1.湘潭市第一人民医院普外3科 411101；2.赣南医学院附属医院普外2科 341000
【摘 要】目的：检测CXCR4抑制剂LPS对胆管癌细胞株QBC939生长和凋亡的影响，探讨LPS作为胆管癌靶向治疗的可行性。方法：免疫细胞化学SP法检测胆管癌细胞株QBC939中CXCR4的表达；观察LPS对QBC939细胞的生长的抑制作用；流式细胞仪检测LPS对QBC939细胞凋亡的影响。结果：QBC939细胞株中CXCR4蛋白呈阳性表达。LPS对QBC939细胞生长有抑制作用，LPS浓度越高，对QBC939细胞生长的抑制越明显。各浓度LPS可不同程度地诱导QBC939细胞凋亡，5.0ug/ml浓度LPS对凋亡的诱导最明显（P<0.05）。结论：胆管癌细胞株QBC939中CXCR4蛋白呈阳性表达；CXCR4抑制剂LPS 能抑制胆管癌细胞株QBC939的生长，并能明显诱导细胞的凋亡。
【关键词】胆管癌细胞；CXCR4；脂多糖；凋亡
CXCL12（即基质细胞衍生因子1 stromal cell derived factor-1，SDF-1）是一种趋化因子，由基质细胞分泌，CXCR4是CXCL12的唯一受体。CXCR4基因在肿瘤的生长与转移过程中发挥重要的作用，通过抑制其表达，可望达到抑制或延缓肿瘤的生长与转移。胆管癌组织中CXCR4蛋白高表达，而且与转移及预后相关[1]。本实验在免疫细胞化学法证实人胆管癌细胞株QBC939中CXCR4蛋白阳性表达的基础上，采用胆管癌细胞与CXCR4抑制剂LPS共培养后，观察LPS对QBC939细胞生长和凋亡的影响，旨在为胆管癌的基因治疗提供实验依据。
1材料与方法
1.1 材料
人永生化胆管癌细胞系QBC939，由第三军医大学西南医院肝胆外科中心王曙光等建株，购自湘雅医院实验室。主要试剂：溴化二甲基噻唑二苯四氮唑（MTT）：美国AMRESLO公司。鼠抗人CXCR4单抗（购自R&D公司，clone：44716），辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体（二抗）Santa Cruz 公司（USA）。流式细胞仪：Becton Dickinson公司，FACStarplus型，美国。
1.2 实验方法
1.2.1细胞培养与分组
人胆管癌细胞株QBC939，用含10％ 小牛血清的RPMI 1640培养液，于37℃，5％浓度的CO2培养箱中培养，0.25％的胰蛋白酶消化传代，收集70％～80％融合、处于对数生长的细胞传代接种于6 孔板内，调整细胞浓度，使每孔的细胞数为 3 ×105 /ml，分别加入LPS，使LPS浓度分别为0.1ug/ml、1.0ug/ml和5.0ug/ml，每组设5个复孔，为试验组，分别标为LPS1、LPS2、LPS3。对照组不加LPS，加等量培养液，培养24小时后进行后续实验。
1.2.2 免疫细胞化学检测QBC939中CXCR4蛋白的表达
取对数生长的QBC939细胞用0.25％胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×105/ml，接种于六孔培养板（内放有盖玻璃片）内爬片，于37℃、5％CO2浓度的培养箱中培养，24小时后用4℃、3.7％多聚甲醛固定10分钟；将已经固定的细胞用4℃PBS漂洗3次，用0.1％Triton X－100处理20分钟以增加细胞通透性，PBS清洗2×5分钟；1％H2O2处理3分钟阻断内源性过氧化物酶，PBS清洗3×5分钟；滴加正常羊血清，于37℃湿盒中孵育30分钟以消除非特意性着色；吸干正常羊血清，滴加特异性的CXCR4蛋白抗体，于37℃湿盒中孵育30分钟，4℃冰箱过夜；PBS清洗3×5分钟，滴加生物素标记的二抗，于37℃湿盒中孵育45分钟；PBS清洗3×5分钟，滴加试剂SP，37℃湿盒中孵育30分钟；PBS清洗3×5分钟，双蒸水清洗5分钟滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色，自来水中止显色，苏木素复染细胞核，取出玻片，吸水纸吸干，甘油封片。阴性对照用PBS代替一抗。试验阳性为细胞膜或细胞质内出现棕黄色着色颗粒。
1.2.3 光镜观察LPS对QBC939细胞的生长抑制
将各组细胞用含10%新生牛血清的1640重悬，倒置显微镜下计数细胞，调整细胞浓度为1×104/ml；将各组细胞接种于96孔板内，每组0.2ml，每组设置5个复孔；常规条件下培养24小时后，光镜下观察各组细胞的生长情况。
1.2.6流式细胞仪检测细胞凋亡
