（岳阳市二人民医院神经外科 湖南岳阳 414000）
摘要：目的 分析CD164在胶质瘤组织及细胞系中的相对表达水平，以及CD164对胶质瘤细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）中的作用及其作用机制。方法 采用western blot检测CD164在45例胶质瘤组织和癌旁正常组织中的表达水平；利用western blot检测CD164在胶质瘤细胞及人正常胶质细胞中的表达；构建沉默CD164的慢病毒载体，并将其感染至胶质瘤细胞株U251，Transwell实验检测细胞侵袭；western blot法检测瞬转CD164 shRNA后对CD164蛋白表达的影响。结果 CD164在胶质瘤组织的表达较正常脑组织显著上调，差异有统计学（P < 0.001）；与NHA细胞相比较，CD164在人胶质瘤细胞系SF295、SHG-44、U87和U251细胞中的表达量明显增加，具有明显的统计学差异性（P < 0.001）；U251细胞感染CD164 shRNA后可抑制U251细胞侵袭。结论 CD164在胶质瘤组织和细胞系中的表达均显著上调，CD164与胶质瘤细胞EMT明显相关。
关键词：胶质瘤；CD164；EMT
The effect of CD164 in the regulation of EMT in glioma
Zhifeng-Li，Yong Chen，Zhongchi-Tong，Renhui-Zhou，Feixiang-Zhang，Jianxian-Li
Neurosurgery，The Second People Hospital of Yueyang，Yueyang，Hunan，China，414000
[ABSTRACT] AIM：To elucidate the relative level of CD164 in glioma tissues and cell line as well as the effect of CD164 on the EMT of glioma cells in vitro.
METHODS：Quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction （qRT-PCR）and western blot were used to assess the relative level of CD164 in glioma cell tissues and in vitro cell lines，respectively. Human CD164 sequence was used for the design of shRNA targeting CD164，which was then introduced to lentivirus，followed by transfection into U251 cells. The cell invasion was evaluated by matrigel counting assay.
RESULTS：The expression of CD164 is significantly up-regulated in glioma tissue samples and cell lines. The cell invasion was inhibited significantly after transfection of CD164 shRNA in U251 cells.
CONCLUSIONS：The expression of CD164 is clearly associated with the invasion of glioma cells，whilst CD164 may be used as a potential therapeutic target for the treatment of rectal cancer in the future.
[KEY WORDS] glioma；CD164；EMT
恶性肿瘤的主要特征是浸润和转移，肿瘤转移是一个复杂、多因素的级联反应过程，而肿瘤细胞上皮-间质转化的动态转换是肿瘤细胞转移过程中非常重要的步骤[1，2]。CD164作为一种定位于6号染色体的唾液酸黏蛋白[3]。研究表明CD164在机体造血和调节正常细胞生长分化过程中发挥一定调控作用；CD164已经被证实在结肠癌、宫颈癌和成神经管细胞瘤等实体肿瘤发生和发展过程中发挥着重要作用[4-6]；最新研究结果表明CD164可作为急性成淋巴细胞性白血病中分子生物学标记[7]。但CD164在胶质瘤中的表达和作用尚不明确，仍待进一步研究。为此，本次研究拟分析CD164在胶质瘤组织和体外细胞中的表达，同时进一步研究其对体外胶质瘤细胞EMT的影响，探讨CD164对胶质瘤发生发展的生物学意义。
1 材料与方法
1.1 组织标本
收集岳阳市二人民医院神经外科在2012年6月至2014年6月期间收治的45例脑胶质瘤患者的临床标本，男性患者共有22例，女性患者共有23例，年龄在48.9岁至71.2岁之间，平均年龄为58.6 ± 6.4岁，另外设立5例脑损伤患者正常脑组织标本作为对照。
1.2 试剂
Opti-MEM培养基、DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；Trizol试剂和Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒、qRT-PCR 试剂盒和细胞蛋白提取试剂盒购自日本TaKaRa株式会社；shRNA NC和CD164 shRNA购自中国GenePharma；ECMatrix胶和Transwell小室购自美国BD公司；CD164和β-actin抗体购自美国Epitomics公司。
1.3 细胞培养
人胚肾细胞株HEK-293T、胶质瘤细胞株SF295、SHG-44、U251和U251及人正常胶质细胞NHA细胞均由上海细胞生物研究所提供。细胞培养于DMEM培养基中，培养基中补充10%胎牛血清、青霉素（100 U/μl）和链霉素（100 μg/ml）。细胞在37 ℃且CO2 含量约为5％的细胞培养箱内进行培养。当细胞生长至占培养瓶底面积90%以上时用胰蛋白酶消化并用于实验。
1.4 构建慢病毒载体感染U251细胞及筛选
