李晓军[1]2016年在《逆转录酶的功能性研究》文中进行了进一步梳理人类免疫缺陷病毒(HIV),是造成人类免疫系统缺陷的一种病毒,该病毒属于逆转录病毒科,慢病毒属。同所有逆转录病毒一样含有两条基本相同的正链RNA作为基因组。逆转录病毒基因组的复制,是在逆转录酶(RT)的作用下,以病毒RNA基因组为模板,经过两次精确的链转移步骤(与模板分离/再结合),逆转录成两端分别带有相同LTR的双链前病毒DNA基因组而完成。迄今为止,研究者对病毒逆转录过程中链转移的研究一般使用三个系统:第一个系统应用两个携带不同RNA基因组病毒的单轮感染系统。在该系统中进行逆转录反应时,逆转录酶可以在同一模板不同位点或不同模板之间发生链转移作用。然而,只有发生在同一方向的链转移才可能产生可以整合到宿主细胞基因组中的双链前病毒DNA。这样的链转移现象很容易通过前病毒DNA测序方法被检测到。但如果逆转录过程异常终止,或发生方向相反的异常链转移就可能产生两端缺失LTR的DNA产物,不能完成前病毒DNA的整合步骤,故而这样的逆转录产物无法被检测到。第二个系统使用一对供体RNA和受体RNA,利用标记性逆转录引物起始逆转录反应,当c DNA沿“供体RNA”逆转录至模板的5’端时,通过5’端所含的同源碱基链转移到受体RNA上继续延伸,而链转移后的c DNA片段可通过凝胶电泳法进行分析。但该方法仅能检测由引物起始逆转录的c DNA片段,并且由于不能准确得到c DNA片段的序列,因此发生在片段内部的反方向和缺失性链转移都不能进行准确的分析。在第三个研究系统中,研究者是利用PCR方法扩增HIV基因组并对其产物进行测序,利用序列比对分析等方法检测病毒基因组缺失、插入和重组等现象来研究链转移。然而在这种方法中,大量由异常链转移作用产生PCR引物结合位点缺失的c DNA片段也同样不能用PCR方法扩增而被检测到。逆转录酶(RT)在逆转录病毒的复制、病毒RNA基因组和宿主m RNA基因组的研究中占据着重要的地位。然而由于以上三种传统的研究方法的缺陷,人们目前对逆转录酶的链转移机制、链转移频率、终止特性以及当c DNA片段逆转录至RNA 5’末端时的冗余碱基插入等机制以及对病毒复制的影响都没有深入的了解。因此,针对上述方法的缺陷,我们采用了一种全新的研究系统对链转移机制进行研究。我们分别利用逆转录病毒HIV-1,HIV-2和MLV的逆转录酶,用HIV-2和HAV的部分基因组RNA为模板进行逆转录反应,将逆转录合成的c DNA片段直接进行克隆并测序,并同得到的c DNA序列与原始模板序列进行比对。通过分析所得到的1067条c DNA的碱基序列,我们获得下述有关链转移机制的新发现:1、大多数逆转录片段都沿着RNA模板随机终止,其中72%的序列都与模板的原始序列完全匹配。另外28%的逆转录片段的3’端由于异常链转移产生与模板不匹配的序列。2、异常链转移序列在逆转录过程中与原始模板发生暂时分离,而在模板(RNA模板或c DNA模板)的异常位点匹配并继续延伸。3、93%的异常链转移序列都只含有一次链转移,但是少数逆转录片段会发生两次或者三次异常链转移。重要的是上述这些异常链转移大部分都发生在方向相反的模板上,因此利用传统的方法是检测不到的。4、逆转录过程中由逆转录酶导致的突变大大增加异常链转移发生的概率。5、HIV-2和MLV逆转录酶所导致的异常链转移率远远高于HIV-1逆转录酶所导致的异常链转移率。由于异常链转移的产生,导致大量缺陷病毒基因组的产生。这一现象说明HIV基因组在复制过程中精确性较差,同时也可能解释了为什么在自然感染过程中只有极少量病毒颗粒(0.1%)具有感染活性。相对于HIV-1,HIV-2的高异常链转移率可为该病毒在宿主体内较低病毒载量和导致相对缓慢的疾病发展过程提供理论依据。与此同时,我们对所有1067条c DNA序列的进一步分析发现逆转录片段经常不含有引物序列。它们其起始位点可发生在RNA模板的任何位置,并且这种起始并没有碱基嗜性和RNA二级结构特异性。上述结果表明逆转录酶在逆转录起始不仅使用特定核苷引物还可随机在RNA模板起始逆转录过程。由于本研究中直接对逆转录酶合成的逆转录片段进行克隆和序列分析,因此研究逆转录酶的突变率可不受高错误率PCR的影响。因此我们还利用本实验得到的逆转录序列测定了不同逆转录酶的突变率。结果显示,在该系统条件下HIV-1逆转录酶的突变率(2.9×10-3每个碱基每个复制周期)要远高于以往实验方法得到的突变率(3.4×10-5每个碱基每个复制周期)。这表明以往实验方法可能过低地估计了逆转录酶的突变率,并为进一步研究HIV基因组的高突变性提供依据。本文通过研究逆转录酶的持续合成能力,链转移,随机起始和高突变率等特性得到的新发现将为今后进一步对逆转录酶的生化特性以及逆转录病毒的复制,病毒生物学和致病性等奠定了基础。同时,本文的实验结果也为将来通过增加逆转录酶所固有的高异常链转移率这一特性作为新的药物靶点,进而为研制新型抗逆转录病毒感染的药物提供理论依据。
