孟宇宏[1]2004年在《PAR-1与人类肺癌转移关系的研究》文中研究表明确定调控人类肿瘤转移关键基因对发现肿瘤治疗新策略具有重要意义。肿瘤转移过程中存在多种调控因素，它们在不同类型肿瘤中发挥着不同的作用，有的在肿瘤转移中的作用还存在争议，也有一些调控因子被逐渐揭示在肿瘤转移过程中发挥作用。PAR-1是凝血酶的主要受体，是近来发现的可能与肿瘤转移相关的基因。虽然已对PAR-1与肿瘤转移的相关性进行了初步研究，但对其在肿瘤增殖和转移过程中的作用尚未阐明。对PAR-1功能的研究多数是以细胞系为模型的体外实验，对其在人体标本中的实验研究却很少，PAR-1与人类肺癌转移相关性的研究尚未见报告。我们首先以人体肺癌组织和细胞株为研究对象，通过体内及体外实验研究，探讨PAR-1在人类肺癌侵袭、转移过程中的作用及调节的分子机制。 用RT-PCR及免疫组化方法观察PAR-1在人类肺癌组织中的表达。比较肺癌原发灶及部分转移灶中PAR-1的表达情况，结合临床病理资料及形态学定量分析结果，探讨PAR-1表达与肺癌侵袭、转移的关系。结果显示：转移组与非转移组、原发灶与转移灶、以及原发灶与肺组织之间的PAR-1表达存在显着差异；而在肿瘤大小、组织学类型和组织学分化的各组之间差异无显着意义。以上结果提示了PAR-1过度表达与人类肺癌侵袭和转移的相关性。 RT-PCR、Western blot方法检测5个不同类型肺癌细胞株中PAR-1的表达情况，结果显示：PAR-1mRNA和蛋白在肺巨细胞癌细胞株PLA801D(高转移潜能)、PLA801C(低转移潜能)、肺腺癌细胞株Anip973(高转移潜能)、AGZY83-a(低转移潜能)以及肺小细胞癌细胞株NCI-H446中均有不同水平的表达，但在PLA801C和PLA801D中的表达差异最明显。将PAR-1正义和反义真核表达载体分别转染至PLA801C和PLA801D细胞中，筛出稳定转染的细胞株为模型。RT-PCR和Western blot及免疫组化检测稳定转染细胞株中PAR-1的表达变化，结果显示：转染正义和反义PAR-1分别明显上调和下调了PLA801C和PLA801D的PAR-1mRNA和蛋白表达水平。构建了PAR-1正、反义稳定转染细胞模型。 通过MTT比色、软琼脂集落形成、流式细胞仪检测细胞周期、细胞-基质粘附、划痕修复、Transwell细胞运动和Transwell细胞侵袭等一系列细胞学功能实验，观察稳定转染细胞株PAR-1的差异表达对肿瘤细胞增殖、粘附、运动和侵袭的影响。结果显示：转染正义PAR-1对细胞的生长和克隆形成具有促进作用；并可明显增强细胞对细胞外基质的粘附和侵袭能力。相反，转染反义PAR-1对细胞摘要模型的生长和克隆形成具有抑制作用;能明显降低细胞的S期和GZ胭期、升高GO/GI期所占比例;还可使细胞对细胞外基质的粘附力和侵袭力明显降低。表明PAR一1能够影响人肺巨细胞癌高、低转移潜能细胞株PLA一80 ID、C的生长和增殖、粘附和侵袭特性。 通过激光共聚焦显微镜检测细胞内c扩十浓度及westem blot检测转移相关蛋白的表达变化，探讨PAR一1参与肺癌转移相关的机制。结果显示，转染正义PAR一1可导致细胞内游离c扩+存储量增加，同时明显增加凝血酶和凝血酶受体激活肤诱发的细胞内c扩+信号上调的速度和幅度;与此相反，转染反义PAR一1可引起细胞内游离c扩十存储量减少，并抑制凝血酶和凝血酶受体激活肤引发的细胞内c扩+信号上调的幅度。结果还发现转染正义PAR.1可上调VEGF和CD44v6、下调P53在细胞模型中的表达水平;而转染反义PAR一1可降低VEGF和CD44v6并增加P53在细胞模型中的表达水平。以上实验从正反两方面说明了PAR一1参与肺癌转移的机制可能是通过调节细胞内c扩十及某些转移相关基因(如vEGF、CD44v6和P53)的功能来实现的。小结:PAR-1过度表达可能与肺癌的侵袭和转移表型有关;队R一1能够影响人肺巨细胞癌细胞株PLA一80 ID和PLA801C的生长、粘附和侵袭等特性;PAR一1可能通过与细胞内的c扩十和某些肿瘤转移相关的分子(如vEGF、cD44v6和P53)的相互作用而参与肺癌的转移过程。PAR一1可能是人类肺癌侵袭和转移过程中发挥重要作用的因素之一。
孟宇宏, 张金强, 朱彦君, 宁浩勇, 胡明[2]2004年在《肺癌中凝血酶受体-1的表达及意义》文中研究指明目的 分析凝血酶受体 (PAR 1)在肺癌组织及细胞中的表达情况 ,探讨PAR 1与人肺癌生物学行为的关系。方法 采用免疫组织化学、Westernblot及RT PCR方法检测不同类型肺癌组织及细胞系中PAR 1的表达情况。结果 免疫组化S P法检测PAR 1在 5 2例肺癌组织中表达情况分别为 :腺癌 14 / 2 0例、鳞癌 6 / 16例、大细胞癌 6 / 10例、小细胞癌中 4 / 6例。免疫组化阳性细胞多位于癌巢周边 ,1例侵及支气管软骨处的鳞癌癌巢及另 1例低分化腺癌脉管内的癌栓呈明显阳性 ,1例腺癌组织周围的肺泡上皮不典型增生灶呈明显阳性。Westernblot及RT PCR方法检测结果均显示PAR 1在人肺巨细胞癌细胞系高转移株 (PLA80 1D)中的高表达明显高于其低转移株 (PLA80 1C)。结论 PAR 1在各种组织类型的人肺癌组织中均有不同比例表达。PAR 1在人肺巨细胞癌细胞系高转移株 (PLA80 1D)中的表达明显高于其低转移株 (PLA80 1C)。PAR 1表达可能与肺癌的恶性表型及生物学行为有关
