1湖北省十堰市人民医院 湖北省 十堰市 442000
2昆明医科大学第一附属医院 云南 昆明 650032
本研究受云南省应用基础研究资助，项目编号：2014FB042
作者简介：王天宝（1985-），男，硕士，十堰市人民医院。
通讯作者：刘孝东，硕士生导师，副教授，昆明医科大学第一附属医院。
【摘要】目的：探讨盐酸阿米洛利对膀胱cajal样间质细胞（interstitial cells of Cajal ，ICCs）细胞内Ca2+波动的影响。方法：体外分离并培养SD大鼠膀胱ICCs细胞，膀胱ICCs细胞爬片成功后，将待实验细胞爬片分为：50μmol/L和100μmol/L的阿米洛利溶液孵育组、空白对照组采取PBS溶液孵育。在显微镜下随机选取20个与周围细胞无接触、孤立存在的膀胱ICCs细胞，采用Fluo-3-AM孵育后在激光扫描共聚焦显微镜下检测各组膀胱ICCs细胞内Ca2+波动情况。结果 : 50μmol/L阿米洛利处理组，膀胱ICCs细胞内Ca2＋波动较孵育前有所频率减慢但经统计学检验无统计学意义（P＞0.05），但Ca2＋波动振幅明显较前变小，有统计学意义（P<0.01）；100μmol/L阿米洛利处理组的膀胱ICCs细胞内Ca2＋波动频率和振幅下调显著(P<0.01)，而对照组前后变化无统计学意义（P＞0.05）。结论：阿米洛利可以降低膀胱ICCs细胞内Ca2＋波动频率和振幅。
【关键词】膀胱；间质细胞；阿米洛利；钙离子波动
【中图分类号】R473【文献标识码】A【文章编号】1001-5213(2016)08-0414-02
膀胱是一种介于自主神经和非自主神经支配的一种特殊的空腔脏器[1]。传统观点认为：膀胱收缩存在神经源性和肌源性两种学说[2]。虽然从膀胱正常收缩完全受意识控，神经源性控制说看其合理性是毋庸置疑的。但在一些特定情况下，诸如膀胱过度活动综合症 (Overactive Bladder，OAB)，患者的膀胱黏膜无明显病理变化（或者说目前有我们未知的病理改变）而出现非充盈性膀胱异常活动，提示膀胱有可能还受其它机制调控。这种情况下，膀胱的收缩更多的表现为肌源性特征，呈现出一定程度的非神经源性的自主性。以往的观点认为这种自发性兴奋起搏来源于逼尿肌细胞，但更多实验数据表明：逼尿肌细胞没有自发性兴奋的特点，无法担当膀胱起搏的任务[3]。
综合OAB的病因来看，多种因素参与致病。 Kubota[4]等人研究发现：膀胱出口梗阻情况下，OAB膀胱中ICCs样细胞显著增多，提示OAB的发生可能和ICCs细胞增多；McCloskey [5]和Hashitani[6]等研究发现逼尿肌的自发性电活动源于逼尿肌束边缘的ICCs样细胞，这些细胞首先产生自发性电活动，随后刺激逼尿肌细胞产生动作电位，并通过肌间的缝隙连接传导，引起其他肌束的电位变化的收缩活动。分布在膀胱逼尿肌肌束间的膀胱ICCs细胞，可通过胞体间的缝隙连接及ICCs细胞的突起相互形成网状结构联系, 并伸出突起到肌束内与平滑肌或神经组织相联系，缝隙连接是在相邻细胞间的缝隙中构成一个通道，细胞胞质中的离子和小分子物质可以通过这一通道相互沟通，进行细胞间通讯,使兴奋信号得到迅速传播[7]。原代培养的ICCs细胞和逼尿肌细胞的静息膜电位、膜电容存在明显差异； ICCs细胞可记录到起搏细胞特征电流Ih, 而在逼尿肌细胞则记录不到[8]，同时膀胱ICCs细胞表面存在多种受体蛋白，最近有关超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(hyperpolatization-activated，cyclic nucleotide-gated cation channel，HCN阳离子通道，简称 HCN 通道)在ICCs细胞膜上的发现为其是膀胱活动的潜在起搏点提供一重要依据[9]。由此可见ICCs对在膀胱逼尿肌异常收缩的病理过程中可能发挥重要作用。