张宇飞[2]2016年在《绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞中enJSRV囊膜蛋白的细胞生物学作用》文中进行了进一步梳理研究背景：几乎所有哺乳动物的基因组中都包含有很大一部分内源性逆转录病毒(Endogenous retroviruses,ERVs)的基因组,而且这些ERVs在多个物种中发现。它们与胎盘发育的关系密不可分。在绵羊的基因组中至少包含有27株与外源绵羊肺腺瘤逆转录病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)相关的内源性逆转录病毒,这些内源性逆转录病毒被称作内源性绵羊肺腺瘤逆转录病毒(Endogenous jaagsiekte sheep retrovirus,enJSRVs)。JSRV是一个可以引起绵羊发生肺癌的致癌性逆转录病毒。enJSRVs已经被发现在绵羊的生理过程中扮演了重要角色,因为它们能够阻止JSRV的入侵和复制来保护绵羊免受JSRV的感染,另外enJSRVs在绵羊孕体的发育以及胎盘的形成过程中也发挥了重要的辅助作用。enJSRVs勺囊膜基因在雌性绵羊生殖道和孕体中大量表达,并且它们对孕体发育以及胎盘的形成至关重要。研究目的：在本研究中,我们将主要聚焦到enJSRVs囊膜蛋白在绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞发育过程中的细胞生物学作用。同时我们进一步探讨在该领域现有的争议(滋养层细胞融合的机制),并强调未来关于enJSRVs囊膜蛋白的研究方向。研究方法：1.本研究通过酶消化法分离原代绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞(The primary sheep trophoblast cells,STCs),然后应用Percoll及免疫磁珠筛选的方法进行纯化STCs。将携带有人端粒酶逆转录酶(Human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因的真核表达质粒利用电转染的方法转染到纯化后的STCs内,来建立永生化的绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞(Immortalized sheep trophoblast cell line,hTERT-STCs)。2.本研究利用反转录PCR技术从STCs中扩增出完整的enJSRV-env基因及其受体Hyal2基因序列,并通过分子克隆的手段定向插入真核表达载体pEGFP-C1中。同时我们对STCs的电转染条件进行了优化以及STCs的电转效率进行了测定。针对enJSRV-env基因我们设计并构建了具有靶向关系的RNA干扰质粒。并将这些RNA干扰质粒转染到能稳定表达enJSRV-env基因的STCs中,然后通过荧光定量PCR以及Western blot的方法检测其干扰效率3.本研究将构建好的真核表达质粒pEGFP-C1/enJSRV-env及pEGFP-C1/Hyal2分别通过电转染,转染到STCs中,在荧光显微镜下观察enJSRV囊膜蛋白及其受体Hyal2的瞬时表达情况。同时检测高表达enJSRV囊膜基因及通过RNA干扰沉默enJSRV囊膜基因对STCs的细胞融合活性、侵袭性、绒毛膜促性腺激素p亚基(Chorionic Gonadotrophin β-subunit,CG-β).胎盘催乳素(Placental Lactogen,PL)分泌量的影响。4.