杨丽敏[3]2014年在《EPCR基因6936A/G多态性及血浆sEPCR、sTM与肺癌相关性研究》文中进行了进一步梳理目的:探讨肺癌患者血浆可溶性内皮细胞蛋白C受体（soluble endothelial protein Creceptor, sEPCR）和可溶性血栓调节蛋白（soluble thrombomodulin, sTM）的浓度与肺癌病情及血凝异常的关系；并分析EPCR6936A/G多态性与血浆sEPCR浓度及发生肺癌或合并血栓栓塞症之间的关联性，以了解EPCR在肺癌合并血栓形成中的意义。方法:（1）采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测132例原发性肺癌患者、44例健康体检者血浆中sEPCR及sTM的浓度。（2）采用PCR-RFLP（限制性片段多态性聚合酶链反应）技术检测分析EPCR基因第6936位点的多态性。结果：1. sEPCR检测结果：①132例肺癌患者血浆sEPCR浓度较健康对照组升高（102.30±29.69ng/ml vs93.54±24.98ng/ml, P=0.080），但尚未达显着统计学差异。②69例晚期肺癌患者血浆sEPCR浓度（109.72±33.14ng/ml）显着升高，与44例健康对照组（93.54±24.98ng/ml）相比P=0.007<0.01，与63例早中期肺癌组（94.16±23.01ng/ml）相比P=0.002<0.01,差异具有显着统计学意义。③25例肺癌合并血栓倾向患者（以下简称为血栓倾向组）的血浆sEPCR浓度显着高于健康对照组（117.75±32.48ng/ml vs93.54±24.98ng/ml），P=0.001<0.01。④各不同肺癌组织学类型之间血浆sEPCR浓度无统计学差异。2.血浆sTM检测结果：①132例肺癌患者血浆sTM浓度较健康对照组升高（20.36±6.07ng/ml vs18.64±5.09ng/ml, P=0.091）,但尚未达显着统计学差异。②69例晚期肺癌患者血浆sTM浓度（22.05±6.57ng/ml）显着升高，与健康对照组（18.64±5.09ng/ml）相比P=0.004<0.01，与早中期肺癌组（18.52±4.89ng/ml）相比P=0.001<0.01，差异均具有显着统计学意义。③25例血栓倾向组的血浆sTM浓度较健康对照组（23.48±6.14ng/ml vs18.64±5.09ng/ml）明显升高（P=0.001<0.01）。④各不同肺癌组织学类型之间sTM浓度无统计学差异。3.132例肺癌患者血浆sEPCR浓度与EPCR6936（AG+GG）相关： P=0.001， OR=1.024，95%CI[1.010-1.039]，说明肺癌患者高水平的血浆sEPCR浓度与EPCR6936（AG+GG）基因型相关。4.肺癌组EPCR6936（AG+GG）基因型频率（28.0%vs19.4%,χ2=2.336, P=0.126>0.05）、等位基因（G）频率（14.4%vs10.2%, χ2=1.859, P=0.173>0.05）均高于健康对照组，尚未达显着性统计学差异。5.血栓倾向组EPCR6936（AG+GG）基因型频率（40.0%vs19.4%, χ2=4.749, P=0.029<0.05）、G等位基因频率（22%vs10.2%, χ2=5.127, P=0.024<0.05）均高于健康对照组，差异均具有统计学意义。结论：肺癌患者血浆sEPCR和sTM浓度较健康对照组有升高趋势，晚期肺癌组显着高于健康对照组及早中期肺癌组，合并血栓倾向的肺癌组表现出更高水平的血浆sEPCR和sTM浓度，提示血浆sEPCR和sTM浓度升高可能与血凝异常及肺癌病情变化相关；肺癌患者EPCR6936（AG+GG）基因型（或等位基因G）与高水平的血浆sEPCR浓度相关；肺癌组EPCR6936（AG+GG）基因型频率及等位基因（G）频率均高于健康对照组，但尚未达显着统计学差异；合并血栓倾向的肺癌组EPCR6936（AG+GG）基因型频率及G等位基因频率较健康对照组均明显升高，具有显着的统计学差异。肺癌患者高水平的血浆sEPCR浓度、EPCR6936等位基因G及并发血栓事件叁者之间可能具有一定的关联性。
