1.长沙医学院2015级本科针灸推拿2班 湖南长沙 410219
【摘 要】目的 通过观察辣椒素（Capsaicin，CAP）对辣椒素对盐酸损伤后胃黏改变和探讨CAP对盐酸所致大鼠胃黏膜损伤的影响及其机制。方法：对已建立胃出血模型的小鼠先在适宜环境中饲养三天；对各组小鼠进行不同给药，每日灌胃3ml，连续灌胃10天；A组大鼠喂食普通饲料，4周后使用生理盐水10ml／kg灌胃；B组大鼠每天喂食CAP含量为lmg／g的饲料5g／kg，4周后使用生理盐水10ml／kg灌胃；C组大鼠喂食普通饲料，4周后使用1.00×10-2mol/L浓度盐酸灌胃；D组大鼠每天喂食CAP含量为lmg／g的饲料5g／kg，4周后使用1.00×10-2mol/L浓度盐酸灌胃。各组大鼠禁食12h。记录实验结果，对各组大鼠胃壁取材，切片，HE染色，进行形态学观察分析，并分析比较各组大鼠由辣椒素对盐酸所致的十二指肠黏膜的作用。结果：与对照组相比实验组喂食辣椒素对盐酸所致的十二指肠黏膜损伤有一定的保护作用。结论：本实验用现代药学的实验方法，旨在通过观察辣椒素对被盐酸损伤的大鼠的十二指肠黏膜的作用，进一步探究辣椒素对人体消化系统潜藏的作用，从多方面探讨辣椒素的作用机理，通过该课题的研究，为临床药物的研制开拓了方向。
【关键词】辣椒素；十二指肠黏膜；盐酸；NO
辣椒素（Capsaicin，CAP）激活VR1，钙离子通道开放钙离子内流 胞质中钙离子浓度升高，引起神经元及纤维释放神经肽，如：P物质、神经激肽A、降钙素基因相关肽、血管活性肠肽和兴奋性氨基酸，如谷氨酸、天门冬氨酸。辣椒素引起神经细胞释放P物质的具体机制尚不完全清楚，Purkiss 等在离体培养大鼠背根神经节细胞的实验中发现，辣椒素引起P物质释放可能通过两种机制：一种依赖于细胞外钙离子和突触体偶联蛋白25Kpa（SNAP-25）；另一种，在无细胞外钙离子的情况下，无需SNAP-25，辣椒素也能成功刺激神经节细胞释放P物质。本研究为探讨辣椒素对盐酸所致的十二指肠黏膜损伤的作用及机制的研究，从而针对性的进行临床治疗提供理论依据，采用对照式研究方法进行调查研究，具体内容如下。
1.材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物：两月龄健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，清洁级，40只，体重200-220g，购于湘雅实验动物中心。常规颗粒饲料喂养，自由饮水。
1.1.2 实验药物：1.00×10-2mol/L浓度盐酸、含量为lmg／g辣椒素的饲料、戊巴比妥钠、NO测试盒、兔抗大鼠TRPV1、CGRP、SP多克隆抗体，二步法免疫组化检测抗剂、HE染液、4%多聚甲醛溶液。
1.1.3 主要仪器：动物饲养器具、石蜡切片机、低温离心机、图像处理系统、显微镜、手术器械一套
1.2方法
1.2.1 动物分组及干预方法：SD大鼠40只，体重200-220g，随机分为4组。（1）建立小鼠胃出血模型。以1.00×10-2mol/L浓度盐酸0.3mol对组小鼠进行灌胃7次（灌肠时尽量不损伤小鼠肠壁以造成影响）建立典型的消化胃出血模型，并检测出胃出血小鼠肠内各化学指标：灌胃前24 h禁食不禁水。实验时，各组小鼠分别灌胃O.3 m1 相应浓度的盐酸溶液，间隔48 h灌胃1次，共灌胃7次。每次灌胃后归笼饲养并观察动物精神状态、活动状态2 h。（2）实验小鼠給药。