本研究利用绵羊肺腺瘤病(Ovine pulmonary adenocarcinoma,OPA)病羊肺组织的RNA通过反转录PCR技术克隆完整的外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因(exJSRV-env),并将其通过分子克隆的手段插入真核表达载体pEGFP-C1中。构建好的pEGFP-C1/exJSRV-env真核表达质粒利用PCR、酶切和测序的方法进行鉴定。同时将exJSRV囊膜基因与enJSRV囊膜基因序列进行生物信息学对比分析。将重组质粒pEGFP-C1/exJ SRV-env通过脂质体法转入293T细胞内,观察exJSRV囊膜蛋白在293T细胞中的表达及定位的情况。同时将重组质粒pEGFP-C1/enJSRV-env与pEGFP-C1/exJSRV-env分别转染到NIH3T3细胞内,在显微镜下观察转染后的NIH3T3细胞是否产生转化灶。用软琼脂集落形成实验以及裸鼠致瘤实验分别来检测转染重组质粒pEGFP-C1/enJSRV-env与pEGFP-C1/exJSRV-env的NIH3T3细胞的生长状态。将处于对数生长期的转染重组质粒pEGFP-C1/enJSRV-env与pEGFP-C1/exJ SRV-env的NIH3T3细胞经胰酶消化后,按照每种细胞分别接种6只裸鼠。4周后断颈处死裸鼠,分离皮下肿瘤结节,同时进行石蜡包埋和HE染色。5.从自然感染OPA的绵羊病肺中提取高分子量DNA。同时将高分子量的基因组DNA利用XbaI消化。基因组DNA片段用两次CHEF凝胶电泳分离。通过电洗脱回收在10kb～40kb范围的DNA片段,连接到CopyControl pCC 1 BAC克隆载体上。连接反应结束后,将透析的连接产物利用基因脉冲XcellTM系统导入TransforMax EPI300感受态大肠杆菌中。最后,将大肠杆菌涂布在含有IPTG 100μg/mL.氯霉素12.5μg/mL和X-gal 40μg/mL的固体LB平板上并在37℃下孵育16 h。用无菌牙签挑取白色克隆放入含有80 mL LB培养基的96孔板中,在37℃下温育过夜直至培养液变浑浊。我们通过设计混合池系统并利用PCR的方法快速筛选,这样可以减少BAC文库的筛选工作量。利用特异性的gag,pro,pol和env的引物来筛选BAC文库中含有enJSRV基因组的BAC克隆。研究结果：1.本研究建立的hTERT-STCs能稳定表达hTERT基因,细胞连续传代一年并持续增殖无衰老的迹象。hTERT-STCs仍然拥有正常的STCs的生物学特性,如表达特定的细胞内标记物细胞角蛋白7(CK-7)、能分泌绵羊绒毛膜促性腺激素以及绵羊胎盘催乳素,并且持续表达enJSRVs囊膜基因。Transwell细胞侵袭性试验表明hTERT-STCs仍然拥有类似正常的原代绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞的侵袭特性。hTERT-STCs仍具有接触抑制性,在软琼脂内不能生长,同时也没有裸鼠致瘤性。2.本研究成功构建了真核表达质粒pEGFP-C1/enJSRV-env及pEGFP-C1/Hyal2。研究发现绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞在脉冲电压150 V,脉冲时间5 ms,电击次数2次,间隔时间 50 ms时电转染效率最高。重组干扰质粒pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR-enJSRV-env-1, pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR-enJSRV-env-2,pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR-e nJSRV-env-3,pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR-enJSRV-env-4,pcDNA6.2-GW/ EmGFPmiR-Negative-shRNA构建成功。