吴婕[4]2010年在《凝血酶及其受体PAR1促进肺癌发生发展的作用和机制研究》文中进行了进一步梳理凝血酶是凝血系统中重要因子,位于外源性和内源性凝血途径的共同通路中,在凝血系统的激活中处于关键和核心位置。已有研究表明,凝血酶也是肿瘤发生发展过程中的重要因子。凝血酶受体PAR1-蛋白酶活化受体1(protease-activated receptor 1)是其最重要的受体,介导了凝血酶促进肿瘤血管生成、侵袭转移、生长等重要过程。本课题以肺癌细胞为研究对象,观察凝血酶及其受体促进肺癌发生和发展的作用并探讨其可能的机制。我们首先观察了凝血酶在体内对肺癌发生发展的促进作用。凝血酶可以显着促进小鼠Lewis肺癌的生长,与对照组相比,凝血酶组(0.5U/只、1U/只)瘤重增长率分别为37%、30%,差异显着(p <0.05,p <0.01)。凝血酶抑制剂:新型凝血酶抑制剂(NTH)和水蛭素可以抑制Lewis肺癌的生长,降低其生长速度;同时,新型凝血酶抑制剂和水蛭素可以显着抑制Lewis肺癌的肺转移,与对照组相比,其中新型凝血酶抑制剂组的肺重(0.143g)显着低于对照组(0.185g)(p < 0.05),新型凝血酶抑制剂组的肺结节数(9.2个)显着少于对照组(17.5个)(p < 0.05)。病理切片同样可见,凝血酶抑制剂可抑制肿瘤的侵袭转移。并且,至实验结束时,水蛭素组的动物大部分死亡,2.5mg/kg水蛭素组七只动物死亡四只,而5mg/kg水蛭素组动物只有一只存活,而新型凝血酶抑制剂组八只动物仅一只死亡,且从死亡动物解剖结果来看,水蛭素组动物腹腔内大量出血,这可能是动物死亡主要原因,而新型凝血酶抑制剂组动物未见体内有明显的出血,说明其出血副作用已大大降低。在Glc-82移植瘤实验观察到,凝血酶可降低荷瘤小鼠的体重、增加瘤重占体重比、部分凝血酶组小鼠肺转移增多、荷瘤鼠的生存时间缩短;Western印迹结果显示,凝血酶可促进肿瘤组织ERK的激活,促进FAK的表达,并且抑制抑癌蛋白PTEN的表达。体内实验结果显示,凝血酶可以促进肺癌的发展。我们进一步探讨了凝血酶在体外促进肺癌细胞侵袭转移的作用机制。细胞粘附实验观察到液态环境中的凝血酶没有显着促进肺癌细胞Glc-82及PLA-801D粘附至细胞外基质的作用,但可以激活整合素。包被的凝血酶可以促进肺癌细胞Glc-82、PLA-801D的粘附特性,将凝血酶的天然抑制剂水蛭素(抑制凝血酶的催化结构域)与凝血酶共孵育后包被于细胞培养板,凝血酶的促粘附作用被抑制,而先将凝血酶进行包被,然后加入水蛭素则不能抑制此促粘附作用,该结果提示包被的凝血酶可能发生了空间构象的变化,其促肿瘤细胞粘附作用不依赖于其催化结构域;我们还观察到PAR1抗体及整合素αⅤ的抗体不抑制包被凝血酶的促粘附进作用,但是含RGD序列的整合素配体竞争性抑制多肽GRGDS可以拮抗此促进作用,说明在此促粘附作用中有整合素的参与,但可能是除了整合素αⅤ之外的其它整合素。Western印记实验结果也观察到包被的凝血酶可以激活整合素,此激活作用可以被GRGDS所抑制,以上结果提示我们,包被的凝血酶可能通过构象改变暴露出RGD序列激活整合素,从而促进肺癌细胞的粘附,但是激活的整合素可能是αⅤ之外的亚型。凝血酶受体激动多肽可以促进肺癌细胞粘附至细胞外基质,并且可以激活整合素,而且整合素αⅤ抗体及GRGDS可以抑制此激活作用。细胞免疫荧光共聚焦实验没有观察到凝血酶及PAR1激动多肽引起PAR1和整合素αⅤ的共定位。我们还观察了凝血酶PAR1受体表达情况与肿瘤干细胞的关系,以期探讨凝血酶可否通过肿瘤干细胞促进肺癌的发展。实验结果可见,PLA-801D细胞对鼠尾胶原和纤黏连蛋白的粘附作用均明显强于PLA-801C细胞(p < 0.01)。PLA-801D细胞迁移能力明显强于PLA-801C细胞(p < 0.01)。PLA-801D细胞PAR1的表达是PLA-801C细胞的3.41倍。在单细胞克隆形成实验中,PLA-801D可产生4种单细胞克隆,其中1种在传单细胞亚克隆后仍可形成如上4种克隆,而PLA-801C细胞只能形成3种单细胞克隆,且未发现有完全分化能力的细胞克隆。PLA-801D细胞的生物力学重塑能力也明显高于PLA-801C细胞(p < 0.05)。为探讨凝血酶及其受体PAR1在促肿瘤进程中的作用,我们构建了PAR1的真核表达载体,并包装了带有PAR1基因的腺病毒;同时构建了携带PAR1干涉片段的表达载体,为后续的研究工作奠定基础。结论:凝血酶促进Lewis肺癌的生长、促进肺癌Glc-82移植瘤的恶性进展,而凝血酶抑制剂抑制Lewis肺癌的生长,并显着抑制Lewis肺癌的侵袭转移,表明凝血酶可促进Lewis肺癌的生长和侵袭转移,并且凝血酶新型抑制剂的出血副作用比水蛭素大为降低。凝血酶促进肿瘤细胞粘附特性的研究表明,包被的凝血酶可能通过构象改变暴露RGD序列,借此序列激活整合素,从而促进肺癌细胞Glc-82、PLA-801D的粘附。液态环境下的凝血酶未见有明显的促细胞粘附作用,但可以激活整合素,其作用方式仍需更多地实验工作来探明。PAR1激动多肽可以促进肺癌细胞Glc-82、PLA-801D对细胞外基质的粘附,并可能通过细胞内途径激活整合素,并有整合素αⅤ亚型的参与。这些实验结果说明PAR1和整合素均参与了凝血酶的促肿瘤转移过程,凝血酶在不同的状态下可能通过不同的方式激活PAR1和整合素。具有高转移潜能的PLA-801D细胞PAR1的表达高于PLA-801C细胞,并且含有一小群具有自我更新和分化能力的肿瘤干细胞,且该细胞株的生物力学重塑性较好,提示该细胞株对细胞外基质的重塑性能较强,但PAR1的表达与肿瘤干细胞的关系,及凝血酶与肿瘤干细胞的关系仍需进一步研究。构建了PAR1的真核表达载体,包装了带有PAR1基因的重组腺病毒,构建了携带PAR1干涉序列的表达载体,建立了PAR1稳定下调的PLA-801D细胞株。
