（中国医科大学 辽宁 沈阳市 110001）
中图分类号: R743 文献标识码:A
皮层传导抑制是一个缓慢传播的神经细胞和神经胶质细胞去极化过程，进而导致了对突触活性的瞬间抑制的现象[1-3]。这是由于神经元和神经胶质细胞持续的去极化使膜通道失活而不能发生动作电位，进而导致大脑的电生理活动的沉默，即电生理活动的抑制。在皮层传导抑制的过程中，膜电位去极化，细胞内外离子流发生变化，细胞瞬间缺氧，神经递质－谷氨酸释放，继而刺激临近的细胞去极化，实现“抑制”的传导。
一般情况下在头痛发生之前，会有瞬间的神经系统症状的征兆，有30%的患者在发病之前有征兆，特别是对视觉的干扰[1]，M.A.Moskowite等人认为，正是皮层传导抑制引起了偏头痛的预兆，即出现皮层传导抑制现象[2]。有研究表明在皮层传导抑制过程中，有谷氨酸神经递质释放到突触间隙中，那么，释放的谷氨酸的“去路”是非常重要的问题，相关的环节会直接影响到传导抑制产生的效果。目前已经明确，突触间隙中多余的谷氨酸是由分布在神经胶质细胞及神经元突触膜上谷氨酸转运体进行重摄取的，在脑内主要有三种谷氨酸转运体，即：兴奋性氨基酸转运体（Excitatory amino acid carrier 1，EAAC1），谷氨酸—天冬氨酸转运体（Glutamate/aspartate transporter，GLAST）和神经胶质细胞谷氨酸转运体（Glial glutamate transporter，GLT1）[3]。但目前还不清楚具体这些谷氨酸转运体对皮层传导抑制的影响，我们假设谷氨酸转运体通过影响突触内谷氨酸的浓度而影响皮层传导抑制的发生或者其速度的快慢，这可能是偏头痛等疾病发生的病理生理学基础。
本实验为进一步明确皮层传导抑制的分子生物学机制，利用相关基因敲出动物模型，主要探讨了皮层脑组织中谷氨酸转运体EAAC1，GLAST和GLT-1对皮层传导抑制发生和传播的影响。
材料与方法
实验动物处理及分组
（一）实验动物
选用健康C57BL6小鼠及基因敲除（见下述）小鼠，雌雄不拘，体重15～20g，基础体温(38.1±0.2)℃。饲育室温度(20±2)℃，相对湿度40%-60%，昼夜光照节律12h:12h，单笼饲养，自由进食水。实验中各项操作按常规无菌规则进行。
（二）实验分组
将动物随机分为3大组，每组中未做基因敲除的小鼠作为对照组，相应基因敲除的小鼠作为实验组，具体如下：
GLAST(+/-) 作为对照组，即为C57BL6小鼠。
GLAST(-/-) 作为实验组，即敲除GLAST基因的C57BL6小鼠；
EAAC1(+/-) 作为对照组，即为C57BL6小鼠。
EAAC1(-/-) 作为实验组，即敲除EAAC1基因的C57BL6小鼠。
GFAP-Cre(+/-)； GLT1(flox/w) 作为对照组，详细见下述。
GFAP-Cre(+/-)； GLT1(flox/flox) (条件性敲除)作为实验组，即只在神经胶质细胞中敲除GLT1基因的小鼠，详细见下述。
关于特定敲除神经胶质细胞中GLT1基因的小鼠的获得，其具体原理及做法如下：Cre-loxp 是一个基于传座效应的DNA片段同源重组系统。Cre是一个酶，可以识别一段DNA序列中相邻的两个loxp片段，并将两个loxp间的DNA序列剪切，在原位点上只留下一个loxp，达到切除目的基因片段的目的。GFAP(glial fibrillary acidic protein)，神经胶质酸性蛋白，主要存在于星形神经胶质细胞内，通过转基因技术得到GFAP-Cre(+/-)系列小鼠和GLT1(flox/flox)小鼠，交配得到GFAP-Cre(+/-)；GLT1(flox/flox)小鼠，即只敲除神经神经胶质细胞中的GLT1基因；
通过GFAP-Cre(+/-)系列小鼠和GLT1(flox/w)小鼠交配得到GFAP-Cre(+/-)；GLT1(flox/w)小鼠，即为对照组。
二、小鼠大脑皮层插入记录电极
大脑皮层插入电极：将小鼠用10％乌拉坦（1.4ml/kg）腹腔麻醉，然后将其头部固定于立体定位仪上，暴露前囟。参照小鼠脑图谱，如图1所示，向大脑皮层如下坐标处R1（B：＋1mm，L/R：1mm，H：0.2mm），R2（B：－1mm，L/R：1mm，H：0.2mm）与矢状面垂直，插入两个玻璃电极，电极尖端电阻为1－2MΩ，电极内充满0.5 M NaCl，并且在鼻骨上方放置一个Ag/AgCl参考电极。在大脑皮层插电极手术后，马上进行电生理学实验。
三、电生理信号的记录
应用放大器(Dagan， EX4-400)测量直流电（DC）和交流电(AC)信号，用Powerlab （AD instruments）纪录的样本速率是1k Hz／s。将浸泡在300 mM KCl溶液中的棉球放在视觉皮层(2 mm lateral and 0 mm anterior to the lambda)上一个小时，用于诱导皮层传导抑制的出现，同时纪录电信号1h。纪录下来的数据用MATLAB (Mathworks， MA)进行分析。
测量皮层传导抑制有如下四个指标：敏感性，传播速度，半峰宽和幅度（峰高）。如图2所示，传播速度是指将两个记录电机之间的距离除以传播所需的时间。半峰宽是峰高一半处的峰宽度。幅度是指基线与去极化最大值之间的距离。敏感性是指在一定时间内，产生的传导抑制数量的多少，皮层传导抑制的数量越多，敏感性越高。
四、免疫化学染色检测GLT1条件性敲除小鼠大脑中GLT1表达
