血液中七氟烷及其代谢物的检验
邹 波，魏春明，常 靖，任昕昕，王爱华，宋 歌，张云峰，于忠山
(公安部物证鉴定中心，北京市现场物证检验工程技术研究中心，北京100038)
摘 要: 目的 为法医毒物检验建立血液中七氟烷及其代谢物六氟异丙醇(HFIP)的气相色谱-质谱联用(GC-MS)检测方法。方法 取1.00mL检材血置于10mL顶空进样瓶中，加入1.00mL去离子水混匀，密封后60°C加热20min，抽取顶部气体进行HS-GC-MS(EI)检测。分析采用HP-PLOT/Q (30m × 0.32mm × 20μm)色谱柱，质谱采集数据模式为SCAN。 结果 七氟烷定性特征离子为m /z 131、79、69，检测限(LOD)为50.0ng/mL，且在0.1～100.0μg/mL浓度范围内线性良好(R2 = 0.996)，相对标准偏差(RSD) (n = 6) ＜ 10%；HFIP定性特征离子为m /z 99、79、69，LOD为0.5μg/mL，且在1.0～100.0μg/mL浓度范围内线性良好(R2 = 0.998)，RSD (n = 6) ＜10%。结论 使用本方法可以同时准确测定血液中七氟烷及其代谢物HFIP的含量。
关键词: 毒物检验；七氟烷；血液；顶空气相色谱-质谱联用法
七氟烷又称七氟醚，即1,1,1,3,3,3-六氟-2（氟甲氧基）丙烷，是一种医用吸入性麻醉剂。它具有麻醉诱导快、麻醉深度可调节、呼吸道刺激小等优点，目前已广泛应用于外科手术和儿科门诊手术[1]。由于毒性较低且生产使用受到监管，七氟烷中毒致死案例不常见，但目前国外已有相关临床事故[2-3]和滥用致死[4]报道。鉴于七氟烷的临床和滥用风险，开发血液中七氟烷及其代谢物的分析检测方法有利于法医毒物检验工作。
七氟烷的血液/气体分配系数为0.63～0.69 (37°C)，沸点58 °C，常温下为液体，临床使用需要专门的蒸发器和面罩。吸入的七氟烷95%～98%通过肺呼出，其余在肝脏中经细胞色素P450酶转化为六氟异丙醇(HFIP)，然后经Ⅱ相代谢生成HFIP葡萄糖醛酸，或进一步代谢为CO2和无机氟离子，经肾脏排出体外。
七氟烷的临床使用对肝功能不全者、有挥发性麻醉剂诱发肝炎病史者有一定风险。个别案例报道，患者经七氟烷麻醉实施手术后，数天内暴发肝坏死导致死亡[3]，一些研究提出了七氟烷致肝损伤的可能机制[2,5]。七氟烷滥用致死相关报道中，死者均为医院工作人员[4,6-7]，经检测死者血液中七氟烷含量为8～26.2 μg/mL，肺、脑、肝等脏器中可高达 29～269 μg/g。毒理学研究表明七氟烷对中枢神经系统、心血管和呼吸均有抑制作用[8]，其中呼吸抑制还包括对缺氧反应的抑制，而滥用者一般不使用呼吸维持装置，容易造成缺氧死亡。
人们通过生物等效性试验,来验证同等剂量的同中方药物的两种生物制剂的利用度是否完全一致,从而确保两种制剂使用时具有相同的疗效和安全性,以便能够替用。通常情况下,人们在进行相关研究是,会采用双处理、两周期随机交叉的实验设计,采用色谱方法来测定药时曲线下面积(AUC)、峰浓度(Cmax)、达峰时间(Tmax)等实验参数,以多因素方差分析、t检验、90%可信区间的计算,评价药物的生物等效性[5]。
七氟烷的法医毒物检测目前一般使用顶空气相色谱法，将定量检材（血液、生物组织、尿液等）封装于样品瓶中并置于恒温下，待平衡后抽取上部空气进行检测。检测器可使用FID[9]或MS[10-11]等。在已有报道中，七氟烷血药浓度的临床检测和法医毒物检测目标物均为原药，对其代谢产物HFIP的检测尚未引起关注。本研究基于实际案件的法医毒物检测需求，建立了适用于血液中七氟烷及其代谢物HFIP同步检测的顶空气相色谱-质谱联用(HS-GC-MS[EI])方法，为案件调查和死因判定提供技术支撑，增强检验结果的可信度和说服力，并对推断死亡时间和药物摄入量具有参考价值。