对已建立胃出血模型的小鼠先在适宜环境中饲养三天；对各组小鼠进行不同给药，每日灌胃3ml，连续灌胃10天；A组大鼠喂食普通饲料，4周后使用生理盐水10ml／kg灌胃；B组大鼠每天喂食CAP含量为lmg／g的饲料5g／kg，4周后使用生理盐水10ml／kg灌胃；C组大鼠喂食普通饲料，4周后使用1.00×10-2mol/L浓度盐酸灌胃；D组大鼠每天喂食CAP含量为lmg／g的饲料5g／kg，4周后使用1.00×10-2mol/L浓度盐酸灌胃。最后各组小鼠禁食12h。（3）观察小鼠胃出血建模情况。灌胃2h后麻醉处死大鼠，剖腹取胃窦组织，观察大鼠胃黏膜屏障损伤指数和病理组织损伤积分；取大鼠胃窦组织，用免疫组化方法检测TRPVl、CGRP、SP的表达；制作十二指肠组织匀浆并测量其NO值。
1.3 观察指标
1.3.1 存活率
观察每天大鼠的存活数，计算存活率。
1.3.2 十二指肠黏膜组织学改变（HE染色）
在细胞固定48 h后采用梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，在光学显微镜下观察。
1.3.3胃蛋白酶活性检测、胃组织匀浆中NO的测量
按试剂盒方法测胃蛋白酶活性及NO含量。
1.3.4检测TRPVl、CGRP、SP的表达
兔抗大鼠TRPV1、CGRP、SP多克隆抗体、二步法免疫组化检测抗剂，检测出此3种物质的表达。
1.4 统计学处理
实验数据用SPSS17.0统计软件分析，以均数±标准差（±s）表示。多组间比较用单因素方差分析，P＜0.05为有统计学意义。
2.结果
2.1动物存活率
大鼠全部存活，除C组有一大鼠在灌胃过程中出现呛咳，口鼻有少量泡沫状液体溢出，后抽搐死亡，考虑死亡原因为盐酸灌入气管所致，其余大鼠均未出现此类情况，故此大鼠从C组退出。
2.2 动物情况
实验中四组大鼠精神状态均可，大小便正常。B组、D组大鼠食欲好，每日进食饲料总量增多，4周各组大鼠体重未出现明显差异。
2.3十二指肠黏膜组织学变化
（1）十二指肠黏膜标本肉眼观察
肉眼下黏膜损伤情况：A、B两组十二指肠黏膜光滑，C组十二指肠黏膜充血水肿可见条状糜烂灶，D组十二指肠黏膜充血水肿可见点状糜烂灶。
黏膜损伤评分（Guth标准改良评分）
其中A、B两组损伤评分在统计学上无差异（p>0.05），C、D组两组损伤评分在统计学上均高于A组（p<0.05）、B（p<0.05）两组，D组损伤评分低于C组但无统计学意义。
（2）十二指肠黏膜病理组织学观察
在光学显微镜下观察，A、B两组大鼠十二指肠黏膜上皮细胞排列整齐未见黏膜缺损，C组大鼠黏膜表层上皮脱落，可见上皮细胞坏死，淋巴细胞浸润，腺体结构紊乱。D组大鼠黏膜表层上皮脱落，可见少量淋巴细胞浸润，腺体结构紊乱。
肉眼观察下十二指肠黏膜标本
2.4观察并记录胃窦组织TRPVl、CGRP、SP的表达
TRPVl、CGRP、SP的阳性表达主要位于细胞浆内，染色结果判断标准：深黄色或棕黄色者为强阳性，黄色为阳性，浅黄色为弱阳性，与背景同色者为阴性。
大鼠胃窦区TRPVl、CGRP、SP的评分结果如下表所示：
注：*与A组比较P<0.05，^与C组比较P<0.05。
3.讨论
辣椒是茄科辣椒属植物，果实富含CAP而有辣味。CAP与胃十二指肠黏膜之间的关系一直存在争议，很多人认为食用CAP会对胃十二指肠黏膜造成损伤，CAP对胃十二指肠黏膜的保护性功能在国内研究甚少，故本实验重在研究其保护性。