将冰冻切片在4℃条件下用PFA固定过夜，加入正常山羊血清封闭液孵育15min，兔抗大鼠GLT1抗体1:1000（Hokkaido Univ）， 4℃过夜。翌日经0.01M PBS(pH 7.4)充分漂洗后，暗室内滴加山羊抗兔抗体IgG-FITC(1:5000)，室温孵育30min，预冷PBS洗3次，每次5min。充分清洗后，荧光显微镜下观察并摄片。
五、统计学处理
采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，所有实验数据均用均数±标准差（±s）表示，各组均数间差异的比较应用t检验，相关分析用相关性检验分析法。
实验结果
一、对照组与基因敲出组大脑皮层中GLT1表达水平的比较
通过采用免疫组织化学的方法，首先对在神经胶质细胞中敲除GLT1小鼠大脑组织中GLT1 表达水平进行了确认，如图3所示，在条件性敲除的小鼠中，大脑组织GLT1的表达明显减少。
免疫组织化学方法鉴定敲除神经胶质细胞中GLT1后小鼠大脑皮层中GLT1的表达，图中蓝色为表达的GLT1。
A：对照组（GFAP-Cre(+/-)； GLT1(flox/w)）；B：条件性敲除GLT1组（GFAP-Cre(+/-)； GLT1(flox/flox)）。
另外两种谷氨酸转运体EAAC1和GLAST1基因敲出动物来自柳泽（Tokyo Medical and Dental University）惠赠，其敲出效果也得到了该研究室的确认。
二、神经胶质细胞谷氨酸转运体对诱发皮层传导抑制的影响
图4显示各组在经过相同的实验因素处理后，记录电生理信号一个小时，皮层传导抑制（CSD）的变化情况。与对照组EAAC1(+/-)比较，神经元兴奋性氨基酸转运体（EAAC1）敲除小鼠，以皮层传导抑制的敏感性，传播速度，幅度和半峰宽作为参数，对照组与实验组之间没有显著性差异。与对照组GLAST(+/-)比较，谷氨酸—天冬氨酸转运体（GLAST）敲除小鼠，对照组与实验组之间没有显著性差异。与对照组GFAP-Cre(+/-); GLT1(flox/w) 比较，GFAP-Cre(+/-); GLT1(flox/flox)小鼠作为实验组，对照组的敏感性增加，传播速度加快，而幅度与半峰宽与实验组之间没有显著性差异。
结 论
1、兴奋性氨基酸转运体（EAAC1）不参与皮层传导抑制的发生与传播。
2、谷氨酸—天冬氨酸转运体（GLAST）不参与皮层传导抑制的发生与传播。
3、神经胶质细胞谷氨酸转运体（GLT1）参与皮层传导抑制的发生与传播，皮层组织中GLT1表达量减少，促进皮层传导抑制的发生。
讨 论
谷氨酸在中枢神经系统中是很重要的兴奋性神经递质[4]。谷氨酸信号通路在兴奋性突触传递中扮演重要角色，同时，谷氨酸受体过度激活可以引起神经退化性疾病[7]。本实验主要检测了分布在神经胶质细胞上的谷氨酸转运体GLAST1和GLT1及分布在神经元上的谷氨酸转运体EAAC1在皮层传导抑制中的作用。在三个主要的谷氨酸转运体中，显示了对皮层传导抑制影响的差别。本实验结果提示，兴奋性氨基酸转运体（EAAC1）不参与皮层传导抑制的发生与传播。谷氨酸—天冬氨酸转运体（GLAST）也不参与皮层传导抑制的发生与传播。而神经胶质细胞谷氨酸转运体（GLT1）参与了皮层传导抑制的发生与传播，GLT1表达量减少，会促进皮层传导抑制的发生，提高其传播速度、敏感度和半峰宽 。但是有关更直接的证明还需要进行电生理学方面的深入研究。
·参考文献·
Lashley KS. Patterns of cerebral integration indicated by the scotoma of migraine. Archives of Neurology and Psychiatry 42:259-264.
Bowyer SM， Aurora KS， Moran JE， Tepley N， Welch KM. Magnetoencephalographic fields from patients with spontaneous and induced migraine aura. Ann Neurol 50:582-587.
Hadjikhani N， Sanchez Del Rio M， Wu O， Schwartz D， Bakker D， Fischl B， Kwong KK， Cutrer FM， Rosen BR， Tootell RB， Sorensen AG， Moskowitz MA. Mechanisms of migraine aura revealed by functional MRI in human visual cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98:4687-4692.
Lauritzen M， Hansen AJ (1992) The effect of glutamate receptor blockade on anoxic depolarization and cortical spreading depression. J Cereb Blood Flow Metab 12:223-229.
论文作者:孙伟楠
论文发表刊物:《世界复合医学》（下）2015年第1卷总第8期
论文发表时间:2015/10/30
标签：谷氨酸论文; 皮层论文; 小鼠论文; 抑制论文; 胶质论文; 神经论文; 细胞论文; 《世界复合医学》（下）2015年第1卷总第8期论文;