依照文献提供的CD164 shRNA有效靶序列设计并构建3条干扰序列及阴性对照序列，并筛选出一条最有效的干扰序列[8]，根据Lipofectamine2000制造商的指示将最优干扰序列的慢病毒表达载体经Lipofectamine2000感染至HEK-293T细胞中，收集病毒上清液离心并测定病毒滴度后感染U251 细胞，将病毒液感染细胞12 h后更换含10%胎牛血清的培养基，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白荧光，流式细胞仪检测感染效率。
1.5 将CD164 shRNA及shRNA NC感染至U251细胞
将对数生长期的U251细胞接种于24孔板中，每孔2×105个细胞，将5 μl浓度为20 μmol/L的CD164 shRNA与5 μl感染试剂lipofeetamine 2000混匀后加入细胞中，CD164 shRNA的感染终浓度为100 nmol/L，将培养板置于细胞培养箱中孵育48 h后进行相关功能性和western blot等检测。shRNA NC的感染方法同CD164 shRNA的感染。
1.6 细胞体外侵袭实验
收集对数生长期U251 细胞，加入无血清培养基中，调整细胞浓度为1×104/ml，将300 μl细胞悬液和300 μl含20％胎牛血清的培养基分别加入Transwell上室和下室，放置细胞培养箱中培养24 h后加入结晶紫染色液染色20 min，在倒置显微镜下观察穿过小室的蓝染细胞，在高倍镜下随机计数10个视野，计算平均值，每组重复３次。
1.7 Western blot检测细胞中蛋白的表达
U251 细胞在冰冷的PBS液中洗涤三次后重悬于细胞裂解液（100 μl/孔）中。当细胞裂片至于冰上反应30 min，再在4°C温度下12000×g离心20分钟，收集上清后使用BCA蛋白检测试剂盒对蛋白质浓度进行定量分析。蛋白质样品（30μg）使用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳进行后转移到0.45 μm的硝酸纤维素膜上，并使用5%脱脂奶粉于４℃下孵育过夜，该膜在4°C与一抗在室温下反应30分钟后，在室温下与二抗再次孵育1 h。以内参β-actin蛋白条带灰度值的比值来校正母的蛋白的光密度值。
1.8 数据的统计处理
计量数据均以均数±标准差来表现，采用SPSS 17.0统计软件包进行统计学分析，使用t检验和方差分析对所得样本数据进行统计学分析，统计学意义校正值设定为P < 0.05。
2 结果
2.1 CD164在胶质瘤组织中的表达
根据2007年WHO胶质瘤分类标准将纳入本组队列的45例病例进行分类，这45例胶质瘤患者临床病理学信息详见表1。qRP-PCR检测结果表明，与正常脑组织正常组织相比较，CD164在胶质瘤组织中的表达显著上调（3.15 ± 0.63 vs. 0.53 ± 0.12），有统计学显著性（P < 0.001）。
2.2 CD164对体外胶质瘤细胞侵袭的影响
如图A所示，western blot实验检测结果表明，CD164在人正常胶质细胞NHA中的表达量较低，而在人胶质瘤细胞株SF295、SHG-44、U87和U251中表达明显升高，差异有统计学意义（F = 56.84，P < 0.001）；同时与SF295、SHG-44和U87细胞相比较，U251细胞中CD164表达量明显升高（P < 0.001），后续试验选择U251细胞作为实验对象。
分别将CD164 shRNA或shRNA NC感染进入U251细胞72 h后，利用western blot检测U251细胞中的感染情况，结果表明细胞感染CD164 shRNA可显著下调CD164在U251细胞中的表达，差异有统计学意义（P < 0.001），而感染shRNA NC对CD164的相对表达量无明显影响（图B）。如图C所示，细胞侵袭实验表明，U251细胞经感染CD164 shRNA后可显著抑制细胞侵袭行为，对照组、shRNA NC组和CD164 shRNA NC组侵袭出ECMatrix胶的细胞数分别为63.4±9.8、66.8±12.1和（7.9±2.3）个，shRNA NC组与CD164 shRNA组相比较，差异有统计学显著性（P < 0.001）。
Western blot检测CD164在NHA、SF295、SHG-44、U87和U251细胞系中的表达（A）；感染CD164 shRNA或shRNA NC至U251细胞后对CD164、表达的影响（B）；倒置显微镜下观察分别感染CD164 shRNA或shRNA NC后对U251细胞侵袭行为的影响（×200）。
3 讨 论
近期研究发现CD164在多种实体瘤组织中表达明显上调，同时CD164的表达与肿瘤分化程度明显相关[4-6]，但其作用机制尚不明确。本研究中，我们检测了45例胶质瘤组织和癌旁组织中CD164的表达情况，结果显示，CD164在胶质瘤组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织，提示CD164在胶质瘤发生的早期阶段可能充当着抑癌基因的作用，同时CD164在体外胶质瘤细胞株中的表达也高于正常胶质细胞中的表达，这种CD164在良恶性组织及细胞中的表达差异表明CD164与胶质瘤细胞的发生和转移可能存在一定的关联。
在特定生理和病理情况下，上皮细胞暂时丧失极性并表现出具有移行能力的间质细胞的现象称为EMT，既往研究表明，EMT与肿瘤的局部侵袭和远处转移关系密切，已成为当前肿瘤研究的热点之一[1-2]。但目前尚未有CD164与胶质瘤细胞EMT的相关报道。为进一步研究CD164在胶质瘤恶性生物学行为中的作用，本研究通过RNA干扰技术沉默CD164在体外胶质瘤细胞中的表达，发现下调CD164对体外胶质瘤细胞侵袭性行为有明显抑制作用，从而表明CD164与胶质瘤转移密切相关。
综上所述，本研究表明CD164与胶质瘤转移明显相关，但CD164是否对体内胶质瘤同样具有抑制转移作用尚未可知，同时虽然证实CD164可抑制体外胶质瘤细胞EMT，但CD164与EMT之间是直接调控还是间接调控仍需进一步实验明确。但本次研究为临床胶质瘤基因治疗提供一个新的作用靶点，在揭示胶质瘤的发病机制及治疗上具有一定积极意义。
参考文献
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基金项目：湖南省卫生厅科研基金资助项目（C2014-51）
论文作者:陈勇,李志峰,童仲驰,周仁辉,张飞翔,黎建先
论文发表刊物:《航空军医》2017年第8期
论文发表时间:2017/6/23
标签：细胞论文; 胶质瘤论文; 组织论文; 统计学论文; 培养基论文; 体外论文; 细胞株论文; 《航空军医》2017年第8期论文;