调整细胞浓度至1×1005～1006/ml，3组受试细胞及对照组细胞常规条件下培养24后1000转/分离心5分钟PBS洗涤，重复3次，70％乙醇固定后上机：采用Beckon/Dickinson Facssort型流式细胞仪，在488nm波长处进行检测；测量的数据和图片送入计算机，应用相应程序软件进行资料的处理和分析；细胞凋亡指数（AI）的计算：AI=亚二倍峰细胞数/总细胞数×100%。细胞增殖指数（PI）的计算： PI=（S+G2/M）/（G0G1+S十G2/M）×100%。
1.3 统计学方法
数据均以均数±标准差（±s）表示。使用SPSS19.0统计软件包处理数据。各组间比较应用t检验及单因素方差分析，P<0.05认为差别有显著性。
2结果
2.1免疫细胞化学检测QBC939细胞株中CXCR4蛋白的表达
QBC939细胞株中CXCR4蛋白阳性表达，分布在胞浆及胞膜，呈淡黄色至棕黄色着色。
2.2 LPS对QBC939细胞生长与形态的影响
LPS与细胞共培养24小时后，光学显微镜下观察，对照组细胞生长良好，贴壁好，LPS1组细胞贴壁变化不大，但LPS2及LPS3组细胞生长状况较差，易脱壁死亡，有较多细胞碎片出现。
2.3 各浓度LPS对QBC939细胞凋亡的影响
各浓度LPS可不同程度地诱导QBC939细胞凋亡，各浓度LPS组细胞凋亡指数明显高于各对照组（P<0.05），以1.0ug/ml、5.0ug/ml浓度LPS对凋亡的诱导最明显（P<0.05）（表2.3，图2.3）。
3讨论
随着分子生物学研究方法的进步，人们逐渐认识到肿瘤发生、发展中存在基因异常。大量的文献报道CXCR4基因参与许多疾病的发生、发展，尤其是在肿瘤的发生与转移过程中，而CXCR4在肿瘤微环境的表达水平可以被一些细胞因子所调节。炎症介质LPS可以下调胆管癌细胞株QBC939表面的CXCR4基因和蛋白水平，抑制细胞的生物学活性[3]。能明显促进化疗药物对胆管癌QBC939的杀伤作用[4]。在裸鼠标本中，也可以明显抑制胆管癌抑制瘤的生长。本试验结果显示，在胆管癌细胞株及胆管癌组织标本中，存在有CXCR4基因的表达，而应用不同浓度LPS抑制CXCR4基因后，能明显的抑制QBC939细胞的生长，说明LPS能通过抑制CXCR4而有效的抑制QBC939细胞的生长，而且有浓度相关，也说明CXCR4基因能影响胆管癌细胞株QBC939的生长。
本试验采用流式细胞仪对与LPS共培养的QBC939细胞的凋亡情况进行检测，发现LPS能明显的诱导凋亡，经不同浓度的LPS共培养后，凋亡指数分别达到7.74±1.56％、19.31±3.52％和22.12±1.86，明显高于对照组的3.53±0.32（P﹤0.05），以高浓度的LPS（1.0ug/ml、5.0ug/ml）诱导细胞凋亡最为显著，说明LPS能通过抑制肿瘤细胞QBC939表面的CXCR4基因来抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡，从而发挥治疗作用。
综上所述，LPS能抑制胆管癌细胞株QBC939的活性和促进凋亡的作用。LPS为革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，易于获得，有成为胆管癌的靶向治疗药物的可能。
参考文献：
[1]霍胜军、汤恢焕、魏伟。CXCL12及受体CXCR4在胆管癌中的表达及其临床意义[J]。现代生物医学进展，2008，8（4）：658-660
[2]Triantafilou M，Lepper PM，Briault CD，et al.Chemokine receptor 4（CXCR4）is part of the lipopolysaccharide "sensing apparatus"[J].Eur J Immunol. 2008，38（1）：192-203.
[3]霍胜军、汤恢焕、曾祥福。CXCR4抑制剂LPS对胆管癌细胞株QBC939生物学行为的影响[J]。中国肿瘤临床，2010，37（12）：669-672。
[4]霍胜军、邹晓鹤、吕忠诚等。LPS对5-Fu杀伤QBC939细胞的影响的实验研究[J]。医学研究杂志，2015，44（3）：78-80。
江西省卫生厅基金资助项目（20091198）
论文作者:霍胜军, 刘杰仁, 王康, 曾祥福, 王建忠
论文发表刊物:《航空军医》2015年5期
论文发表时间:2015/12/4
标签：细胞论文; 细胞株论文; 浓度论文; 凋亡论文; 抑制论文; 胆管癌论文; 生长论文; 《航空军医》2015年5期论文;