李爽1 姚宇1 李鹤1 田威2（通讯作者）
（1辽宁成大生物股份有限公司 辽宁 沈阳 110179）
（2沈阳药科大学生命科学与生物制药学院 辽宁 沈阳 110015）
【摘要】目的：建立狂犬病毒PV-2061株病毒滴度的快速、准确的检测方法。方法：取12批狂犬病毒PV-2061株的病毒样品，分别采用蚀斑法、免疫荧光法检测病毒滴度，与小鼠脑内注射法进行比较，验证其检测结果的相关性。另取一批狂犬病毒PV-2061株的病毒样品，用蚀斑法和免疫荧光法重复检测6次，比较两种实验方法的精密性。结果：蚀斑法和免疫荧光法测得的结果与小鼠脑内注射法之间呈正相关性;重复测定同一病毒样品，免疫荧光法的变异系数更低，表明免疫荧光的重复性更好。结论：以细胞法替代小鼠法检测狂犬病毒的毒力是可行的。免疫荧光法检测病毒滴度，快速、准确、精密度好，为狂犬病毒PV-2061株的疫苗的研究奠定了基础。
【关键词】狂犬病病毒；免疫荧光法；蚀斑法
【中图分类号】R373.9 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）27-0251-02
Determination of virus titer of rabies virus PV-2061 strain Li Shuang 1,Yao Yu 1,Li He 1,Tian Wei 2 (Corresponding author)
1. Liaoning Cheng Da biological Limited by Share Ltd, Shenyang , Liaoning 110179
2. School of life sciences and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, Liaoning 110015
【Abstract】Objective To establish a fast and accurate method to detect the titer of the PV-2061 strain of rabies virus. Methods The virus samples of rabies virus PV-2061 strain of 12 batches were measured by plaque assay and immunofluorescence, and compared with the intracerebral injection in mice to verify the correlation of the test results. A sample of rabies virus PV-2061 strain was also repeated for 6 times by plaque assay and immunofluorescence. The accuracy of the two methods was compared. Results The results of plaque assay and immunofluorescence were positively correlated with the intracerebral injection in mice; Repeated determination of the same virus sample showed that the coefficient of variation of immunofluorescence method was lower, indicating that immunofluorescence was more reproducible. Conclusion It is feasible to detect the virulence of rabies virus by cell method instead of mouse method. The detection of virus titer by immunofluorescence is rapid, accurate and precise, which lays the foundation for the research of vaccine against rabies virus PV-2061 strain.
【Key words】Rabies virus; Immunofluorescent assay;Plaque assay
狂犬病，俗称恐水病，是一种由狂犬病病毒感染引起的人兽共患传染病，一旦感染发病，病死率高达100%。狂犬病至今仍无特效的治疗方法，实施疫苗免疫是预防和控制狂犬病发病最有效的措施[1]。在疫苗生产的各项检测指标中，狂犬病毒毒力的测定是至关重要的，其直接关系到疫苗成品的效价和免疫效果。《中华人民共和国药典》三部（2015版）狂犬病毒滴度检测的方法推荐采用小鼠法。但是由于实验动物之间存在个体差异，实验人员操作的熟练程度等诸多因素均会影响实验结果的准确性。细胞法作为病毒滴度测定的一种替代方法，近年来广受国内外学者的青睐，其中蚀斑法、免疫荧光法等都是比较经典的实验方法。
1.材料和方法
1.1 病毒及细胞 病毒株
狂犬病毒PV-2061株第18代，由辽宁成大生物股份有限公司提供，原始毒株来源于ATCC。细胞株：幼仓鼠肾细胞（BHK-21）、非洲绿猴肾细胞（Vero）来源于中科院上海细胞库。
1.2 实验动物
昆明系SPF级小鼠，雄性，体重11～13g，来源于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。
