSOS_1提高拟南芥的耐盐性》文中研究说明将星星草中分离的质膜型Na~+/H~+逆向转运蛋白基因PtSOS_1(GenBank登录号EF440291)构建到pGWB_2植物表达载体上,转化拟南芥,获得抗卡那霉素的抗性植株。PCR和Northern检测表明,PtSOS_1已整合到拟南芥基因组中并过量表达。耐盐性实验表明,PtSOS_1过量表达提高了拟南芥植株的耐盐性。盐分测定表明,盐胁迫下PtSOS_1转基因植株中Na~+积累低于野生型的,K~+含量则高于野生型的,转基因植株中K~+/Na~+比值高于野生型。
马文英[5]2006年在《SOS1 RNAi对盐芥耐盐性的影响》文中进行了进一步梳理盐胁迫下,植物细胞的离子均衡受到破坏,胞质中积累过多的Na~+,对植物细胞的代谢产生毒害。植物细胞为适应胁迫环境,一方面积累可溶性有机物质;另一方面,则通过Na~+外排或者区隔化、并调整K~+/Na~+比率的机制来消除Na~+的毒害。拟南芥细胞内控制Na~+外排的基因SOS1及离子区隔化基因AtNHX1均已克隆,SOS1及AtNHX1在拟南芥中的过量表达显着提高了转基因植株的耐盐性。在拟南芥中,SOS1及SOS2、SOS3所组成的SOS信号通路的调控机制业已得到阐明,研究表明SOS信号通路在调控离子均衡和植物耐盐性中发挥重要作用。作为拟南芥近缘的盐生植物盐芥,短时间内能耐受高达500mMNaCl的冲击,在盐适应前后既不产生盐腺也没有复杂的形态上的变化,表明其耐盐性很大程度上源于基本的生理和生化机制。因此在盐芥中沉默SOS1基因进行研究,对揭示盐生植物耐盐性的基础具有重要意义。本实验将盐芥编码Na~+/H~+逆向转运蛋白的SOS1基因721bp的片断反向重复构建到基因沉默载体pGSA1252中,导入农杆菌后,进行植物遗传转化,实现盐芥中SOS1的转录水平的下降。在用浓度为50ppm的Glufosinate ammonium筛选后,获得转基因株系,自交一代获得足够的转基因种子后,对其进行了分子生物学的验证及生理指标的检验。转基因植株的分子生物学检测如下:1.各转基因株系中,均能通过PCR扩增出Bar基因的500bp的特异性条带,表明T—DNA已经携带Bar基因及SOS1基因片断整合进盐芥基因组中。2. Real time PCR结果显示,转基因株系在NaCl处理条件下SOS1转录水平会发生不同程度的下降。进一步说明SOS1基因的反向重复片段整合到拟南芥的基因组后已正常转录,并引起了SOS1RNA的降解。耐盐生理指标分析表明:1.在含不同浓度NaCl(0-300mmol/L)的培养基上,SOS1基因的沉默降低了转基因盐芥的耐盐性。2.通过比较各个转基因株系之间耐盐性的差异及SOS1转录的水平,发现SOS1转录水平降低越多,盐芥的耐盐性越差。
参考文献：
[1]. 过量表达SOD2对拟南芥耐盐性的影响[D]. 高秀华. 山东师范大学. 2003
[2]. 过量表达大叶补血草LgSOS1基因对拟南芥耐盐性的影响[J]. 周玲玲, 祝建波, 王爱英. 石河子大学学报(自然科学版). 2011
[3]. 泌盐植物中华补血草SOS1基因的克隆及其功能研究[D]. 窦伟红. 烟台大学. 2014
[4]. 过量表达星星草PtSOS_1提高拟南芥的耐盐性[J]. 程玉祥. 植物生理学通讯. 2008
[5]. SOS1 RNAi对盐芥耐盐性的影响[D]. 马文英. 山东师范大学. 2006