何东平[1]2001年在《高产PUFAs菌株的选育及其制备工艺的研究》文中进行了进一步梳理PUFAs作为人体必需脂肪酸，在许多方面显示出其独特的生理学功能。通常，PUFAs主要来源于动植物。如利用低等真菌来合成PUFAs，不仅能弥补人体生理的需要，而且可开拓新的油脂来源。本课题通过研究，选出了深黄被孢霉Mortierellaisabellina株作为摇瓶小试菌株，该株生长快，菌丝多，利用培养基原料能力强，易于形成孢子，生物量49g干菌体/L发酵液，含PUFAs46.61％，其中GLA2.3％。通过对高产脂培养基筛选和高产脂突变株的选育，经过发酵得到干菌丝体，含油量42.75～47.78%。在实验室条件下，用有机溶剂直接萃取油脂，也可以用超临界CO_2装置萃取油脂。微生物干菌体与脱脂大豆粕按1：1配比，进行压榨成型，采用超临界CO_2萃取装置，对微生物油脂进行精炼。本课题用超临界CO_2萃取技术，从干菌体中提取微生物油脂，通过叁因素叁水平正交试验方案，考察温度、压力、CO_2气速对萃取量和苹取物组成以及油脂组成的影响，结果显示，影响萃取量及组成的主要因素是压力，其次是温度。所得到的微生物油脂，GLA含量为4.40～6.59％，是菌株GLA含量的1.91～2.89倍，生物量49g干菌体/L发酵液，干菌粕残油3％，微生物油脂精炼率95％。在工业生产中，先通过蒸炒压榨出微生物毛油，经有机溶剂萃取残油。开发、研究并生产微生物油脂是近年来的一个热门课题，微生物的增殖率高，干菌体含油量高，用微生物方法生产油脂的品种可以选择，同时，比农业生产需要的劳动力少，微生物培养可以在有限的占地上进行加工生产，不受季节和气候变化的限制，能精确地计划微生物的产量，而且能连续生产。这种方法周期短，产量高，不受场地，不受季节、环境的影响，从而开辟了新的油源，为人类提供了科学产油的广阔前景。
周翠霞[2]2014年在《多不饱和脂肪酸高产菌株的选育及发酵研究》文中认为多不饱和脂肪酸(PUFAs)具有维护膜结构、抑制心血管疾病、抗炎、防癌以及促进大脑发育、减肥、提高动物的产仔率和成活率等功能,在食品、医药、养殖、化妆品等行业中应用广泛。深黄被孢霉是目前研究最广泛,最有潜力实现PUFAs大规模工业化生产的微生物资源,但仍存在菌种产量低、发酵工艺不完善、油脂提取率低等问题。本研究围绕提高PUFAs产量的核心问题,对PUFAs高产菌株的选育、微生物油脂最佳提取工艺、培养基组分及发酵条件的优化进行了系统的研究。主要得到以下研究结果：1.本研究通过紫外线和亚硝基胍联合诱变、乙酰水杨酸推理筛选,获得高产菌株N0.1-112。菌株N0.1-112生长能力和产油能力较强,其生物量为24.71g/L、油脂产量为20.02g/L, PUFAs产量为4.67g/L,分别比原始出发菌株提高202.45%、580.06%和267.72%,且遗传稳定。2.本研究分别采用超声波辅助酸热提取法和超声波微波联合提取法两种提取方法,对微生物油脂的提取条件进行了研究,确定各自最佳的提取工艺。通过两种工艺比较,最终确定超声波微波联合提取法为微生物油脂最佳提取方法。最佳工艺为：微波功率400W,微波时间3.7min,超声温度30℃C,超声时间40.5min,超声功率498W,料液比1：12.3(w/v),在此条件下,微生物油脂的提取率达到92.24%,提取量达178.73±0.17mg/g(湿菌)(P<0.05),是优化前的1.65倍。3.在单因素实验结果基础上,通过B-B试验设计对培养基组分和发酵条件进行了优化,确定了最优的培养基组分和发酵条件。最佳的发酵培养基组分分别为：2g/L KH2PO4,2g/L柠檬酸钠,116g/L葡萄糖,10.8g/L酵母浸膏与花生饼粉混合氮源,比例为3：1(w/w),30.8mg/L Ca2+,96.8mg/L Mg2+在此条件下PUFAs产量达到6.27g/L；最佳发酵条件组合分别为：初始pH值6.36,培养温度28℃,接种量10%,装液量117ml/500m1,摇床转速200r/min,该条件下PUFAs产量高达7.03g/L。