1 材料与方法
1.1 仪器、试剂与材料
七氟烷标准品(USP, 99.9%)；六氟异丙醇(HFIP)标准品(Toronto Research Chemicals, 98%)；乙二醇（北京试剂集团，分析纯）；去离子水；人全血（首都医科大学附属复兴医院提供）。
精确称量HFIP标准品100.0 mg溶于少量去离子水中，全部转移至10 mL容量瓶并用去离子水定容至刻度，配制成10.0 mg/mL HFIP标准物质储备液。其它浓度的HFIP标准工作液均从上述标准储备液用去离子水稀释制备。
从图1可以看出本方法分离效果较好，峰形尖锐对称。七氟烷和HFIP的气相色谱保留时间(Rt)分别为8.4 min和11.2 min，HFIP保留时间更长是因为醇羟基的存在使其分子具有较强极性。图1还表明在样品配制和检测过程中七氟烷不会水解为HFIP，确保了采用本方法分别或同时检测两种物质时，结果真实可信。
样品配制均在通风橱中操作。精确称量七氟烷标准品100.0 mg溶于少量乙二醇中，全部转移至10 mL容量瓶并用乙二醇定容至刻度，配制成10.0 mg/mL七氟烷标准物质储备液。其它浓度的七氟烷标准工作液均从上述标准储备液用乙二醇稀释制备。
1.2 气相色谱/质谱条件
1.2.1 色谱条件
柱温 :初始温度 60 °C，保持 1 min，20 °C/min升至 220 °C，保持 1 min，30 °C/min 升至 260 °C，保持1 min；载气:He；流速:2.3 mL/min；吹扫流量:3 mL/min；进样量:0.20 mL；分流比3∶1。
1.2.2 质谱条件
离子源温度:200 °C；接口温度:250 °C；溶剂延迟3 min；质谱采集时间:3.5～12.33 min；
周恺轻轻走进房间，只见孟丽坐在他平日常坐的老板桌前，正对着面前的一杯水说话，他侧耳细听，从孟丽说的话里，他了解到一个让他无比震惊和感动的真相。
采集模式:SCAN；采集范围:m /z 19～250。
1.3 标准溶液的配制
互联网技术的高速发展，传统的储蓄方式受到了来自不同的新投资方式的冲击，互联网巨头们已不满足于仅仅改变人们的消费观念，于是，作为现代网络发展下出现的新的储蓄方式”余额宝”就诞生了。余额宝具有很强的代表性和时代性。现代网络的发展和各种投资方式的出现创造了余额宝的出现，换言之，在这样的一个大经济环境下余额宝的出现是顺应了时代的要求。
10 mL顶空进样瓶，带铝盖和聚四氟乙烯衬垫。
共享经济本质上必须建立在网络协同效应的基础之上。目前看来，像滴滴，特别是到共享单车这些更小的层面，由于场景足够简单，其实它的网络协同效应并不明显，更多的是通过互联网和人工智能技术手段，大幅提升运营效率。
1.4 血液样品制备
取空白人全血1.00 mL置于10 mL顶空进样瓶中，加入1.00 mL去离子水混匀，用聚四氟乙烯橡胶垫及曲形铝盖密封，置于烘箱中60 °C加热20 min，振摇10 s，用1 mL注射进样器抽取0.20 mL顶部气体进样。
某地区地籍调查的数据类型繁多，关系比较复杂，依据相关技术规范，采用SuperMap空间数据库来进行管理和维护，图2为基于SuperMap的城镇地籍数据建库系统方案设计图。
一是明确监管主体。有些简单的规定和规范性文件在效力层次方面不高，不能规范商业预付卡市场，因此立法要明确规定预付卡的部门职责与监管主体，以免出现监管无序和缺位的情况[3]。如明确中国人民银行和工商部门分别为主要监管主体与辅助监管主体，前者负责商业预付卡的违法处罚、审查发行等，后者负责企业信用档案的建立、预付卡合同范本的出台等。
2 结果与讨论