荧光定量RT-PCR检测结果发现,将正常对照组细胞的enJSRV-env mRNA表达量作为参照,pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR-Negative-shRNA组及各RNA干扰质粒组的enJ SRV-env mRNA相对表达量分别为0.985±0.015、0.581±0.006、0.179±0.037、0.346+0.034和0.403±0.044。Western blot结果发现,RNA干扰沉默enJSRV囊膜基因的enJSRV囊膜蛋白表达量与空白和阴性对照组比较显著下降。以上实验数据充分表明pcDNA6.2-GW/Em GFPmiR-enJSRV-env-2的干扰效率最强。3.本研究发现转染pEGFP-C1/enJSRV-env质粒后的STCs及共转染pEGFP-C1/enJSRV-env与pEGFP-C1/Hyal2后的STCs,发生细胞融合的几率增大,平均每个视野分别可以观察到增加了20.44%±7.79%和24.09%±10.65%个STCs。转染pEGFP-C1/enJSRV-env的STCs的侵袭性明显增强,转染pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR/enJRSV-env-shRNA-2干扰质粒的STCs侵袭性明显减弱。然而转染pEGFP-C1/enJSRV-env, pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR/enJRSV-env-shRNA-2质粒的STCs的CG、PL分泌量差异不显著。4.本研究结果发现pEGFP-C1/exJSRV-env真核重组质粒构建成功。通过对exJSRV ENV蛋白的氨基酸序列比对研究发现该ENV的CT区内包含有一个exJSRV特有的YXXM基序。通过对enJSRV ENV蛋白的氨基酸序列比对研究发现该ENV的CT区内没有YXXM基序。系统进化树分析发现我们得到的exJSRV-env基因属于exJSRV。利用生物信息学软件对比研究exJSRV囊膜蛋白与exJSRV囊膜蛋白质的理化性质、功能和结构。ExJSRV ENV的亚细胞定位研究发现大量ENV出现在细胞膜上。在NIH3T3细胞中转染pEGFP-C1/exJSRV-env质粒后,细胞可在软琼脂中生长并产生集落,同时没有了细胞接触抑制性,在裸鼠体内可以产生肿瘤块。这些结果充分表明exJSRV囊膜蛋白促使NIH3T3细胞恶性转化。然而在NIH3T3细胞中转染pEGFP-C1/enJSRV-env质粒后,细胞不能在软琼脂中产生集落,细胞保持接触抑制性,接种裸鼠体后不能产生肿瘤结节。说明exJSRV ENV不能促使NIH3T3细胞恶性转化。5.本研究成功构建了OPA病羊肺组织基因组BAC文库,OPA病羊肺组织基因组细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)文库有三个子文库(1：文库_10K,2：文库_25K,3：文库_40K)构成,共含有106500个克隆。我们从OPA病羊肺组织基因组BAC文库中随机挑取了526个白色的BAC克隆鉴定插入片段大小,发现文库的空载率为0.38%,插入的DNA片段以20～25kb为主。同时建立了高效快速的PCR筛选系统。用4对enJSRV特异性的PCR引物进行文库筛选,并从OPA病羊肺组织基因组BAC文库中筛选得到了一株阳性的BAC克隆。结论：本研究中成功建立了hTERT-STCs细胞系,它可以作为细胞模型来研究胎盘绒毛膜滋养层细胞的分泌功能、侵袭性的特点以及enJSRVs囊膜基因可能的生物学功能。同时还成功构建了真核表达质粒pEGFP-C1/enJSRV-env, pEGFP-C1/Hyal2以及 pEGFP-C1/exJSRV-env,筛选出干扰效率最强的干扰质粒pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR-enJSRV-env-2。并首次发现enJSRV囊膜蛋白可以促进STCs发生细胞融合以及增强细胞侵袭性。另外我们成功构建了OPA病羊肺组织基因组BAC文库,并从OPA病羊肺组织基因组BAC文库中筛选得到了一株阳性的BAC克隆。
