赵松波[1]2009年在《产单核细胞李氏杆菌溶血素基因的克隆与表达》文中指出李氏杆菌病是由单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LMO)引起的一种人畜共患的急性、致死率较高的传染病,李氏杆菌溶血素(Listeriolysin O,LLO)是重要的毒力因子。本文用PCR扩增并克隆了hlyA基因,构建了原核表达载体pET-30a-hlyA,在Ecoli BL21(DE3)中进行表达,最佳表达条件为IPTG 1.0mmol/L、诱导温度28℃、诱导时间5h,表达的LLO主要以可溶性形式存在。用亲和层析法获得了纯度较高的LLO。Western-blot分析表明,表达的LLO能被小鼠的阳性血清所识别,具有反应原性。用纯化的LLO免疫小鼠,在免疫后45天,可完全保护致死剂量LMO的攻击。建立了利用表达LLO检测LMO的ELISA方法。
周邦信[2]2010年在《产单核细胞李氏杆菌P60蛋白对全菌灭活苗免疫效力的增强作用研究》文中研究说明产单核细胞李氏杆菌(Listeria monocytogenes,LM)是人畜共患的李氏杆菌病病原菌,引起脑膜炎、脑膜脑炎、流产及败血症等。P60蛋白是LM保护性免疫的重要抗原,P60遭到破坏是导致LM灭活苗保护力较低的原因之一。为增强LM灭活菌疫苗的免疫效力,本论文进行了以下几方面研究。1产单核细胞李氏杆菌入侵相关蛋白P60基因的克隆、表达及纯化。用PCR扩增LM 5782株iap基因,将其亚克隆至表达载体pET-30a,转化大肠杆菌BL21 (DE3),SDS-PAGE分析表明,表达的融合蛋白His-P60(简称P60)分子量约为46 ku,主要在上清中表达。Western-blot表明,P60可被LM全菌多抗识别,具有良好的反应原性。利用His标签亲和层析法纯化His-P60至电泳纯,分光光度计测定蛋白浓度为3.5mg/mL。2 P60对产单核细胞李氏杆菌灭活苗免疫增强作用的研究2.1 P60-LM灭活苗的免疫效力试验将电泳纯的P60(稀释至1mg/mL)与LM灭活菌(1010个/mL)混合,加Montanide ISA206佐剂1:1混合制备疫苗(P60-LM),背部皮下免疫BALB/c小鼠0.2 mL。初免后21 d同法进行二免,每隔7 d断尾采血,用间接ELISA检测抗体效价、MTT法检测淋巴细胞刺激指数、流式细胞术检测T淋巴细胞亚群比例、用Goat anti-mice ELISA检测试剂盒检测IL-4和IFN-γ的水平。二免21 d后,各组小鼠腹腔注射2×106 CFU/只(半数致死量)的LM活菌,48h后每组随机抽取10只小鼠,检测小鼠脾脏内的平均活菌数及细菌在小鼠体内的繁殖率。各组剩余的10只小鼠,记录2周内小鼠死亡数及死亡时间。同时,同法制备P60亚单位苗(P60蛋白1mg/mL)、LM灭活疫苗(1010个灭活菌/mL)及PBS空白对照组,此叁个对照组以相同剂量相同程序进行平行免疫,并对比检测各项指标。结果表明,①一免后7 d开始,P60-LM灭活菌组的间接ELISA抗体效价均显着高于叁个对照组(P<0.05),一免后14 d差异极显着(P<0.01);②二免后21 d, P60-LM灭活菌组(1.975±0.024)的淋巴细胞刺激指数显着高于LM灭活菌组(1.539±0.032)和PBS对照组(1.046±0.027)(P<0.05),分别增加了26.11%和78. 45%,但与P60组(1.899±0.053)比较差异不显着(P>0.05);③T淋巴细胞亚群分析表明,P60-LM灭活菌组小鼠CD3+和CD4+细胞比例均高于其他各组,其中CD4+细胞分别比LM灭活菌组、P60组和PBS对照组增加了31.51%、26.37%和44.66%,而CD8+细胞平均降低了11.36%、9.72%和38.64%,CD4+/CD8+细胞平均比值分别增加了22.89%、60.46%和18.67%;④一免后第7 d开始,除PBS对照组以外,其它各组IL-4水平逐步降低, P60-LM组和P60组与其他两组比较差异显着(P<0.05),除PBS对照组以外,其它各组IFN-γ水平差异不显著(P>0.05),但P60-LM组和P60组的IFN-γ/ IL-4比值升高,与其他各组比较差异显着(P<0.05);⑤攻毒保护试验表明,攻毒后7 d,P60-LM组小鼠全部存活,叁个对照组均有小鼠死亡;攻毒后14 d存活率为:P60-LM组为9/10、LM组4/10、P60组6/10、PBS组0;攻毒后48 h小鼠脾脏内LM平均计数为:PBS组1.42×108CFU/ g,极显着高于其它叁组(P<0.01),分别是P60-LM组、LM灭活菌组和P60组的194254.45、1392.16和118.33倍。2.2 P60-LLO-LM灭活苗对家兔的免疫效力试验用家兔进行P60-LLO-LM苗(P60蛋白1mg/mL+LLO蛋白0.3 mg/mL +1010个灭活菌/mL)、LM灭活菌和PBS空白苗的免疫试验,通过对各组家兔的抗体水平、IL-4和IFN-γ的含量变化以及发病情况,体内繁殖率的检测,证明P60和低剂量LLO能增强灭活疫苗的免疫保护效果,和BALB/c小鼠免疫试验的结果一致。结论:添加P60可刺激小鼠T淋巴细胞向CD4+的Th型方向分化,并增加淋巴细胞刺激指数,同时增强小鼠的体液免疫功能和细胞免疫功能;P60-LM苗和P60-LLO-LM苗的免疫保护力均显着高于LM灭活苗和P60亚单位苗。
参考文献：
[1]. 产单核细胞李氏杆菌溶血素基因的克隆与表达[D]. 赵松波. 甘肃农业大学. 2009
[2]. 产单核细胞李氏杆菌P60蛋白对全菌灭活苗免疫效力的增强作用研究[D]. 周邦信. 甘肃农业大学. 2010