同时我们设想的一个问题是：有没有一种药能够通过透过膀胱粘膜影响膀胱ICCs细胞从而抑制逼尿肌异常收缩？本实验将在细胞水平进行实验探讨酸敏感离子通道抑制剂阿米洛利（Ami）对膀胱ICCs细胞内Ca2+浓度的影响，从而为通过阿米洛利影响膀胱ICCs为中间环节，间接影响膀胱逼尿肌收缩，为治疗膀胱异常收缩的相关疾病提供相关的基础研究。
材 料 和 方 法
1、材料
实验动物：健康成年SD大鼠，雌雄不限，体质量200～250g。主要试剂：DMEM培养液、Ⅱ型胶原酶（Sigma，美国）、胎牛血清（FBS，Hycone公司）、Ficoll400细胞分离液（Pharmacia，美国）、青链双抗（哈尔滨哈药集团，哈尔滨）、Alexa488标记的兔抗羊荧光二抗、羊抗大鼠c-kit 多克隆抗体（Santa Cruz 公司）、Fluo－3－AM（invitrogen公司）、盐酸阿米洛利（Sigma，美国）、胰蛋白酶抑制剂（Sigma，美国）、L-多聚赖氨酸（Sigma，美国）、干细胞生长因子（SCF，R&D公司）
2、实验方法
2.1体外膀胱ICCs的分离与培养
2.1.1酶解液的配制：Ⅱ型胶原酶10mg、牛血清白蛋白10mg、胰酶抑制剂10mg，放入小培养瓶中，加入D-Hank's 5ml，充分溶解，滤头过滤后备用。
2.1. 2标本的分离制备：动物采用SD大鼠2-3月龄，体质量200-250g，提前沿下腹剪毛，断颈法处死动物，超净工作台内大鼠备皮处消毒后，在大鼠耻骨联合后方寻找辨认膀胱后取出膀胱，将膀胱组织放入冷D-Hank's（PH7.0）液中漂洗数分钟，在解剖显微镜下纵行剪开膀胱，小心撕去膀胱粘膜和浆膜层后，制成细小肌条，并用D-Hank’s反复冲洗肌条3次。将膀胱肌条剪成1×1×1 mm3组织块。
2.1.3 细胞悬液制作：将组织块移入培养瓶，加入配制好的酶解液充分混匀，37℃培养箱中消化15分钟，期间用吸管吹打2次，将消化好的组织悬液移入离心管离心，1500rpm×5分钟，弃上清，去除消化酶；在离心管中加入等量D-Hank's，吹打混匀，组织悬液用200目细胞筛网过滤，去除组织碎块；将细胞悬液加进等体积的密度梯度分离液Ficoll400，1000r/min离心7min，弃上清。
2.1.4 接种：将分离好的细胞悬液加入适当的DMEM培养基(含DMEM成分、10%FBS、1mlAntibiotic、SCF50ng/ml)， 取0.1ml的细胞液滴到血细胞计数板，计算细胞密度将细胞浓度调整至1×106/ml并接种至6孔培养板，板中预先放置包被贴黏多聚赖氨酸的盖玻片。放入培养箱内，在37℃，5%CO2条件下培养。培养24h后换液，去除未贴壁细胞，加入培养基继续培养，以后每隔1d换液一次，期间用倒置显微镜下观察细胞生长情况。
2.2膀胱ICCs细胞的鉴定
细胞稳定爬片培养5d后，进行免疫荧光检测。步骤：倾去培养基，用0.01mol/PBS漂洗，5min×3次；室温下用4%多聚甲醛固定30min，0.01mol/PBS漂洗5min×3次，在室温下加入10%BSA封闭30min弃液；0.2%TritonX-100（10mlPBS，20μl TritonX-100）透膜15min弃液，；羊抗大鼠c-kit多克隆抗体（1：500稀释）滴到细胞片上，4℃过夜；次日0.01mol/PBS冲洗3次，每次5min；加入AlexaFluo488标记的羊抗兔二抗（1:150稀释），37℃孵育1小时，0.01mol/PBS漂洗5分钟×3次；最后DIPI染核，指甲油封片后供激光共聚焦显微镜观察。