王莉娟[3]2009年在《提高被孢霉油脂含量的方法研究及其制备微生物柴油的初步探讨》文中研究指明近年来,人们对油脂尤其是功能性油脂的需求量急剧上升。与此同时,石化油脂迅速枯竭,而植物油脂因受其产地和气候的影响,并不能满足社会日益增长的需要。因此,微生物油脂以其独特的优势被许多国家的研究者所重视。本文以被孢霉为研究菌株,主要研究了以下叁方面的内容:1.考察了发酵过程中温度、接种量、溶氧量、pH值等因素对被孢霉发酵生产油脂的影响。确定最佳发酵温度为前期28℃,培养后期也就是第144h时将温度调为20℃发酵一天;接种量为5%;装液量20%,pH值5.0～6.0,在上述发酵条件下,油脂含量为46.31%。在对培养基优化的基础上,通过向发酵液中添加不同激活剂,筛选出了两种促进作用明显的激活剂丙酸钠和甘草酸,使被孢霉油脂含量分别提高到60.12%和73.13%。2.其次,通过超临界二氧化碳萃取装置大量萃取被孢霉油脂,考察了原料粒度、温度、压力、时间四种因素对油脂萃取率的影响,发现当温度40℃、压力20 Mpa、时间120 min、原料粒度20～40目为油脂的最佳萃取条件。在此条件下,油脂得率43.08%,气相色谱分析结果显示油脂中棕榈酸占24.2%、油酸54.2%、亚油酸11.3%、γ-亚麻酸2.8%。3.最后,还对所得到的油脂进一步精炼,对微生物油脂制备生物柴油的过程进行了初步的探索,考察了油脂精炼和甲酯化制备生物柴油过程中的一些因素的影响,为用被孢霉发酵生产生物柴油提供了科学依据。
孙登岳[4]2016年在《功能性油脂高产菌株的选育及代谢调控初步研究》文中提出功能性油脂是一类具有特殊生理功能的油脂,它具有减少心血管疾病发生、促进机体细胞生长、调节免疫机制及脂代谢、抗癌、抗过敏和抗皮肤衰老等功能,在医学医药、功能性食品及日常方面得到广泛应用,具有广阔的应用前景。微生物功能性油脂的开发研究可以解决功能性油脂产量短缺、生产来源有限、人们日常需求量不足的问题。深黄被孢霉是目前研究较为广泛,最有可能实现功能性油脂工业化生产的产油微生物。为提高功能性油脂的产量,本文以深黄被孢霉As3.3410为出发菌株,研究了功能性油脂高产菌株的选育,培养基组分的优化,超临界提取功能性油脂工艺,外源因子添加对菌株产功能性油脂代谢的影响。主要研究结果如下:1.本研究通过紫外-氯化锂复合诱变、丙二酸和芝麻酚筛选,获得功能性油脂高产菌株ZL2-103,经遗传性稳定性试验,该菌株具有良好的遗传稳定性,产油能力较强,其生物量为25.73 g/L,油脂产量为20.38 g/L,功能性油脂产量为4.32 g/L,其油脂产量和功能性油脂产量分别比原始出发菌株提高111.19%和285.71%。2.对菌株ZL2-103的发酵培养基组分进行单因素试验,在此基础上,通过BBD试验设计对发酵培养基组分进行了优化,确定了最佳的发酵培养基组分:葡萄糖107.40 g/L,复合氮源8.71 g/L,硫酸镁91.87 mg/L,磷酸二氢钾2.73 g/L,其中复合氮源为花生饼粉和酵母膏按照1:3(w/w)的比例混合而成,经优化后,功能性油脂产量达到了5.21 g/L。