陈伟庄[5]2013年在《AFB联合MAPK1等血浆标志物在肺癌诊断的研究》文中研究说明第一部分肺癌患者丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1/ERK2）表达水平及临床意义目的检测肺癌患者血浆中丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1/ERK2）表达水平及探讨其与肺癌类型、临床分期、TNM分期、气道受累及临床常用标志物的关系。方法用ELISA法分别检测肺癌组（n=78），良性肺部疾病组（n=27），健康对照组（n=14）血浆中MAPK1/ERK2的水平含量。结果肺癌患者血浆中MAPK1/ERK2的含量高于良性肺部疾病组和健康对照组（p<0.05），良性肺部疾病组高于健康对照组（p<0.05）。肺癌患者血浆中MAPK1/ERK2的表达与性别，年龄，吸烟状况，肿瘤病理类型，临床分期，TNM分期、气道受累无显着性差异，与临床常用标志物（CEA、NSE、CYERA21、SCC）无相关性。第二部分荧光气管镜联合肿瘤标志物在肺癌诊断中的价值目的研究荧光气管镜联合肿瘤标志物对肺癌的诊断价值。方法对我院2012年4月至2012年10月住院期间78例疑似肺癌的患者行白光气管检查，对117例疑似肺癌的患者行荧光支气管镜检查和血浆肿瘤标志物检测。结果白光气管镜的敏感度为44.1%，特异度为78.9%。血浆肿瘤标志物的敏感度为60.8%，特异度为75%。荧光支气管镜的敏感度为61.3%，特异度为65.8%。联合检测的敏感度为82.4%，特异度为47.2%。荧光气管镜的敏感度高于白光气管镜，差异有统计学意义（p=0.047）。联合检测敏感度均高于单一检测有统计学差异（p<0.005）。结论1. MAPK1/ERK2对肺癌的辅助诊断有一定的临床价值，可作为一项新的肺癌生物标志物应用。2.对临床疑似肺癌的患者提倡行荧光支气管镜检查及血浆肿瘤标志物检测，提高肺癌诊断。
孟宇宏, 虞积耀, 张金强, 路平, 宁浩勇[6]2007年在《蛋白酶激活受体-1促进肺癌细胞侵袭和转移功能的研究》文中研究说明目的研究蛋白酶激活受体1(PAR-1)对人类肺癌细胞侵袭和转移功能的影响。方法采用阳离子脂质体介导法,将正义和反义 PAR-1重组质粒"pC/PARls"和"pC/PARlas"分别转染至人肺巨细胞癌低转移株(PLA801C)和高转移株(PLA801D)细胞中;采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和 Western 印迹检测转染后 PAR-1基因和蛋白表达水平变化;通过 MTT、软琼脂集落形成、流式细胞仪、细胞-基质黏附和 Transwell 细胞侵袭实验检测 PAR-1对肺癌细胞转移相关功能的影响。结果转染正义和反义 PAR-1分别明显上调和下调了 PLA801C 和 PLA801D 的 PAR-1mRNA 和蛋白表达水平。转染正义 PAR-1对细胞的生长和克隆形成具有促进作用;并可明显增强细胞对细胞外基质的黏附和侵袭能力(与空载体对照组比较均 P<0.01)。相反,转染反义 PAR-1对细胞模型的生长和克隆形成具有抑制作用;能明显降低细胞的 S 期和 G_2/M 期(与空载体对照组比较分别为 P<0.05、0.01)、升高 G_1/G_1期所占比例(P<0.01);还可使细胞对细胞外基质的黏附力(P<0.05)和侵袭力明显降低(P<0.01)。结论正义和反义 PAR-1基因能够分别上调和下调 PAR-1的表达水平;PAR-1能够影响肺癌细胞的生长和增殖、黏附和侵袭特性。抑制 PAR-1的表达可能是一种治疗肺癌的途径。
皮国良[7]2008年在《蛋白酶活化受体１在鼻咽癌中的表达及意义的实验研究》文中提出目的检测PAR1 (protease-activated receptor-1)在鼻咽癌中的表达,探讨PAR1在鼻咽癌中表达的意义。方法用免疫组织化学S-P(Streptavidin-biotin peroxidase method)方法半定量检测28例良性鼻咽组织、61例鼻咽癌组织中PAR1的表达,分析鼻咽癌中PAR1的表达与VEGF(vascular endothelial growth factor)、MMP1(matrix metalloprotease-1)的表达相关性,并分析PAR1在鼻咽癌中表达与患者临床资料的相关性;采用RT-PCR和Western blot技术检测鼻咽癌高分化鳞状细胞株CNE-1、鼻咽癌低分化细胞株CNE-2中PAR1的mRNA和蛋白质的表达水平并比较其在两种不同恶性程度细胞株中的表达差异。