2.3阿米洛利对膀胱ICCs细胞内游离钙离子的影响
2.3.1染液配制：Fluo-3-AM 50ug溶于45ul DMSO(Fluo-3-AM浓度1mM)，15ul/支分装，-20℃保存。染色时用15～50mM HEPES缓冲液将其稀释为1～20uM(如1.5ml为10uM)。必要时，可加入助染剂 HBSS 增强染色效果。
2.3.2 染色步骤：1)取在圆形盖玻片上培养细胞，缓冲液漂洗 2～3 次。2)对照组加入500μlPBS，实验组加入同浓度Fluo-3-AM (1～20uM)， 37℃下孵育30分钟。3)缓冲液漂洗 2～3次。4)加0.5ml缓冲液，上机测量。
2.3.3细胞分组：将待实验细胞爬片分为实验组和对照组。实验组分别以50μmol/L和 100μmol/L 的阿米洛利的PBS溶液孵育30分钟，对照组以PBS孵育。随机选取20个目标细胞，要求选择显微镜下细胞形态典型的、与周围细胞无接触孤立的ICCs细胞，用药前、用药后分别进行检测，最后采用样本均数进行统计学假设检验，检验水平 P<0.050为差异有统计学意义。
3.结果
3.1膀胱ICCs的分离与培养结果 对大鼠膀胱细胞分离并培养8h后通过相差显微镜观察，可发现胞体呈纺锤状、梭形贴壁生长细胞，胞体较小，折光性强，有两个长的突起或多个短的侧突，梭形细胞两极可见有两个或多个突起的膀胱ICCs细胞，视野中偶见膀胱平滑肌细胞（SMC）其形态上与膀胱ICCs细胞有明显区别，呈现短棒状，ICCs-SMC可见类似神经-肌肉突触链接样结构单元(图1-A)。培养72h后可见膀胱ICCs细胞突起间相互接触(图1-B)，
原代分离培养8h膀胱ICCs光镜下形态，蓝色箭头指示大鼠膀胱cajal间质细胞(ICCs)，蓝色箭头指示膀胱平滑肌细胞（SMC），可见ICCs-SMC间借助ICCs的突起相接处。（×40倍）(图1-A)；原代分离培养72h膀胱ICCs光镜下形态，可见ICCs-ICCs间突起相互交错、接触成网状，部分ICCs细胞胞体呈纺锤形，折光性强，其中夹杂少量平滑肌肌细胞。（×20倍）(图1-B)
3.2膀胱ICCs细胞的鉴定 待细胞稳定爬片培养5d后行C-Kit免疫荧光抗体鉴定膀胱ICCs细胞，结果提示此类贴壁细胞C-Kit 染色呈阳性，提示为膀胱ICCs细胞(图2-A及图2-B)。
膀胱ICCs培养5d后，免疫荧光染色激光共聚焦下细胞形态，红色为细胞核，胞体C-kit受体荧光染色呈绿色，两端可见长的细胞突起，形成ICCs-ICCs间突起相互交错、接触成网状，细胞核与胞体重叠部分显色成淡黄色。(图2-A)；膀胱ICCs细胞DIPI染核，细胞核呈红色，标尺。(图2-B)
3.3 应用共聚焦显微镜镜观察阿米洛利对膀胱ICCs细胞内的Ca2＋波动的影响，统计学方法 采用 SPSS 19.0 统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差表示，检验方法采用配对t检验 。对照组的膀胱ICCs细胞呈有规律的亮度波动，Ca2＋波动振幅、频率变化无统计学意义（P＞0.05）。而在被Ami孵育的实验组中，与加药之前相比，实验1组(50μmol/L阿米洛利处理)，膀胱ICCs细胞的Ca2＋波动较孵育前有所频率减慢但经统计学检验无统计学意义（P＞0.05），但Ca2＋波动振幅明显较前变小，有统计学意义（P<0.01）；而实验2组(100μmol/L阿米洛利处理)的膀胱ICCs细胞的Ca2＋波动这种频率和振幅下调的现象更为显著(P<0.01)。