3.采用超临界CO_2提取微生物油脂,对影响油脂得率的提取条件进行了单因素试验,通过BBD试验设计,确定了最佳提取工艺:萃取压力48 Mpa,萃取温度43℃,动态萃取时间141 min,静态萃取时间20 min,菌体粉碎度60目;在此条件下,油脂得率为94.83%。对传统有机法和超临界CO_2法提取的油脂进行了GC-MS组分分析、油脂理化指标(酸价、过氧化值、皂化值、碘值及折射率)分析,并且对两种方法提取油脂后的菌体进行电镜扫描观察菌体的破壁程度,经全面比较分析,超临界CO_2提取法优于传统有机法,超临界CO_2提取法更适用功能性油脂的提取。4.研究了叁种外源因子对菌株ZL2-103产功能性油脂代谢的影响,实验结果表明:浓度为0.3%乙酸钠、0.01%苹果酸及0.01%柠檬酸对菌株功能性油脂的积累均有促进作用,存在最佳添加的发酵时期,且在特定发酵时期组合添加外源因子,能使功能性油脂产量达到最高。在发酵初始添加0.3%乙酸钠和0.01%苹果酸以及第4 d添加0.01%柠檬酸时,菌株功能性油脂产量达到了5.89 g/L,比对照组提高了15.26%。
李丽娜[5]2009年在《深黄被孢霉高产花生四烯酸菌株的诱变及其提取技术的研究》文中认为花生四烯酸是一种人体必须的不饱和脂肪酸,具有广泛的生物活性和重要的营养作用。其传统来源是动物的组织、血液、鱼油和深海藻类,但从这些材料中提取花生四烯酸的成本较高、提取率低,导致目前花生四烯酸的价格昂贵,不能满足市场需要。微生物发酵法生产花生四烯酸是制备花生四烯酸的新途径,可以降低成本、提高产量。微生物发酵法生产花生四烯酸的核心问题是高产菌株的筛选。本研究的目的是选育花生四烯酸高产菌株和确定微生物油脂中花生四烯酸提取的工艺参数。实验以深黄被孢霉为出发菌株,分别采用微波诱变、紫外诱变、原生质体再生诱变和紫外诱变原生质体的方法,对出发菌株进行诱变,选育花生四烯酸高产菌株。通过CO2超临界萃取技术和尿素包合的方法提取发酵液中的花生四烯酸。1、花生四烯酸高产菌株的选育。以深黄被孢霉为出发菌株,分别采用微波诱变、紫外诱变、原生质体再生诱变和紫外诱变原生质体等方法进行诱变,利用气相色谱分析花生四烯酸含量,最终获得了四株花生四烯酸高产菌株,并且遗传性能稳定。实验结果表明:(1)微波频率700W,累计加热时间35s,其致死率为78.3%。经过两轮诱变和筛选,获得高产菌株W35s2-153,其生物量为30.85g/L,微生物油脂含量为15.5g/L,花生四烯酸产量为2.61g/L,比原始菌株提高318%。(2)紫外灯功率20W,照射距离30cm,照射时间80s,其致死率为76.4%。经过两轮诱变和筛选,获得高产菌株Z80s2-17,其生物量为33.81g/L,微生物油脂含量为16.02g/L,花生四烯酸产量为2.74g/L,比原始菌株提高334%。(3)酶浓度4%,酶解温度30℃,酶解时间7.5h,原生质体形成率为78.4%;经过诱变和筛选,获得高产菌株Y-69,其生物量为29.6g/L,微生物油脂含量为15.13g/L,花生四烯酸产量为2.92g/L,比原始菌株提高356%。(4)紫外灯功率20 W,照射距离30 cm,照射时间40 s,其致死率为79.5 %。经过诱变和筛选,获得高产菌株YZ-124,其生物量为36.5 g/L,微生物油脂含量为19.2 g/L,花生四烯酸产量为4.72 g/L,比出发菌株提高576%。