结果PAR1在鼻咽癌组织及两种鼻咽癌细胞株中均有表达。高度恶性的鼻咽癌细胞株CNE-2中PAR1的表达明显高于其在低度恶性的鼻咽癌细胞株CNE-1中的表达。PAR1在28例良性鼻咽组织表达为10例,61例鼻咽癌组织中表达48例。PAR1在鼻咽癌组织中的表达率明显高于在良性鼻咽组织中的表达率(P<0.01)。61例鼻咽癌活检组织的免疫组化结果中,PAR1、VEGF、MMP1的阳性表达率分别为78.7%(48/61)、59.0%(41/61)、77.0%(47/61)。PAR1在鼻咽癌组织中的表达与VEGF在鼻咽癌中的表达正相关(r=0.539,P=0.001),PAR1在鼻咽癌组织中的表达与MMP1在鼻咽癌中的表达无明显相关(r=0.186,P=0.052)。PAR1在鼻咽癌中的表达与鼻咽癌患者癌细胞的浸润性生长方式、局部淋巴结转移、TNM分期晚等指标相关(P<0.05),而与患者的年龄、性别、肿瘤原发灶T分期早晚无明显相关(P>0.05)。结论实验得出PAR1在人鼻咽癌中的高表达与人鼻咽癌的发生、侵袭性生长方式、较晚的临床分期、恶性生物学行为等相关。PAR1在人鼻咽癌中的表达可能介导鼻咽癌侵袭转移等恶性生物学行为,其具体机制尚待进一步深入研究。
唐春兰[8]2013年在《SHP2在顺铂诱导的肺癌多药耐药中的作用及其分子机制的初步研究》文中研究表明背景与目的肺癌是世界上发病率最高的恶性肿瘤，化疗是治疗肺癌的主要手段之一，尽管对肺癌的化疗取得了一定进展，但过去25年其5年生存率仍未见显着提高，约为15%，而多药耐药(MDR)是肺癌化疗失败的主要原因之一。在肺癌化疗中，顺铂(CDDP)是有效并广泛应用的一线药物，但由于耐药问题的存在使其疗效不尽如人意。顺铂是一种细胞周期非特异性的细胞毒药物，目前认为抗癌细胞凋亡、损伤修复过程中DNA剪切物的增加、与调控信号通路相关的调节蛋白表达的改变、药物摄取减少导致细胞内CDDP浓度降低等均可能与顺铂的耐药有关，然而肺癌细胞对其耐药的机制尚未完全阐明。因此，进一步研究顺铂的耐药机制和寻找新的逆转耐药靶点对于改善肺癌化疗效果提高5年生存率具有重要意义。抗细胞凋亡是顺铂耐药的主要机制之一，而PI3K/AKT通路是最主要的抗凋亡通路。我们前期研究发现AKT1的过表达和基因扩增与肺癌细胞对顺铂耐药密切相关，抑制AKT1的表达可以逆转A549/CDDP对顺铂的耐药，反之，激活AKT1则可增强肺癌细胞对CDDP的耐受；采用PI3K的抑制剂LY294002能显着抑制AKT1的表达并增强耐药细胞A549/CDDP对顺铂的敏感性。Ras基因位于PI3K/AKT通路的上游，既往研究表明调控Ras有关的上游调控分子如EGFR、HER2、Grb2、鸟苷酸交换因子(GEF，如SOS1)等均为SHP2作用的底物，一方面，SHP2通过与上述底物结合激活Ras；另一方面，SHP2通过与RasGAP结合阻止GTP酶对Ras-GTP的水解延长RAS-GTP的半衰期，从而使下游信号通路包括PI3K/AKT通路处于持续激活状态。同时，我们前期在乳腺癌的研究中发现，抑制SHP2表达的同时也可以抑制AKT的表达，最近的研究又表明顺铂可以选择性的活化SHP2，因此我们推测SHP2可能是一新的肺癌顺铂耐药相关蛋白，其机制是通过Ras调控PI3K/AKT信号通路实现的。SHP2是一种含有两个Src同源结构域(Src homology-2，SH2)的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)，是PTP超家族中第一个原癌基因PTPN11编码的蛋白产物。蛋白酪氨酸磷酸化在细胞信号转导过程中具有重要作用，酪氨酸磷酸化水平受控于蛋白酪氨酸激酶(PTK)及PTP，二者的失衡会导致异常的酪氨酸磷酸化，而异常的酪氨酸磷酸化与人类多种疾病包括癌症密切相关。研究表明，SHP2的活化突变或持续激活是青少年粒-单核细胞性白血病、髓细胞性白血病、慢性粒-单核细胞性白血病的病因，它也参与了幽门螺旋杆菌相关胃癌的发生，在胃癌、乳腺癌中也有SHP2的高表达，但目前SHP2与癌症关系的研究主要集中在癌症发生及癌细胞生长、侵袭、迁移、转化方面，尚未发现SHP2与肺癌顺铂耐药的相关研究报道。本课题拟通过组织芯片和免疫组织/细胞化学技术，首先检测SHP2在人肺癌中的表达情况；然后以顺铂诱导的小细胞肺癌MDR细胞H446/CDDP及其亲代细胞H446为研究对象，利用基因克隆及RNA干扰技术，构建SHP2慢病毒表达或干扰载体，在增强H446细胞中SHP2的表达或下调H446/CDDP细胞中SHP2的表达的情况下，分别观察在加入顺铂前后细胞生物学行为及对顺铂耐药的变化，了解SHP2是否与肺癌顺铂耐药有关；最后，在初步证实SHP2是一新的肺癌顺铂耐药相关蛋白的前提下，检测Ras干扰前后各组细胞SHP2、Ras、AKT1、pAKT1及survivin蛋白表达情况，初步阐明SHP2影响肺癌顺铂耐药的分子机制。