陈世优[3]2017年在《免疫调节因子ABIN1抑制HIV-1复制的机制研究》文中认为获得性免疫缺陷综合征(艾滋病)是在全世界范围内广泛流行的一种疾病,造成这种疾病的病因学源头是人免疫缺陷病毒(HIV)的感染。HIV是一种逆转录病毒,它包括HIV-1和HIV-2,其中HIV-1是造成疾病的主要病毒亚型。作为逆转录病毒,HIV-1在进入细胞后首先整合到宿主细胞的染色体中,根据细胞内的环境,它可以启动复制周期,也可以变成潜伏感染状态,在合适的时机爆发,引起机体的病理损伤。HIV-1主要通过血液、体液、性和母婴垂直传播。在当前HIV-1感染是无法治愈的,是生命科学研究的热点。A20-BindingInhibitorofNF-κB activation(ABIN1)是一个重要的免疫调节因子,它与人体免疫系统的炎症反应关系密切。早先有报道,ABIN1参与了调控HIV-1的复制过程,但是其机制并不清楚。在本研究中,我们发现,ABIN1是一个HIV-1转录的抑制因子,因为ABIN1蛋白水平的下调无论是在Jurkat细胞系,还是人原代CD4+ T细胞中都能促进HIV-1的复制。在病毒的生活周期过程中,对ABIN1基因表达进行敲低可特异性地促进已经整合到宿主染色体的HIV-1基因组的转录,对此前的病毒侵染过程则没有影响。实验表明,ABIN1可以特异性地抑制原癌基因HDM2催化的Tat在K71位点发生的K63类型的泛素化,而这一位点的泛素化对于Tat的转录激活功能是非常重要的。而且,ABIN1中UBAN结构域的泛素链结合活性对此抑制作用是必需的。免疫荧光实验证明ABI1N可以通过将HDM2阻滞在细胞质内,抑制它对Tat的泛素化作用。我们最终得出结论,ABIN1是一个通过调节Tat泛素化从而抑制HIV-1 mRNA转录的内源性抑制蛋白。
张继文, 杨桂连, 王春凤[4]2010年在《逆转录病毒载体的应用现状及前景展望》文中研究表明着重介绍逆转录病毒载体在基因治疗、外源基因表达、RNA干扰三方面的最新应用现状并对其应用前景进行展望,同时介绍了逆转录病毒载体存在的应用缺陷。
周建华[5]2008年在《携带口蹄疫病毒（FMDV）前导蛋白基因逆转录病毒载体的构建及其在牛肾细胞中的表达》文中研究指明口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)引起的牛、羊、猪等偶蹄动物的一种急性接触性传染病,发病率很高,并能形成大范围流行,给流行的国家和地区造成极大的政治、经济损失。随着分子生物学相关技术在口蹄疫病毒研究中的应用,研究者对口蹄疫病毒基因组结构和功能有了不同程度的了解。其中,口蹄疫病毒的毒性蛋白对于宿主细胞的毒性作用已经成为国内外研究的热点之一。本研究以O型口蹄疫病毒为研究对象,克隆了O型FMDV OA/58毒株前导蛋白(L~(pro))编码基因Lab。利用Swiss-pdbViewer蛋白质分析软件模拟了L~(pro)的3D模型,发现其功能活性位点可能是第144位的赖氨酸(Lys)、148位的组氨酸(His)和163位的天冬氨酸(Asp)。并且构建了含有Lab基因的重组逆转录病毒载体pBPSTR1-Lab。运用脂质体转染法使该重组质粒与pVSV-G质粒共转染于GP2-293包装细胞中,收集假病毒。通过电镜观察,发现直径约为60nm,外有囊膜,衣壳呈六边形的病毒粒子存在。用假病毒感染牛肾细胞(bovine kidney cell ,MDBK),嘌呤霉素抗性筛选阳性细胞并且加入四环素抑制Lab基因的表达。通过12天嘌呤霉素的筛选,待抗性克隆形成时,利用有限稀释法挑取单个抗性细胞克隆。将单个抗性克隆分别扩大培养后,经除去四环素诱导整合于宿主细胞基因组中的Lab基因表达,挑选出能在较短时间内使MDBK细胞发生病变的阳性细胞株进行传代培养。利用PCR手段,证实Lab基因被整合到MDBK细胞基因组中,并能稳定地随宿主细胞传代;利用RT-PCR检测手段,证实Lab基因在无四环素的情况下能够被转录。将第35代阳性细胞除去四环素后进行诱导表达,收集均发生病变的细胞,应用Wensten-blotting检测手段鉴定L~(pro)的表达。结果显示,目的蛋白与O型FMDV抗血清能特异性反应。这表明,目的蛋白具有与O型FMDV感染宿主细胞后产生的L~(pro)相同的活性。本试验利用可调控逆转录病毒载体介导基因转移技术,将O型FMDV的Lab基因整合于MDBK细胞基因组中,成功建立了可稳定表达L~(pro)目的基因的转基因细胞株,为今后研究L~(pro)或其他毒性蛋白提供了新的思路。