配制标准溶液步骤中，由于七氟烷水溶性较差，故应选用有机溶剂来溶解和稀释。首先测试了甲醇、乙腈、乙酸乙酯三种常用溶剂，发现其均能良好溶解七氟烷。但由于溶剂沸点低，导致取样时其在样品瓶顶部气体中的分布浓度高，进行HS-GC-MS检测时溶剂峰过大，不利于七氟烷峰的识别，且易导致质谱检测器过载。因此针对性地选取高沸点溶剂乙二醇（沸点197.3 °C）来配制七氟烷标准溶液。一方面它能够分别与七氟烷、水和血液混溶，有利于添加样品的均匀性和方法可重复性；另一方面乙二醇蒸气压较低，检测时溶剂峰不明显，有利于七氟烷在分析图谱中的识别。
按照1.2部分给定的色谱质谱条件分别检测七氟烷和HFIP的人全血添加样品，得到总离子流图(TIC)和两种物质分别对应的MS(EI)谱图，分别见图1～2。
2.1 七氟烷和HFIP的GC-MS谱图分析
顶空进样平衡条件的选取，根据检测目标物七氟烷和HFIP的沸点分别为58.6、59 °C，采用平衡温度60 °C，保持20 min的顶空进样平衡条件，在充分提取待测组分的同时可以避免生物基质干扰。
气相色谱-质谱联用仪Shimadzu GC-MS QP2010Ultra，配GC-MS Solution软件工作站，HPPLOT/Q (30 m × 0.32 mm × 20 μm)色谱柱。
图2给出了七氟烷和HFIP的质谱信息和碎片峰归属。两种物质的分子离子峰均不可见，主要碎片由母离子分别断裂C-F、C-O和C-C单键得到，如插图(A)(B)所示。此外，m /z 79碎片峰在二者质谱图中均有较高丰度，且不能由母离子简单断裂产生，其结构可能为m /z 99碎片脱除HF生成的酰基(D)或烯醇(E)；进一步考察发现谱图中存在二氟甲基离子(m /z 51)，故推测m /z 79碎片结构为二氟乙酰基离子；同理，HFIP的m /z 129碎片(C)也与母离子脱除HF有关。综合考虑离子质荷比和相对丰度，选取m /z 131为七氟烷的定量离子，m /z 99作为HFIP的定量离子。
图1 GC-MS总离子流图（a:空白血样；b:七氟烷10.0μg/mL血添加样品；c:HFIP 100.0μg/mL血添加样品）
Fig.1 Total ion current spectrum of GC-MS (a. control sample;b. blood sample added of 10.0μg⁄mL sevoflurane; c. blood sample added of 100.0μg⁄mL HFIP)
图2 七氟烷和HFIP的MS(EI)谱图及碎片峰归属（a:七氟烷；b:HFIP）
Fig.2 Mass spectrogram (EI) of sevoflurane and HFIP plus the identification of the fragmented ions (a. sevoflurane; b. HFIP)
2.2 线性方程与方法检测限(LOD)
分别配制七氟烷和HFIP梯度浓度的血添加样品并进样分析。七氟烷浓度依次为为0.1、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 µg/mL，HFIP 为 1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 µg/mL。以各自定量离子峰的积分面积y 对添加浓度x 进行线性拟合，得到七氟烷在0.1～100.0µg/mL浓度范围内的定量线性方程y = 140257 x -55547，线性相关系数R2 = 0.996；HFIP在1.0～100.0µg/mL浓度范围内的定量线性方程y = 5803 x -9086，线性相关系数R2 = 0.998。可见本方法对七氟烷和HFIP均有良好的浓度-响应线性关系。
4.Have you had some sort of cosmetic surgery ? eg.Tattoo eyebrow，double-fold eyelid operation.