方法1、应用组织芯片及免疫组织/细胞化学技术，检测SHP2在人肺癌组织、小细胞肺癌细胞H446及肺腺癌细胞SPC-A-1的亲代及顺铂诱导的MDR细胞中的表达；2、应用基因克隆及RNA干扰技术，构建SHP2慢病毒表达载体及干扰载体，293FT细胞慢病毒包装，收集病毒后用于感染H446及H446/CDDP细胞，采用嘌呤霉素浓度筛选获取稳定高表达SHP2的H446细胞(H446-SHP2-WT)及持续抑制SHP2表达的H446/CDDP细胞(H446/CDDP-SHP2-shRNA)，并用RT-PCR及Western blot进行鉴定；3、应用CCK-8法检测筛选细胞对顺铂的敏感性，并在加入顺铂前后观察各组细胞生长曲线的变化；4、应用流式细胞仪检测各组细胞在加入顺铂前后细胞周期及凋亡的改变；5、应用Western blot及RNA干扰技术，观察Ras RNA干扰前后各组细胞SHP2、Ras、AKT1、pAKT1、survivin的表达情况。结果1、SHP2在80例NSCLC组织中有较高阳性表达率[70.00%(56/80)]，SHP2在小细胞肺癌细胞H446及肺腺癌细胞SPC-A-1的亲代及顺铂诱导的MDR细胞中均呈阳性表达；2、成功构建了SHP2慢病毒表达载体及干扰载体，筛选出了稳定高表达SHP2的H446细胞(H446-SHP2-WT)及持续抑制SHP2表达的H446/CDDP细胞(H446/CDDP-SHP2-shRNA)；3、H446-SHP2-WT-空载、H446-SHP2-WT对顺铂IC50值分别为1.01μg/ml、1.218μg/ml，耐药指数为1.206， H446-SHP2-WT对顺铂的耐受性增强20.6%；H446/CDDP-SHP2-shRNA、H446/CDDP-SHP2-shRNA-空载对顺铂的IC50值分别为4.382μg/ml、11.92μg/ml，耐药指数为2.72，H446/CDDP-SHP2-shRNA对顺铂的耐药逆转率为63.2%，表明增加SHP2的表达可降低H446细胞对顺铂的敏感性，而抑制SHP2的表达可逆转H446/CDDP细胞对顺铂的耐受，初步证实SHP2是一新的肺癌顺铂耐药相关蛋白；4、 H446-SHP2-WT细胞在加入顺铂后细胞生长受抑制程度弱于H446及H446-SHP2-WT-空载组，第2天及第3天明显(p＜0.05)，而H446/CDDP-SHP2-shRNA细胞在加入顺铂后细胞生长受抑制程度强于H446/CDDP及H446/CDDP-SHP2-shRNA-空载组，第3天以后明显(p＜0.05)；流式细胞仪检测发现加入顺铂后可使各组细胞停留在S期的细胞比例显着增加，H446-SHP2-WT细胞在顺铂作用条件下凋亡细胞比例减少(34.56%vs49.43%)，而H446/CDDP-SHP2-shRNA细胞在顺铂作用条件下凋亡细胞比例明显增加(16.75%vs6.60%)。上述结果进一步证实SHP2为一新的肺癌顺铂耐药相关蛋白，其对顺铂耐药的影响可能与其调控肺癌细胞的凋亡有关；5、亲代细胞H446及顺铂诱导的MDR细胞H446/CDDP的SHP2蛋白表达无明显差异，但MDR细胞H446/CDDP的SHP2活性明显高于亲代细胞H446(OD值分别为0.488±0.015和0.249±0.011，p＜0.05)，表明H446/CDDP细胞对顺铂的耐药性还与SHP2的活性增加有关；6、H446/CDDP、H446/CDDP-SHP2-shRNA-空载的Ras、AKT1、pAKT1、survivin的表达高于亲代细胞H446； H446/CDDP、 H446/CDDP-SHP2-shRNA-空载、H446/CDDP-SHP2-shRNA细胞Ras、AKT1、pAKT1、survivin表达变化情况与SHP2变化情况一致，抑制SHP2的表达可下调Ras、AKT1、pAKT1、survivin的表达，提示SHP2可能是Ras、AKT1、survivin的上游调控因子，并在PI3K/AKT1通路中具有正向调节作用；SHP2表达未抑制的H446、H446/CDDP、H446/CDDP-SHP2-shRNA-空载细胞加入顺铂后pAKT1、survivin的表达增加，而SHP2表达抑制的H446/CDDP-SHP2-shRNA细胞加入顺铂前后pAKT1、survivin表达无明显变化，提示顺铂可能活化SHP2并通过SHP2/Ras/PI3K/AKT1/survivin抑制细胞的凋亡而参与耐药；7、在顺铂作用条件下，H446、H446-SHP2-WT、H446/CDDP Ras RNA干扰组Ras表达下降，而SHP2表达无明显变化，提示SHP2位于Ras的上游；同时发现AKT1及pAKT1在H446-SHP2-WT及H446/CDDP Ras RNA干扰组的表达增高，提示活化的SHP2不仅仅通过Ras调控PI3K/AKT1通路影响细胞的凋亡参与肺癌的耐药，可能还存在其他的补偿途径增加AKT1及pAKT1的表达。结论1、SHP2在人肺癌中具有高表达率；2、SHP2是一新的肺癌顺铂耐药相关蛋白，其对肺癌顺铂耐药的影响既与其表达水平有关，也与其活性有关；3、SHP2对肺癌顺铂耐药的影响与其调控肺癌细胞的凋亡有关，其机制之一是SHP2作为Ras的上游调控分子通过SHP2/Ras/PI3K/AKT1/survivin信号通路抑制细胞凋亡实现的，并且SHP2在此通路中具有正向调节作用。