石剑[6]2014年在《斑马鱼内源性逆转录病毒囊膜蛋白的结构和功能》文中研究指明Syncytin蛋白是内源性逆转录病毒的囊膜蛋白。Syncytin基因在几百万年前就被宿主捕获,在不同的宿主体内经过漫长的演化,整合到宿主的基因组内,在宿主内以内源蛋白的形式表达,并行使着不同的功能。这些蛋白在宿主的发育和免疫抑制及调控中都能起到极其重要的作用。在此前的研究中,很多的syncytin蛋白(如人的syncytin-1和2蛋白,鼠的syncytin-A和B蛋白,兔的syncytin-Ory1蛋白,狗和猫各自的syncytin-Car1蛋白,和其他数十种动物的syncytin蛋白)被发现能促进细胞和细胞的膜融合,形成合胞体；或者在假病毒体系中起到促进病毒膜和细胞膜的融合的作用。在近来的一些研究中我们发现,斑马鱼(zebrafish)的一种逆转录病毒(zebrafish endogenous retrovirus, ZFERV)中,有一个保持着完整的开放阅读框的囊膜蛋白基因,它在斑马鱼的胸腺中高表达,同时在其他的组织内也有一定程度的存在,我们把它称为syncytin-ZF (SynZF),通过序列比对和分析,我们发现SynZF的结构和其它的己知syncytin蛋白结构非常的相似,包括表面亚单位(surface subunit, SU)和跨膜亚单位(transmembrane subunit, TM)。尤其是通过软件分析后,发现在其TM区的N末端和C末端分别有一个七肽重复序列,我们称其为N-terminal heptad repeats (NHR)和C-terminal heptad repeats (CHR)。我们原核表达了从SynZF的459残基到567残基(SynZF N+C),含有预测的NHR、CHR和天然的柔性的连接部分,用以分析SynZF的结构特征。我们在研究中发现：在接近自然条件下(PBS,pH7.0),通过分子筛凝胶层析得到的SynZFN+C的分子量为其单体的三倍,这表明SynZF N+C是作为三聚体存在的,这一结果用化学交联得到了进一步验证；用圆二色光谱仪检测SynZF N+C的二级结构,发现它富含α-螺旋结构,并且具有极高的热稳定性(Tm值高于90度)；在酸变性下,SynZF N+C会发生缓慢的二级结构解离,呈现出典型的“S”型曲线,这说明SynZF N+C蛋白可能在中性条件下就能够形成稳定的构象,而不需要酸性条件诱导；通过蛋白酶K有限酶解和对酶解产物的质谱分析,我们得到了一个SynZF N+C核心序列,这可能是在SynZF N+C三聚体构象中,NHR和CHR结合的区域。这一结果与通过同源模建所预测三维结果相一致。进一步的实验中,我们突变了SynZF的CX6CC序列中的3个半胱氨酸残基,通过对比野生型和突变体的二级结构热稳定性,认为该柔性连接部分和其中的二硫键在整个结构中起着重要的作用。根据得到的在斑马鱼中的SynZF的融合结构特征后,我们也正在构建SynZF体外诱导细胞膜融合的模型,试图阐释SynZF在斑马鱼体内的促融合的生理功能或者是SynZF在ZFERV病毒几百万年前整合进入斑马鱼时所采取的分子机制。期望根据这NHR和CHR序列设计抑制膜融合的多肽抑制药物,建立起类似于抗HIV多肽药物T-20或者其他抗体药物的筛选体系,为病毒入侵细胞的分子机制研究和膜融合相关疾病的防治等多个方面提供一条新途径。
许建[7]2008年在《基于逆转录病毒载体的高效表达系统的建立和应用》文中研究说明逆转录病毒表达系统是近年来新兴起的一种高效表达系统,它由逆转录病毒载体,包膜蛋白载体和包装细胞系构成。由于逆转录病毒和宿主细胞基因组的重组倾向于发生在转录活性区,口炎疱疹病毒G蛋白能有效扩大逆转录病毒感染宿主细胞的范围、提高逆转录病毒的感染效率。与质粒转染等其他传统的外源基因介导方法相比,逆转录病毒表达系统可以大大提高获得高效表达外源基因细胞系的几率。本课题的主要研究目标是建立和评价以逆转录病毒载体介导的外源基因高效表达系统,利用基于逆转录病毒载体的外源基因表达技术构建高效表达rhPC的HEK293细胞系。同时,拟从表达调控元件着手,优化逆转录病毒载体、提高逆转录病毒表达系统的效率。