2、CO2超临界萃取微生物油脂中花生四烯酸的研究。以花生四烯酸提取率为评价指标,利用二次回归正交旋转组合试验优化花生四烯酸提取条件,并采用气相色谱分析花生四烯酸的含量。实验得到最佳萃取条件为:萃取温度32℃、萃取压力16mPa、萃取时间101min和10%甲醇做夹带剂,花生四烯酸提取率为45.7%,花生四烯酸含量为19.34%。3、尿素包合法纯化花生四烯酸的研究。以花生四烯酸含量为评价指标,利用正交实验确定包合反应的最佳条件,并采用气相色谱分析花生四烯酸的含量。实验得到最佳包合条件为:尿素:脂肪酸为4:1(W/W)、脂肪酸:乙醇为1:12(W/W)、包合温度为-15℃和包合时间为12h,微生物油脂中花生四烯酸含量为36.84%。
于长青[6]2009年在《深黄被孢霉高产花生四烯酸的制备及其调控机制》文中研究表明花生四烯酸是一种人体必须的不饱和脂肪酸,具有广泛的生物活性和重要的营养作用。其传统制备方法成本较高、提取率低,微生物发酵法生产花生四烯酸可降低成本、提高产量。△5-、△6-脱饱和酶是花生四烯酸合成途径上的关键酶,评价脱饱和酶与花生四烯酸产量的关系,可进一步确立该酶在花生四烯酸生物合成中的作用。本研究的目的是选育花生四烯酸高产菌株,优化花生四烯酸提取和纯化的工艺参数,研究深黄被孢霉诱变菌株脱饱和酶的基因序列变化,探讨脱饱和酶的活性及mRNA表达量与花生四烯酸产量的关系。以深黄被孢霉为出发菌株,分别采用微波诱变、紫外诱变、原生质体再生诱变和紫外诱变原生质体等方法进行诱变,利用气相色谱分析花生四烯酸含量,最终获得四株花生四烯酸高产菌株,其中YZ-124花生四烯酸产量最高,为4.72 g/L,比出发菌株提高576 %,并且遗传性能稳定。采用CO2超临界萃取技术提取微生物油脂中的花生四烯酸,花生四烯酸提取率为45.7%,花生四烯酸含量为19.34%。采用尿素包合法纯化花生四烯酸,最终得到产品中花生四烯酸含量为36.84%。以深黄被孢霉原始菌株及高产花生四烯酸的诱变菌株为基础,利用RT-PCR及基因克隆方法获得了5株深黄被孢霉的△5、△6-脱饱和酶基因的完整cDNA,对其进行序列分析,结果表明:诱变菌株与原始菌株的核苷酸及氨基酸序列同源性较高。利用TTC-脱氢酶活性测定法及荧光定量PCR方法测定了5株深黄被孢霉的同一培养时间及高产花生四烯酸菌株YZ-124在不同培养时间的活性及mRNA表达量,结果显示:脱饱和酶的活性及表达量与培养物油脂中花生四烯酸含量呈正相关关系。
陶发琴[7]2013年在《高产油脂酵母的选育及发酵条件优化》文中研究指明生物柴油是一种绿色环保的新型能源。传统的生产方法是从动植物油脂转化而来。动植物因为受多种因素的影响,油脂产量不稳定,且生长周期漫长,需要大量的劳动力,经济成本较高。而微生物油脂含量高、脂肪酸组成与植物油相似,并且不受季节、气候及场地等的影响,可连续生产,故逐渐取代植物油脂成为生物柴油的新来源。产油微生物中酵母菌油脂脂肪酸组成与植物相似,且含量高,常被看做未来生物柴油的重要来源。本文旨在对分离到的野生酵母菌株进行诱变并寻求较优发酵条件,以期获得更高产的产油菌株,从而提高产油酵母的应用效率。本实验从菜园土壤中分离到产油酵母CY24,经鉴定为黏红酵母(Rhodotorula glutinis)。以CY24为出发菌株进行紫外线和DES和复合诱变,将Cerulenin平板筛选法与磷酸香草醛反应相结合,实现突变株的快速筛选。此法筛选到一株高产油脂酵母CY24-24。进一步优化黏红酵母CY24-24发酵产脂培养基的组成和培养条件。