6.讨论
膀胱的贮尿、排尿功能有乃于膀胱结构的完整外还受自主神经支配。目前的研究表明膀胱黏膜由外向内由3种明显的细胞层：基底细胞层；中间细胞层；伞状细胞层。伞状细胞层表面由葡萄糖胺聚糖层（GAG）、Uroplakin班及盘状小泡、封闭带组成的“防水层”。Birder[10]等在对尿路上皮细胞的研究表明其具有感觉并且发出信号的特征，这使得它们能够对周围的物理和化学环境变化做出反应，并且传递给膀胱壁的下级传导结构。最近的有关超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(HCN阳离子通道，简称 HCN 通道)在ICCs胞膜上的发现为其膀胱活动的潜在起搏点提供一重要依据。HCN离子通道在心脏的窦房结细胞，神经元细胞等自律性细胞上被发现，被认为是起搏细胞的重要特征，同时HCN通道是产生起搏电流Ih(hyperpolarization-activated inward current)的结构基础。相关研究表明Ih特异性阻断剂ZD7288对ICCs细胞Ih有明显抑制作用，从而可以抑制逼尿肌的收缩活动，而膀胱ICCs 与神经末梢间存在传导电信号的缝隙连接,表明膀胱ICCs细胞可能是神经—膀胱ICCs细胞—逼尿肌这一信号传导通路的中间环节，为以膀胱ICCs细胞为靶点治疗膀胱异常活动性疾病提供了依据。
Fluo -3-AM是一种检测细胞内钙离子的荧光探针。Fluo-3若以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但是当它与钙离子Ca2+结合后荧光会增加60至80倍，是目前最常用的一种钙离子荧光探针。Fluo-3-AM 被动扩散进入细胞后，被酯酶水解释出Fluo-3，Fluo-3会与Ca2+络合，受488nm的激光激发而产生荧光，其荧光值与[Ca2+]i呈正相关，即以荧光值变化表示[Ca2+]i变化，在激光扫描共聚焦显微镜Time Series程序下对细胞XY平面进行扫描，基础荧光值在图像分析程序下按最小噪声最大图像信号人为设定。计算细胞XY平面内平均荧光强度，以平均荧光强度代表细胞内Ca2+。
本实验成功体外、分离培养大鼠膀胱ICCs细胞，对大鼠膀胱细胞分离并培养8h后通过相差显微镜观察，可发现胞体呈纺锤状、梭形贴壁生长细胞，胞体较小，折光性强，有两个长的突起或多个短的侧突，梭形细胞两极可见有两个或多个突起的膀胱ICCs细胞，视野中偶见膀胱平滑肌细胞（SMC）其形态上与膀胱ICCs细胞有明显区别，呈现短棒状，ICCs-SMC可见类似神经-肌肉突触链接样结构单元(图1-A)。培养72h后可见膀胱ICCs细胞突起间相互接触(图1-B)，待细胞稳定爬片培养5d后行C-Kit免疫荧光抗体鉴定膀胱ICCs细胞，结果提示此类贴壁细胞C-Kit 染色呈阳性，提示为膀胱ICCs细胞，为膀胱ICCs细胞在逼尿肌异常活动相关疾病的研究提供了基本的实验探索，SCF(干细胞生长因子)为ICCs细胞膜C-kit的配体，培养液中加入干细胞生长因子，是维持ICCs细胞表型和功能的关键；是进行该类研究的基础。