将绿色荧光报告基因EGFP构建到逆转录病毒载体PQCXIN中,用逆转录病毒载体PQCXIN/EGFP和包膜蛋白质粒pVSV-G共转染包装细胞GP2-293,获得感染滴度达到1.61×107GTU/ml的PQCXIN/EGFP重组病毒。分别用PQCXIN/EGFP病毒感染和pcDNA3.1/EGFP质粒转染HEK293细胞和CHO-K1细胞,采用流式细胞仪分析EGFP阳性细胞的相对荧光强度,PQCXIN/EGFP病毒感染获得的EGFP阳性细胞的相对荧光强度约为pcDNA3.1/EGFP质粒转染的EGFP阳性细胞的相对荧光强度的2倍。逆转录病毒的感染滴度和感染效率是影响逆转录病毒载体介导外源基因表达效率的重要因素。采用分步转染法,即先用逆转录病毒载体PQCXIN/EGFP转染GP2-293细胞,再用pVSV-G转染EGFP表达效率较高的GP2-293细胞,能在一定程度上提高PQCXIN/EGFP病毒的感染滴度。浓度为4～8μg/ml的聚凝胺有利于提高细胞对PQCXIN/EGFP病毒的敏感性、提高感染效率。以EGFP的荧光强度为评价指标,考察PQCXIN/EGFP病毒多轮感染HEK293细胞对EGFP表达效率的影响。经过4轮PQCXIN/EGFP病毒感染的HEK293细胞的EGFP表达水平比只经1轮PQCXIN/EGFP病毒感染的HEK293细胞提高了3.5倍左右。同时,经4轮病毒感染获得的混合克隆在多次传代后的EGFP表达水平只降低了22%;经pcDNA3.1/EGFP质粒转染的HEK293细胞混合克隆在多次传代后的EGFP表达水平下降了69%。结果表明,PQCXIN/EGFP病毒的反复多轮感染能有效地提高感染细胞的EGFP表达水平和稳定性。将rhPC基因替换EGFP基因,进一步比较PQCXIN/rhPC病毒感染和pcDNA3.1/rhPC质粒转染HEK293细胞的外源基因表达效果。重组病毒PQCXIN/rhPC感染得到的HEK293细胞的rhPC表达水平为326.4ng/106cells/day, pcDNA3.1/ rhPC质粒转染HEK293细胞的rhPC表达水平仅为8.6ng/106cells/day。用EGFP基因代替病毒载体PQCXIN/rhPC中的neo基因,通过IRES与rhPC基因连接,构建PQCXIN/rhPC/EGFP载体,使EGFP和rhPC的表达水平形成关联。借助流式细胞仪分选EGFP表达水平较高的细胞,经克隆化和ELISA检测筛选高效表达rhPC的HEK293细胞,获得了rhPC表达水平为10.7μg/106cells/day的HEK293细胞系。为了进一步提高逆转录病毒表达系统的效率,以EGFP为报告基因,采用质粒载体pcDNA3.1考察包括启动子、增强子、位置效应元件和RNA稳定元件等在内的表达调控元件对EGFP表达效率的影响。转染含RNA稳定与输出元件RESE的质粒载体pcDNA3.1 (pcDNA3.1/EGFP/RESE)的HEK293细胞的EGFP的表达水平提高了1.58倍。进一步通过tPA、Pro-uk和rhPC验证RESE的作用,RESE均不同程度地提高了tPA、Pro-uk和rhPC的表达效率。其中,rhPC的表达水平提高了近5倍,并经过单克隆化得到了表达水平为16.9μg/106cells/day的HEK293细胞系。将RESE构建到病毒载体中,RESE对逆转录病毒载体介导的外源基因表达效率的影响的考察仍在进行中。以上研究结果不仅表明逆转录病毒介导的外源基因表达系统是一种极具发展和应用潜力的外源基因高效表达系统。同时也为rhPC的开发研究打下了一定的基础。
赵可[8]2016年在《细胞因子SAMHD1生物学功能的研究》文中研究指明包含SAM和HD结构域的蛋白(即SAMHD1蛋白)是一个非常独特的蛋白。它是目前为止唯一一个已知可以通过水解作用直接调控细胞d NTP水平的酶,它是可以抑制包括逆转录病毒等多种病毒感染的抗病毒因子,它还是人体自身免疫疾病AGS综合症和家族性红斑狼疮的相关蛋白。这一切都说明,SAMHD1在人体细胞中的地位举足轻重。然而,人们对SAMHD1蛋白功能的理解并不全面。首先,未有充足的证据表明d NTPase活性在SAMHD1抑制逆转录病毒感染的作用;其次,作为一种干扰素诱导蛋白,SAMHD1在干扰素诱导出的抗病毒活性中扮演何种角色也尚不清楚;再者,鉴于逆转录病毒和逆转录元件复制过程的相似性,SAMHD1能否调控细胞内源逆转录元件活性也待考察。