通过对各种培养条件做单因素实验,确定培养条件为：装液量为40mL/250mL,接种量为10%,起始pH值为7.0,培养温度为26℃。培养基的优化是在单因素实验基础上做Box-Behnken实验,确定各显着影响因子间的交互作用。最终确定发酵培养基组成为：80.8g葡萄糖、1.24g酵母膏、1.45g(NH4)2SO4、2.01gKNO3,0.02gFeSO4、0.8g MgSO47H2O、0.002gMnSO4、2gKH2PO4,1000mL水,pH7.0,在此培养基和培养条件下发酵产油,油脂产量为7.79±0.12g/L。进而对酸热-有机溶剂提取法做了优化。在单因素基础之上,通过Plackett-Burmen实验筛选出对油脂得率有显着影响的因素,包括盐酸浓度、盐酸体积、酸处理时间和氯仿体积。再用Box-Behnken实验优化这四个因素的水平。最终确定提取工艺为：盐酸浓度：4.14mol/L;盐酸体积：11.64mL；酸处理时间：32.90min；氯仿用量：24.40mL。按较优工艺提取,实际油脂质量分数为57.45±0.57%。优化后的总油脂产量达10.66±0.23g/L,比优化前提高了57.93%。用气相色谱-质谱联用仪对得到的油脂进行脂肪酸组成的分析,结果显示该菌株产生的油脂主要由油酸(C18：1)、软脂酸(C16：0)、亚油酸(C18：2)、硬脂酸(C18：0)和棕榈油酸(C16：1)组成,其脂肪酸组成与植物油近似,因此可以作为生产生物柴油的原料。
李楠[8]2007年在《微生物利用甘蔗糖蜜发酵产多不饱和脂肪酸的研究》文中进行了进一步梳理多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)是指含两个或两个以上双键且碳原子数为16-22的直链脂肪酸,主要有亚油酸(Linoleic acid,LA)、γ-亚麻酸(γ-Linolenic acid,GLA)、花生四烯酸(Arachidonic acid,ARA)、α-亚麻油(α-Linolenic acid,ALA)、廿碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA)和廿二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)等。多不饱和脂肪酸大多数是生物活性物质的前体,尤其是对智力发育、心血管病等有良好效果。此外PUFAs还可用作食品添加剂、营养配方、健康辅料以及保健品等。微生物所具有的营养简单、生长繁殖快、易变异、可工业化大规模培养的优点决定了利用微生物生产油脂是一条开发新油源的良好途径。目前国内外研究通常利用葡萄糖、淀粉和蔗糖等作为碳源生产多不饱和脂肪酸。作者试图从土壤中筛选出以甘蔗糖蜜为碳源,发酵生产多不饱和脂肪酸的菌株,并对菌株进行诱变育种,发酵条件,代谢调控,油脂的分离提取和富集等方面进行研究,以及利用气相色谱进行油脂组成和含量鉴定分析。本研究的结果如下:1、利用苏丹黑B染色和测定多不饱和脂肪酸碘值的方法,从土壤中筛选出一株适合用甘蔗糖蜜为原料生产多不饱和脂肪酸的霉菌LB1。对LB1菌株进行形态特征、生理特征分析及5.8S rDNA基因两侧的内转录间隙进行序列分析推断该菌株为反屈毛霉属(Mucor recurvus)。2、以土壤筛选到的反屈毛霉LB1为出发菌株,通过~(60)Co辐射复合LiCl诱变,进行富含多不饱和脂肪酸菌株的选育。菌种的筛选主要以含脂量以及碘值的高低作为选择菌株的依据,筛选到一株不饱和脂肪酸高产菌株MR-10,较原始菌株总脂含量增加35.42%,碘值增加36.56%,PUFAs增加43.76%。