比较二者线性方程的斜率可以发现，相同浓度下七氟烷的MS(EI)信号强度明显高于HFIP，反映了同一质谱条件下二者离子化难易程度不同，另一方面，七氟烷的血/气分配比远小于HFIP，可能在样品瓶顶部气体中的实际分布浓度更高。
分别配制七氟烷和HFIP的低浓度血添加样品进样分析，根据定性离子信噪比(S/N)≥3计算，得到本方法的七氟烷定性检测限(LOD)为50.0 ng/mL，HFIP定性检测限(LOD)为0.5 µg/mL。
2.3 回收率与精密度
参考顶空气相色谱法检测毒物的相关研究[12-13]考察本方法回收率。分别配制相同浓度的七氟烷血添加和水添加样品进样分析，以二者的七氟烷峰面积比y 血/y 水为回收率。结果显示，添加浓度为0.1 µg/mL时回收率为94%，10.0 µg/mL时为95%；同样方法考察HFIP回收率，添加样品浓度为5.0 µg/mL和10.0 µg/mL时，回收率分别为93%和92%。
配制相同浓度的七氟烷- HFIP混合血添加样品（人全血 1.00 mL，七氟烷 10.0 μg，HFIP 10.0 μg，去离子水1.00 mL，混合均匀）6份，连续进样并记录峰面积，用下列公式分别计算七氟烷和HFIP峰面积的相对标准偏差(RSD):
式中n 为进样次数，xi 为单个样品中目标物质定量离子峰的积分面积，
为平均积分面积。计算得到七氟烷检测结果的RSD (n = 6)为9.8%，HFIP的RSD (n = 6)为9.0%。表明本方法有良好的精密度和可重复性。
那么，从什么时候开始就让孩子意识到他不是家庭的核心比较好呢？按照《法国妈妈育儿经》的说法，从孩子婴儿期就可以开始，不是他饿了，就第一时间送上食品；也不是他想半夜起床7次，父母就跟着睡不到好觉……听上去法国父母好像蛮冷血的，我们不一定要做到那么严苛，但至少可以做到不要在孩子面前，24小时、365天都是牺牲狂。要知道，很多熊孩子，不一定是因为父母特霸道，恰恰是因为父母在他面前，太圣母太圣父。
3 结论
本研究建立了适用于血液中七氟烷及其代谢物HFIP同步检测的HS-GC-MS方法。本方法操作简单，灵敏度高，基质干扰小，可进行准确定性和定量分析，能够满足毒物检验工作的需要，为案件调查和死因判定提供支持。七氟烷作为广泛使用的吸入性麻醉剂，有一定临床风险和滥用风险，不当使用会损伤神经系统和心、肺、肝等脏器，严重情况下可致死。相关滥用致死报道中，死者血液的七氟烷含量一般高于8µg/mL，肝、肺、脑等脏器中浓度高达29～269 µg/g。笔者对国内一起案件的腐败肝脏检材进行匀浆处理后，采用本文建立的HS-GC-MS方法测得七氟烷含量为 35.9 µg/g，HFIP 含量为 1.1 µg/g。文献报道和研究数据显示七氟烷倾向于在呼吸系统和肝、脑等脏器中积累，因此涉及七氟烷的中毒案件在提取检材时应有所侧重。根据检材中七氟烷及其代谢物的浓度关系推断死亡时间和药物摄入量等问题还有待进一步
研究。
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Detection of Sevoflurane and Its Metabolites in Blood Samples
ZOU Bo, WEI Chunming, CHANG Jing, REN Xinxin, WANG Aihua, SONG Ge, ZHANG Yunfeng, YU Zhongshan
(Institute of Forensic Science, Ministry of Public Security ＆ Beijing Engineering Research Center of Crime Scene Evidence Examination, Beijing 100038, China)
ABSTRACT: Objective To establish a gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) method for determining sevoflurane and its metabolite, hexafluoroisopropanol (HFIP), in blood samples for forensic to xicant detection. Methods whole blood(1.00mL) was placed into a 10mL headspace vial and diluted by 1.00mL deionized water. The vial was immediately sealed and maintained at 60°C for 20 minutes. The head space gas was analyzed by HS-GC-MS (EI) through HP-PLOT/Q (30m ×0.32mm × 20μm) capillary column, with the data being acquired in SCAN mode. Results The qualitative ions of sevoflurane were m /z = 131, 79, 69, with the detection limit (LOD) being 50.0ng/mL at good linearity ranging among 0.1～100.0μg/mL(R2 = 0.996) and the relative standard deviation (RSD) (n = 6) ＜ 10%; meanwhile, the qualitative ions of HFIP were m /z = 99,79, 69, with LOD being 0.5μg/mL under linearity in good range of 1.0～100.0μg/mL (R2 = 0.998) and the RSD (n = 6) ＜ 10%.Conclusion This method can simultaneously and accurately determine the content of sevoflurane and its metabolite HFIP in human blood.
KEY WORDS: toxicant detection; sevoflurane; blood; HS-GC-MS (EI)
中图分类号: DF795.1
文献标识码: A
文章编号: 1008-3650(2019)05-0425-04
基金项目 :中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(No. 2017JB008)
第一作者简介: 邹波，男，河北晋州人，博士，助理研究员，研究方向为毒物检验技术。E-mail: zoubo1141@126.com
DOI: 10.16467/j.1008-3650.2019.05.010
收稿日期: 2019-01-31；修回日期:2019-04-29
引用本文 格式:邹波，魏春明，常靖，等. 血液中七氟烷及其代谢物的检验[J]. 刑事技术，2019,44(5):425-428.
标签：毒物检验论文; 七氟烷论文; 血液论文; 顶空气相色谱-质谱联用法论文; 公安部物证鉴定中心北京市现场物证检验工程技术研究中心论文;