辛士珍[9]2012年在《非小细胞肺癌血小板、P-选择素、组织因子、D-Dimer与血栓事件及预后的相关性研究》文中进行了进一步梳理目的：检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者血液中血小板(platelet,PLT)、D-二聚体(D-Dimer, DD)、P-选择素(P-selectin,PS)与组织因子(tissue factor, TF)水平,探讨血小板、D-Dimer、P-选择素、TF对NSCLC血栓事件、生存期和预后的影响,及P-选择素、TF与血小板、D-Dimer之间的相关性,同时观察同一患者化疗／手术干预后,血小板、D-Dimer、P-选择素与TF水平变化,探讨临床干预对NSCLC患者血小板、D-Dimer、P-选择素及TF水平的影响。方法：1、随机选取2008年1月至2011年10月于天津医科大学总医院肺外科和肿瘤内科住院的,病理证实符合2004年WHO肺部肿瘤组织学分类的117例初诊的原发性NSCLC患者为肺癌组,经化疗2周期后／术后1月为肺癌治疗组,采用激光鞘流技术及光检测器检测血常规,采用凝固法及免疫比浊法检测凝血功能、采用酶联免疫吸附试验方法检测肿瘤标志物水平、采用分光光度法检测肝肾功能的变化,并记录治疗前后的TNM分期、病理类型、影像学资料、化疗方案及合并症情况,随访生存期及血栓事件发生情况。2、由117例NSCLC患者中随机选取29例为肺癌组※、经化疗2周期后／术后1月为肺癌治疗组※、同期健康体检人员30例为正常对照组,采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)方法测定其血浆PS及TF水平。结果：1、117例患者血小板、D-Dimer水平与NSCLC的关系：(1)患者的年龄为36-77岁,平均年龄59.05岁,其中男性81例(69.23%),女性36例(30.78%),男女比2.25：1；吸烟者58例(49.57%),吸烟指数均数为325.85年／支,血小板、D-Dimer水平与性别、年龄、吸烟之间无相关性(P>0.05)；截止随访结束时34例(29.06%)患者死亡,其中I期+II期4例(11.76%),III期5例(14.71%),IV期25例(73.53%),腺癌20例(58.82%),鳞癌10例(29.41%),大细胞癌2例(5.88%),腺鳞癌2例(5.88%),34例中11例合并血栓事件(32.35%)。(2)腺癌组、鳞癌组、大细胞癌组、腺鳞癌组血小板计数分别为(242.64±89.91)×109／L、(275.96±94.11)×109／L、(271.63±87.77)×109／L、(200.00±71.13)×109／L；D-Dimer计数分别为(322.04±597.10)μg／L、(306.081405.96),μg／L、(104.63±82.31)μg／L、(139.00±45.88)μg／L,各组间差异均无统计学意义(P>0.05)。(3)血小板计数分别为I期+II期(237.34±64.91)×109／L、III期(264.08±114.00)×109／L、IV期(265.09±89.48)×109／L,血小板计数随TNM分期增加而增加,但差异无统计学意义(P>0.05)；D-Dimer水平分别为I期+II期(216.74±216.54)μg／L、III期(292.36±516.09)μg／L、IV期(358.73±606.58)μg/L, D-Dime水平随TNM分期增加而升高,但差异无统计学意义(P>0.05)。(4)117例患者中,发生血栓事件19例(16.24%),其中肺栓塞12例(11.11%),下肢深静脉栓塞5例(4.27%),2例同时合并肺栓塞及下肢深静脉栓塞(1.71%)；PLT在血栓组及无血栓组的计数分别为(311.05±112.04)×109／L、(247.64±85.59)×109／L,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05),D-Dimer水平在血栓组及无血栓组的分别为(1066.67±1674.32)μg／L、(267.09±384.25)μg／L,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。(5)血小板增多组生存期(25.69±4.40)月较不增多组生存期(40.45±4.56)月明显缩短,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05),；D-Dimer增高组生存期(18.03±2.32)月较不增高组生存期(39.05±3.76)月明显缩短,两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；血栓组生存期(18.22±4.23)月较无血栓组(41.65±4.11)月生存期明显缩短(P<0.05)。