将筛选出的菌株分别进行遗传稳定性测试表明,菌株经过五次转代培养,具有较好的遗传稳定性。3、在反屈毛霉LB1发酵条件优化的实验中,探讨了不同碳源:葡萄糖、蔗糖、淀粉以及PDA等对发酵的影响。从结果和糖蜜的成分分析以及经济角度考虑,糖蜜可以作为发酵生产多不饱和脂肪酸的碳源,且糖蜜的最佳浓度为15%。同时确定尿素为最佳氮源,最佳C/N比为35/1。通过单因子试验和正交实验,得到发酵生产不饱和脂肪酸的最佳培养条件为:培养温度25℃,摇床转速160 rpm,培养时间5天。在上述条件下,反屈毛霉LB1发酵可得生物量、总脂量和PUFAs产量分别达到12.51 g/L,7.13 g/L和5.74 g/L。4、在反屈毛霉LB1发酵代谢调控中,在发酵过程中补加十八醇、十六醇和正丁醇前体物,得出补加十六醇可以提高菌丝的油脂和不饱和脂肪酸含量。在发酵24小时后补加1.5%的十六醇,可获得最大的油脂含量8.24 g/L;碘值113.84,PUFAs 6.96 g/L。培养基中添加适量浓度金属离子Mg~(2+)可以提高菌丝多不饱和脂肪酸的产量,当MgSO_4在20-30 mmol/L范围内,生物量、油脂含量、碘值及PUFAs随MgSO_4的增加而增加。当Mg~(2+)浓度为30 mmol/L时,油脂含量6.62 g/L;碘值109.10,PUFAs 5.16 g/L。高于30 mmol/L时,生物量、油脂含量、碘值及PUFAs有所下降,说明高浓度的金属离子对发酵生产有抑制作用。在培养中添加适量的维生素可以提高油脂中PUFAs的含量,但对生物量影响不大。维生素B_1和维生素B_6作为油脂生物合成过程中合成酶的辅助因子,在不饱和脂肪酸的形成起到重要作用。维生素的添加量也有一定的影响,随添加维生素浓度的增加,油脂的碘值和PUFAs有所增加,维生素B_1添加量为0.20 mg/mL较为合适,而维生素B_6 0.25 mg/mL为适宜,说明高浓度维生素对不饱和脂肪酸的积累有利。代谢调控中低温老化是增加不饱和脂肪酸产量的一种有效方法,反屈毛霉LB1在5℃储存15天后,油脂含量由5天的5.18 g/L到5.72 g/L,PUFAs由3.37 g/L到4.60 g/L。利用低温和老化的共同作用可以提高不饱和脂肪酸的含量。5、在石油醚萃取,正己烷萃取和盐酸水解乙醚抽提等叁种油脂分离提取方法中,采用盐酸水解乙醚抽提方法为本研究油脂提取方法,多不饱和脂肪酸富集部分采用尿素包合-冷冻结晶法进行。研究表明当混合酸:乙醇:尿素=1:1.5:7.5时,富集效果最佳。在此条件下富集,微生物油脂中的碘值从原来的91.20提高到102.45,油脂的不饱和度提高了12.35%。6、采用菌体直接进行油脂的甲酯化方法,通过气相色谱分析油脂和不饱和脂肪酸的组成和含量。通过样品和标品气相色谱出峰及保留时间的对照,利用面积归一化计算,得出菌株的油脂含量为7.13 g/L,不饱和脂肪酸含量达到5.74 g/L。其中油脂中多不饱和脂肪酸的组成及含量为:油酸885mg/L,亚油酸825 mg/L、γ-亚麻酸1352 mg/L、α-亚麻酸176 mg/L、花生四烯酸567 mg/L、廿碳五烯酸467 mg/L、廿二碳六烯酸348 mg/L。7、价格低廉的甘蔗糖蜜含有丰富的糖类、氮源、无机盐及维生素等物质,可代替葡萄糖、蔗糖和淀粉等作为微生物发酵生产多不饱和脂肪酸的原料。