1.3 主要试剂
FITC标记的抗狂犬病病毒特异性荧光抗体购自美国Novus Biologicals公司，浓度0.93mg/ml；新生牛血清购自美国Hyclone公司；甲基纤维素购自美国Sigma公司。
1.4 蚀斑法
1.4.1制备单层细胞 将BHK-21细胞浓度调整至1×105个/ml，接种6孔细胞培养板，长满单层备用。
1.4.2病毒滴度测定 将狂犬病毒样品5倍稀释，然后进行10倍系列稀释，共6个稀释度（1×10-4、5×10-4、1×10-5、5×10-5、1×10-6、5×10-6），接种至已制备好的6孔细胞培养板中，0.4ml/孔，于5%CO2、37℃的培养箱内吸附90min，每隔15min轻摇板一次，然后加入甲基纤维素覆盖液，4ml/孔，于培养箱中培养7d后，弃去覆盖液，加入结晶紫染色液，2ml/孔，室温30min后弃去染色液，用自来水冲洗至流水无色，晾干，细胞培养板孔内蚀斑清晰可见。统计各孔蚀斑数，计算结果，病毒滴度以lgPFU/ml表示。
PFU/ml=（每孔平均蚀斑数×病毒稀释倍数）/每孔接种病毒量
1.5 免疫荧光法
1.5.1制备单层细胞 将Vero细胞调整浓度至1×105个/ml，接种96孔细胞培养板中，长满单层后备用。
1.5.2病毒滴度测定 用细胞培养液将待测的狂犬病毒样品以10倍系列稀释，共6个稀释度（1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108），接种至制备好的96孔细胞培养板中，100μL/孔，每个稀释度6孔，每块板上设正常细胞对照孔和病毒阳性对照孔，置5% CO2、37℃培养箱中培养2d后，用PBS洗板3次，室温干燥后加入80%冷丙酮，100μL/孔，4℃固定30min后弃丙酮，置室温干燥，然后用100×稀释的荧光抗体进行染色，50μL/孔，置湿盒内37℃温育30min，洗板3次，甘油封闭，荧光显微镜下观察，计数病毒感染细胞的荧光灶数，细胞浆内有绿色特异性荧光颗粒者为阳性。正常细胞对照无特异性荧光，病毒对照阳性者为有效，以Reed-Muench法计算感染性滴度[2]。
1.6 小鼠LD50测定法
将病毒样品进行10倍系列稀释，脑内接种11～13g的小鼠，每个稀释度注射6只，0.03ml/只。连续观察14d，3天后死亡或呈典型发病症状的小鼠均计入死亡数内，计算LD50。
2.结果
12份病毒液样品分别用蚀斑法、免疫荧光法及小鼠脑内滴定法测定病毒滴度，结果见表1。蚀斑法、免疫荧光法分别与小鼠法进行比较，均显示差异无统计学意义（P值分别为0.154，0.699，均为P＞0.05），相关系数为0.646，0.859，说明蚀斑法和免疫荧光法的检测结果与小鼠LD50法呈良好的正相关性。
重复性实验，同一份病毒样本分别用蚀斑法和免疫荧光法检测6次，结果见表2。蚀斑法测得的lgPFU/ml值的范围为6.62～7.11，变异系数为2.41%；免疫荧光法测得的lgFFU/ml值的范围为6.69～7.00，变异系数为1.69%。说明免疫荧光法有更好的重复性，精密度更高。
3.讨论
国内狂犬病毒的毒力测定一直沿用小鼠LD50法，随着越来越多的人关注动物保护和动物福利等问题，细胞替代法将成为一个必然趋势。细胞培养条件相对比较好控制，不同批次的细胞均来源于同一株细胞，重复性较好，检测时间也相对较短。WHO推荐的实验室诊断方法为免疫荧光法，可精确计数被病毒感染的细胞个数，此法敏感且特异性好。目前，国内也已经开始采用免疫荧光法控制狂犬病疫苗的生产过程[3-5]。蚀斑法，从理论上讲，一个蚀斑是由一个病毒颗粒感染一个易感细胞形成的，因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分离病毒克隆，因此，以蚀斑法对毒力强弱的评价较直观、客观性强。目前这两种方法均被广泛用于狂犬病毒感染的诊断。
实验验证蚀斑法和免疫荧光法与小鼠LD50法检测结果均呈良好的正相关性，可应用于狂犬病毒株PV-2061病毒滴度的检测。重复性实验显示免疫荧光法的精密度更好，值得推广用于狂犬病毒感染性滴度的检测。
【参考文献】
[1]路明霞，殷大鹏．世界卫生组织关于狂犬病疫苗的意见书[J]．中国疫苗和免疫,2008,14(2):187-188．
[2]戴华生.新实验病毒学.病毒的滴定及其应用.第1版.北京:中国学术出版社，1983.
[3]杨屹，汝东宇，郭秀侠，等.应用篮式生物反应器制备Vero细胞人用狂犬病疫苗[J].中国生物制品学杂志,2011，24（5）:583-585，589.
[4] Hassanzadeh SM，Zavareh A，Shokrgozar MA，et al. High vero cell density and rabies virus proliferation on fibracel disks versus cytodex-1 in spinner flask[J].Pak J Biol Sci，2011，14（7）:441-448.
[5] Guo CP，Wang CH，Luo S，et al. The adaptation of a CTN-1 rabies virus strain to high-titered growth in chick embryo cells for vaccine development[J].Virol J，2014，11（1）:85-92.
论文作者:李爽1,姚宇1,李鹤1,田威2（通讯作者）
论文发表刊物:《医药前沿》2018年27期
论文发表时间:2018/11/22
标签：病毒论文; 狂犬论文; 免疫论文; 小鼠论文; 细胞论文; 荧光法论文; 狂犬病论文; 《医药前沿》2018年27期论文;