(6)经COX风险模型筛选,初诊时血小板增多、D-Dimer水平高、TNM分期晚、分化程度低、低白蛋白血症、合并血栓事件等是预后差的独立危险因素。(7)肺癌组血小板计数(261.64±53.13)×109／L高于肺癌治疗组(236.29±72.26)×109／L,治疗后血小板计数可下降,但两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；肺癌组D-Dimer水平(291.83±88.23)μg／L高于肺癌治疗组(290.79±64.28)μg／L,治疗后D-Dimer水平下降,但两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。2、29例肺癌患者的P-选择素、TF水平对血栓事件、生存期及预后的影响(1)P-选择素水平在肺癌组※(114.25±11.13)ng／ml显着高于肺癌治疗组(21.69±2.26)ng／ml和健康对照组(21.56±2.32)ng／ml(P<0.05)；肺癌治疗组※和对照组※比较无显着性差异(P>0.05)；TF水平在肺癌组。※(1143.12±212.46)pg／ml显着高于肺癌治疗组※(635.65±159.40)pg／ml和健康对照组(609.25±186.59)pg／m(P<0.05)；肺癌治疗组※和对照组比较无显着性差异(P>0.05)。(2)29例患者中,发生血栓事件5例(17.24%)其中肺栓塞2例(6.90%),下肢深静脉栓塞3例(10.34%)。PS水平在血栓组(128.49±8.18)pg／ml较无血栓组(112.62±10.31)pg／ml升高,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)；TF水平在血栓组(1458.00±164.35)ng／ml较无血栓组(1106.79±187.42)ng／ml升高,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。(3)随访截止至2012年5月5日,29例患者中17例(58.62%)患者死亡,中位生存期为19.92月(1-25.5月),TF增高组与明显增高组的中位生存期分别为(25.00±2.58)月和(12.00±3.77)月,；两组之间生存率的差异有统计学意义(P<0.05)；PS增高组与明显增高组的中位生存期分别为(22.40±4.16)月和(15.00±8.17)月,两组之间生存率的差异无统计学意义(P>0.05),中位生存期为19.92月(16.74-23.11)。(4)血小板与P-选择素水平呈正相关(P<0.05),血小板与TF水平亦呈正相关(P<0.05)；D-Dimer水平与PS水平无关(P>0.05),与TF水平亦无关(P>0.05)。结论：1、血小板、D-Dimer水平与性别、年龄、吸烟无关。2、血小板、D-Dimer水平在各病理类型、TNM分期间分布无显着差异,但血小板、D-Dimer水平随TNM分期增加而升高,提示血小板、D-Dimer水平可能与肺癌分期、浸润、转移有关。3、相比于血小板、D-Dimer水平不升高者,血小板、D-Dimer水平升高者更易发生血栓事件。4、血小板增多、合并血栓事件的NSCLC患者生存期较短；5、血小板增多、D-Dimer水平升高、血栓事件可以作为预测NSCLC患者预后差的独立危险因素。5、临床干预可降低血小板、D-Dimer水平。6、P-选择素、组织因子水平升高的NSCLC患者预后较差、生存期较短,易发生血栓事件,临床干预可以显着降低P-选择素、组织因子水平。7、P-选择素、组织因子水平与血小板计数相关,与D-Dimer水平无关。
魏汉平[10]2009年在《组织因子在肾癌中的表达及其临床意义》文中认为目的:检测肾癌组织、癌旁正常肾组织中组织因子蛋白的表达,以了解组织因子蛋白与肾癌发生发展的关系及其在肾癌治疗方面的临床应用价值。方法:运用免疫组织化学MaxVision?法分别检测30例肾癌组织及15例作为对照的癌旁正常肾组织中组织因子蛋白的表达情况,并相互比较结果进行分析。结果:组织因子在肾癌组织中的表达率90%(30例肾癌组织中有27例表达阳性)显着高于在癌旁正常组织中的表达率13.3%(15例癌旁正常肾组织中有2例表达阳性)。组织因子在肾癌及癌旁正常肾组织中的表达有显着性差异,具有统计学意义。结论:组织因子与肾癌的发生、发展可能具有密切关系。根据组织因子蛋白在肾癌及癌旁正常肾组织中表达的差异,临床上可能能够利用组织因子蛋白对肾癌进行诊断和肿瘤靶向治疗。它可能在肾癌的治疗方面具有一定的临床价值。
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