陈诚[9]2007年在《裂殖壶菌（Schizochytrium limacinum SR21）发酵制备二十二碳六烯酸（DHA）过程的初步研究》文中研究说明全顺式-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，简称DHA)是一种具有重要生理意义和经济价值的多不饱和脂肪酸。它不仅是婴幼儿大脑、视觉正常发育的必需物质，而且还具有延缓老年人大脑和视觉功能衰退和降低血脂、抑制血栓生成、抗自身免疫反应、抑制肿瘤等功效。因此，DHA已广泛用于生产婴幼儿食品、保健食品和辅助治疗剂等产品，其制备和加工方法也日受关注。目前DHA的主要制备方法是从深海鱼油中提取。由于鱼油资源有限、成份复杂，这种制备方法存在供应不稳定、产量有限、成本较高等问题，限制了DHA的进一步应用。更不利的是，由于海洋环境污染的恶化，这种方法的安全性受到了越来越多的质疑。因此，开发安全、可靠的DHA新来源已成为当前研究的热点。裂殖壶菌Schizochytrium limacinum SR21是一种海洋真菌，该菌DHA含量高、生长快、易于培养、对人畜无毒害，是一种极具生产前景的DHA微生物资源。本文系统研究了利用Schizochytrium limacinum SR21制备DHA的相关过程及工艺。论文首先对菌体中的DHA提取和检测过程进行了研究、确定了较佳的DHA提取路线和检测方法；其后，在摇瓶中对Schizochytrium limacinum SR21的液体发酵条件进行了考察和优化，显着提高了DHA的产量；最后，为了改进菌体生长最适温度(25℃)低于常温这一不利于工业化生产的缺点、同时也为了进一步提高DHA产量，根据设定的选育路线和筛选模型对原始菌株进行了初步诱变育种并取得了一定进展。首先对DHA的提取过程和检测方法进行了研究。比较了六种破胞方法，确定了120℃、干燥3h的高温干燥方法，该法在尽量破碎菌体细胞的同时避免DHA的破坏；改进了酸性氯仿甲醇法，采用盐酸水解干菌体后用体积比为2：1的氯仿—甲醇溶液萃取脂质的方法，实现了脂质的充分、高效提取；优化了甲酯化DHA的叁氟化硼乙醚催化法，将对甲酯化效果有重要影响的0.8mol·L~(-1)的KOH-MeOH用量优化为0.0707ml·mg~(-1)脂质；最后确定了DHA的气相色谱检测参数。其次，在摇瓶中对Schizochytrium limacinum SR21制备DHA的液体发酵条件进行了考察和优化。首先，考察了碳源、氮源以及金属离子等培养基组成对菌体生长和DHA产量的影响。发现葡萄糖、酵母粉和蛋白胨浓度对单位菌体的DHA含量无显着影响、但对细胞干重具有正效应；而K~+能促进菌体生长，但会降低单位菌体中的DHA含量。其后，采用单因素实验考察了种龄、接种量、装液量、发酵液初始pH值和发酵温度等操作条件的效应，初步确定了各操作条件的最适参数，并发现变温培养方式有利于提高DHA在脂质中的含量。最后，采用均匀设计方法对等关键因素进行了进一步的优化，通过对实验结果回归建模的方法确定最适培养基组成为：葡萄糖145g·L~(-1)，酵母粉2.6g·L~(-1)，蛋白胨5.2g·L~(-1)，K~+浓度10mM·L~(-1)，海水晶20g·L~(-1)，磷酸盐缓冲体系，pH6.8；最适操作条件为：装液量为250ml的叁角烧瓶中装20ml的发酵液，种龄24h，接种量4％，培养时间5天，前叁天25℃培养，后两天20℃培养。在此优化条件下，细胞干重达到55.64g·L~(-1)，DHA产量达到12.61g·L~(-1)。与优化前的DHA产量4.15g·L~(-1)相比，优化使DHA产量提高了2.04倍。最后，对SR21菌株进行了诱变育种以改变其最适温度低于常温这一不利于工业化生产的缺点、同时也试图进一步提高该菌株的DHA产量。采用自行设计的低温驯化方法和筛选模型，对紫外诱变菌株进行了初步选育，得到了一株DHA产量比原始菌株提高了26.73％的突变株。