本研究采用细胞内钙离子的荧光探针（Fluo -3-AM）检测经阿米洛利处理后膀胱ICCs细胞[Ca2+]i变化。结果表明：对照组的膀胱ICCs细胞以PBS孵育前后仍有规律的亮度波动，Ca2＋波动振幅、频率变化前后无统计学意义（P＞0.05）。而在被Ami孵育的实验组中，与加药之前相比，实验1组(50μmol/L阿米洛利处理)，膀胱ICCs细胞的Ca2＋波动较孵育前有所频率减慢但经统计学检验无统计学意义（P＞0.05），但Ca2＋波动振幅明显较前变小，有统计学意义（P<0.01）；实验2组(100μmol/L阿米洛利处理)的膀胱ICCs细胞的Ca2＋波动和振幅均下调，且下调较明显，有显著差异，统计学有意义 (P<0.01)。
甲磺酸伊马替尼(Glivec)在体内外均可在细胞水平上抑制酪氨酸激酶C受体，实验表明甲磺酸伊马替尼可以与ICCs细胞表面的酪氨酸激酶C受体结合并特异性阻断酪氨酸激酶C受体，致使ICCs细胞内Ca2＋波动频率、振幅下降，通使用 Glivec 后进行FRAP（荧光漂白实验）实验发现：膀胱ICCs细胞与逼尿肌细胞之间的信号传递被明显抑制。盐酸阿米洛利也有相似作用，由于膀胱GAG层细胞不能阻止盐酸阿米洛利进入并影响伞状细胞上皮表面的钠通道功能，同时可以影响膀胱ICCs细胞内钙离子波动，为优势，但其能否在膀胱灌注治疗时透过膀胱粘膜而抑制膀胱ICCs而影响膀胱平滑肌的收缩尚需实验验证。
酸敏感离子通道（acid-sensing ion channels，ASICs）是一类由胞外液体酸化所激活的阳离子通道，酸化激活后产生电流并影响相关靶器官。到目前为止，已经发现 ASICs 家族的 6 个亚基 ASIC1a、ASIC1b、ASIC2b、ASIC3、ASIC4。这6 个亚基可以按照不同的模式，组成同聚体或异聚体酸敏感离子通道。已初步探明ASICs在人体内广泛分布，在触觉、痛觉、酸味觉、学习记忆以及部分病理反应中具有重要作用。
李霞等研究发现：在脊髓背根有 ASIC3 较多的表达，与痛觉及伤害性感受密切相关，在慢性炎性疼痛的病理过程中发挥重要的作用，在炎性痛模型中可以增加脊髓背根 ASIC3 在转录和蛋白水平的表达；阻断或敲除 ASIC3 基因 (ASIC3-/-) 能明显抑制炎症性关节痛。上述研究表明，在生理或病理情况下, 脊髓背根中ASIC3对脊髓水平的感觉信息传递特别是痛觉的传导可能发挥着重要作用，这可能是关节炎疼痛的治疗靶点。
有学者研究发现：激活ASIC3可以刺激小肠迷走神经传入神经元产生相应的电流改变，进而影响小肠平滑肌的收缩。由此提出ASIC3与胃肠道收缩可能有一定的联系。
ASIC3抑制剂—盐酸阿米洛利临床上为保钾利尿药或钠氢交换抑制剂。目前除抑制ASICs外，短时间低剂量的的膀胱灌注不会产生任何的药理作用。
由于ASIC3与痛觉和平滑肌收缩密切相关，OAB症状通常伴有不同程度的膀胱疼痛以及膀胱逼尿肌亢进。因此我们大胆设想：阿米洛利对膀胱ICCs细胞内Ca2+抑制波动的作用是否通过抑制ASIC3的表达通路完成的，其作用机制值得深入研究。
值得提出的是：甲磺酸伊马替尼(Glivec)虽然可以抑制膀胱ICCs细胞与逼尿肌细胞之间的信号传递，但尚无磺酸伊马替尼(Glivec)能自由通过膀胱灌注进入黏膜下层的相关研究；同时其价格昂贵，难以在临床上普及使用，而阿米洛利价格便宜。本实验通过基础实验证明阿米洛利对膀胱ICCs细胞内Ca2+抑制波动的作用，为OAB等膀胱异常活动的进一步研究提供新的思路。
参 考 文 献
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论文作者:王天宝1,陈剑珩2,张建华2, 刘孝东2
论文发表刊物:《中国医院药学杂志》2016年8月
论文发表时间:2016/10/27
标签：膀胱论文; 细胞论文; 阿米论文; 统计学论文; 荧光论文; 突起论文; 振幅论文; 《中国医院药学杂志》2016年8月论文;