解放军第一五九医院 检验病理科
摘要：目的：研究GLP-1受体激动剂Exendin-4腹腔给药对MCAO所致小鼠脑缺血/再灌注损伤模型的神经保护作用。方法：SD大鼠手术前1h腹腔给予Exendin-4，进行MCAO损伤，再灌注24h后通过神经缺陷评分，TTC染色计算梗死体积，免疫荧光观察神经元和小胶质细胞生存数量及检测凋亡通路相关蛋白的表达评价神经保护作用。结果：Exendin-4能够保护由于MCAO所致的神经损伤，减少了缺血部位的梗死体积，降低皮层凋亡蛋白的表达，保护神经细胞，抑制神经元凋亡。结论：Exendin-4可以对MCAO所致脑缺血/再灌注损伤具有神经保护作用，该作用是通过抑制凋亡蛋白的产生，从而抑制细胞的凋亡。不仅如此，Exendin-4可以作为治疗脑中风的有效药物。
关键词：GLP-1受体激动剂，MCAO，神经元，小胶质细胞，凋亡
1. 材料与方法
1.1 动物
250-280g SD大鼠购买于陕西省西安市第四军医大学动物中心。大鼠随机分为分为Sham组，MCAO组，MCAO+Exendin-4（5μg/kg/d）组。Exendin-4的给药浓度根据以往文献报道使用。
H-DMEM（HyClone，美国）；FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司）；兔抗鼠caspase，Bax，Bcl-2，iba，neuron（abcam，英国）。
1.2 动物模型的构建
根据以往文献报道的MCAO大鼠模型构建方法构建模型动物。1%戊巴比妥钠麻醉动物。将动物固定在操作台上，将颈总动脉，颈外和颈内动脉分离，在颈外和颈内动脉分叉处插入尼龙包被的硅脂线。2h后将线拔出，血液回流。
1.3 神经缺陷分析
根据贝德森评分标准分析脑损伤。0分，没有损失发现；1分，向对侧旋转；2分，没有旋转并且降低向另一侧的推力；3分，向受影响的一侧倒去；4分，没有自发运动。
1.4 TTC染色
取大鼠大脑，-20℃速冻30min。大脑组织随后以2mm的宽度切片。脑片在2%的TTC溶液中染色30min，避光，随后4%多聚甲醛室温固定24h。
1.5 免疫荧光染色
将大鼠大脑完整取出，冰冻切片机切片，贴片。4%多聚甲醛固定，通透，加入血清封闭，而后根据抗体相应的稀释浓度，配制工作液，4℃封闭过夜，清洗，荧光二抗封闭，清洗，封片。
1.6 Western blot
取大鼠缺血半脑皮层，剪碎，加入含有PMSF和磷酸酶抑制剂的RIPA，裂解，提取上清，BCA蛋白定量，制备样品。电泳电压80V/120V；转膜电压100V，100min；剪膜；封闭2h；洗膜：用清水将牛奶洗净；孵育一抗：PBST稀释一抗，4℃一抗封闭PVDF膜过夜；洗膜：将PVDF膜在一抗中取出，PBST洗3次/10min；孵育二抗：将PVDF膜放入二抗中，室温孵育2h；洗膜：PBST洗3次/10min；发光：发光液的配置为A、B液等体积混匀，化学发光仪检测蛋白的表达。
1.7 统计学处理
计量资料均以均数±标准差（）表示，所有数据应用SPSS软件进行统计分析，组间比较用t检验，多样本比较用方差分析，两两之间比较采用SNK-q检验。P<0.05认为具有统计学差异。
2 结果
2.1 Exendin-4预处理可以降低梗死面积降低神经损害
M CAO损伤后的24h进行贝德森评分。Exendin-4预处理的小鼠评分比MCAO组的小鼠低，并且有显著性差异。（图1）
3 讨论
本实验通过预先给予MCAO大鼠Exendin-4作用，观察是否可以保护由于缺血再灌注引起的大脑损伤。结果显示，Exendin-4能够显著地降低神经损伤等级，并且降低缺血面积。结果提示Exendin-4具有保护脑损伤的作用。免疫荧光染色发现，Exendin-4可以有效的降低凋亡的细胞数量，并且神经元和小胶质细胞的存活数量明显高于MCAO组，结果提示Exendin-4可以通过提高小胶质和神经元的活性，从而保护脑损伤。Western blot 结果说明了Exendin-4通过抑制细胞凋亡通路的激活，降低凋亡相关蛋白的表达，从而发挥脑保护的作用。
参考文献：
[1]Cook，D. J.，Teves，L. & Tymianski，M. Treatment of stroke with a PSD-95 inhibitor in the gyrencephalic primate brain. Nature 483，213-217，doi：10.1038/nature10841（2012）.
论文作者:徐金唤,文进
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2017年第23期
论文发表时间:2018/1/12
标签：损伤论文; 神经元论文; 神经论文; 凋亡论文; 大鼠论文; 作用论文; 胶质论文; 《中国误诊学杂志》2017年第23期论文;