聂娟[10]2011年在《裂殖壶菌SL1101的分离鉴定、诱变育种与发酵优化》文中研究指明二十二碳六烯酸((Docosahexaenoic acid, DHA)是一种人体必需的极其重要的ω-3系列高度不饱和脂肪酸,具有促进婴幼儿脑部发育、保护视力、提高机体免疫能力等重要生理功能。商业用鱼油由于其DHA含量较低、资源有限和浓厚的鱼腥味等诸多不利因素,难以满足市场的需求,因此迫切需要开发安全、可靠的DHA新来源。裂殖壶菌是一种海洋真菌,不仅生长快、易于培养,而且DHA含量高,是一种极具有工业化前景的生产DHA的资源。本试验从海南东寨港红树林自然保护区采集不同植物的腐败落叶,从中分离得到40株裂殖壶菌属菌株,经检测,细胞总脂中DHA含量达30%以上菌株有20株,其中菌株SL1101细胞中DHA含量最高。通过形态和18S rDNA分子序列分析,鉴定菌株SL1101为裂殖壶菌。为获得高产DHA的裂殖壶菌,对菌株SL1101进行了紫外诱变育种,以菌浓度和DHA产量为指标,筛选得到一株DHA产量达到1.62g/L的突变株NL025,比初始菌株提高20.0%,且该突变株传代5次后仍保持较好的遗传稳定性。研究明确了突变株的最佳培养基组成。实验考察了碳源、氮源、金属离子和海水浓度对突变株NL025产DHA的影响,并通过正交实验对培养基碳氮源进行了优化。确定其最佳培养基组成为：9%葡萄糖、9%甘油、1.5%玉米粉和1%酵母粉,5mmol/L KCl,50%的陈海水。通过单因子实验对培养条件进行优化,确定最佳培养条件为：种龄48h,接种量8%,装液量80ml/500ml,初始pH值6.0,发酵温度25℃,培养时间4天。在此优化的培养基和培养条件下,突变株菌体干重可达20.6g/L, DHA产量为4.53g/L,比优化前提高了2.79倍。
参考文献：
[1]. 高产PUFAs菌株的选育及其制备工艺的研究[D]. 何东平. 中国科学院武汉病毒研究所. 2001
[2]. 多不饱和脂肪酸高产菌株的选育及发酵研究[D]. 周翠霞. 山东农业大学. 2014
[3]. 提高被孢霉油脂含量的方法研究及其制备微生物柴油的初步探讨[D]. 王莉娟. 西北大学. 2009
[4]. 功能性油脂高产菌株的选育及代谢调控初步研究[D]. 孙登岳. 山东农业大学. 2016
[5]. 深黄被孢霉高产花生四烯酸菌株的诱变及其提取技术的研究[D]. 李丽娜. 黑龙江八一农垦大学. 2009
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[7]. 高产油脂酵母的选育及发酵条件优化[D]. 陶发琴. 西北大学. 2013
[8]. 微生物利用甘蔗糖蜜发酵产多不饱和脂肪酸的研究[D]. 李楠. 广西大学. 2007
[9]. 裂殖壶菌（Schizochytrium limacinum SR21）发酵制备二十二碳六烯酸（DHA）过程的初步研究[D]. 陈诚. 浙江大学. 2007
[10]. 裂殖壶菌SL1101的分离鉴定、诱变育种与发酵优化[D]. 聂娟. 海南大学. 2011
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