本研究发现，通过A组与B组对比发现，喂食CAP未对胃十二指肠黏膜造成损伤；通过C组与D组对比下发现，D组大鼠黏膜损伤相对C组的大鼠的黏膜损伤较轻；肉眼下观察标本与光学显微镜下观察可得出此结论。比较喂食有CAP饲料的大鼠与没有喂食有CAP饲料的大鼠胃窦组织TRPVl、CGRP、SP的表达发现，喂食有CAP饲料的大鼠的胃窦组织TRPVl、CGRP、SP的表达高于没有喂食有CAP饲料的大鼠的胃窦组织，可以看出TRPVl、CGRP的高表达可能与预防胃十二指肠黏膜损伤有关，而CAP可能刺激了TRPVl对CGRP的释放；SP是黏膜下和肌间神经元慢兴奋性突触后电位的介质，他可以增强胃肠运动，促进胃排空。实验中，CAP组、盐酸组、CAP+盐酸组SP表达均高于正常组，但CAP组与盐酸组几乎无差异，考虑其原因不仅为CAP，盐酸也可刺激TRPVl释放P物质，有研究显示SP的释放能活化上皮细胞中的神经激肽1受体并产生活性氧，从而损伤胃十二指肠粘膜。因此SP对胃十二指肠粘膜的具体作用有待于进一步实验检验。NO可与前列腺类物质相互作用，维持胃十二指肠粘膜完整性，对各种有害因子导致胃十二指肠粘膜损伤具有保护作用。实验中，CAP组与正常组相比较，CAP+盐酸组与盐酸组相比较，十二指肠组织匀浆NO含量尚不能证明CAP能增加大鼠胃十二指肠粘膜内NO的释放。
本实验观察发现，CAP对盐酸所致的胃十二指肠粘膜急性损伤有一定保护作用，机制可能与CAP促进TRPVl、CGRP的表达有关，所以探讨CAP对消化功能的影响，CAP有无副作用产生等有重要意义。
参考文献：
[1]干红辣椒中辣椒素的提取工艺研究何国菊?李灿?河南农业科学.2013
[2]辣椒素酯类物质研究进展 辛嘉英 王艳 张超越 陈林林 食品科学. 2013
[3]辣椒素提取方法研究进展熊科，夏延斌. 中国食品添加剂. 2007.
[4]粉碎度对辣椒籽成分溶出效果的影响?沈文娇?何新益?冯长禄?刘斌?食品研究与开发?.2018
[5]Neurotransmitter?systems?in?mouse?airways?Peter?W?ABEL??Cameron?M?KIEFFER?Ya-ping?TU??中国药理学与毒理学杂志 .2018
[6]Studies?on?the?synthesis，pungency?and?anti-biofouling?performance?of?capsaicin?analogues Science Chine .2013
[7]The?vanilloid?receptor?and?hypertension Donna H WANG Acta Pharmacologica Sinica 2005
[8]Genetic?variants?involved?in?gallstone?formation?and?capsaicin?metabolism，and?the?risk?of?gallbladder?cancer?in?Chilean?women?Sergio?Báez，Yasuo?Tsuchiya，Alfonso?Calvo，Martha?Pruyas，Kazutoshi?Nakamura，Chikako?Kiyohara，Mari?Oyama，Masaharu?Yamamoto World?J?Gastroenterol?2010
作者简介：林健，1995.09.25，男，湖南永州人，2015级本科针灸推拿2班在校生。
通讯作者：陈英，1987.09，硕士，长沙医学院中医学院针推教研室从事教学工作。
基金项目：长沙医学院2018年校级立项大学生研究性和创新性实验计划项目长医教[2018]77号-132
论文作者:林健1,王茜2,陈英通讯作者
论文发表刊物:《兰大学报（医学版）》2018年6期
论文发表时间:2018/11/21
标签：黏膜论文; 大鼠论文; 盐酸论文; 损伤论文; 辣椒论文; 小鼠论文; 饲料论文; 《兰大学报（医学版）》2018年6期论文;