这些都是本论文在立题时所要解答的问题。本论文通过对SAMHD1生物学功能的系统研究,得到以下成果:1.SAMHD1可能并不参与干扰素所诱导的抗病毒活性干扰素可以在外周血免疫细胞中诱导出很强的抗病毒活性。在体外实验中,类似的现象可以在单核细胞THP-1细胞中得以重复。本论文的研究发现,IFNα和PMA在THP-1细胞中都可以诱导出抗病毒活性,但是IFNα的诱导活性更为强大。有趣的是,无论IFNα还是PMA都无法诱导THP-1细胞中SAMHD1蛋白水平的增多。后续报道表明,PMA可以恢复SAMHD1蛋白的抗病毒能力,而Vpx蛋白则可以诱导SAMHD1蛋白的降解。因此,表达Vpx蛋白的野生型SIV可以突破PMA在THP-1中诱导出的抗病毒活性。但是,无论是HIV-1、SIV、还是SIVΔvpx都无法突破IFNα的作用。实际上,SIV根本无法在IFNα刺激的THP-1细胞中诱导SAMHD1蛋白的降解,一方面说明逆转录病毒无法膜融合作用将核心颗粒释放到IFNα刺激的THP-1细胞中,另一方面也说明在SAMHD1蛋白发挥作用之前,IFNα已经激活了其它免疫通路来防止THP-1细胞被感染。与此同时,我们有证据显示,即使在分裂细胞中,SAMHD1也参与细胞对逆转录病毒的抑制。2.SAMHD1是全新的逆转录元件调控因子逆转录元件是真核细胞内唯一利用逆转录活性实现自身复制的DNA元件,其活性和血友病以及癌症的发病相关。有迹象表明,逆转录元件的活性与人体自身免疫疾病同样存在联系。作为AGS相关蛋白的SAMHD1很可能通过d NTPase活性抑制逆转录元件的逆转录过程来抑制逆转录元件活性并调控细胞免疫。结果表明,SAMHD1确实可以有效地抑制多种逆转录元件的活性,并且这种抑制确实是通过抑制逆转录元件的逆转录活性实现的。然而,细致的分析则表明,SAMHD1抑制逆转录元件并非通过d NTPase活性,而主要是通过特异性诱导LINE1 ORF2p蛋白的降解实现的。对不同物种的SAMHD1蛋白抗LINE1活性的试验证明SAMHD1的这一活性在哺乳动物中是保守的。而AGS相关突变则在不同程度上削弱了SAMHD1对逆转录元件活性的抑制能力,说明AGS相关蛋白、逆转录元件、细胞免疫激活三者存在潜在的联系。3.四聚体是SAMHD1发挥生物学功能的必要条件SAMHD1的N末端截短突变体109-626和120-626在抑制LINE1活性的功能上存在极大不同。这一现象引发了我们对两者结构差异的兴趣,并最终导致了SAMHD1四聚体形式的发现。本论文随后考察了四聚体形式对SAMHD1各个生物学功能的意义。结果发现,单体突变体D137A仅保留了5%的d NTPase活性。在U937细胞中,D137A几乎无法抑制逆转录病毒的感染。而在HEK293T细胞中,单体D137A和二聚体120-626都不再可以有效地抑制LINE1的活性。这说明四聚体是SAMHD1发挥生物学功能的必要条件。更让人惊讶的是,四聚体还是SAMHD1被Vpx诱导降解的前提条件。这一切都说明了四聚体形式对SAMHD1蛋白的重要意义。综上,本论文的研究结果从多个不同的角度深入考察了SAMHD1蛋白在细胞中的生物学功能,揭示了SAMHD1参与调控逆转录元件活性的全新功能,发现了SAMHD1蛋白参与蛋白稳定性调控的证据,并验证了四聚体形式是SAMHD1发挥全部生物学功能的必要条件。这些发现对理解SAMHD1在细胞中的活性提出了更多的信息,为探索SAMHD1作为抗病毒因子的功能提供了更多线索,对解析SAMHD1调控细胞免疫系统的机制具有指导意义,并将为防治艾滋病和人体自身免疫疾病手段的研发提供分子机制和靶点。
张秋婷[9]2009年在《逆转录病毒为载体制备转基因鸡的初步研究》文中研究说明为了建立更加完善的逆转录病毒法生产转基因鸡的技术体系。本研究选用增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)为外源基因(亦为报告基因)、pEASY-T3为克隆载体、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)为骨架的puro-pBabe质粒为表达载体、含有疱疹性口腔炎病毒G蛋白基因的pVSV-G质粒为包装载体、239 10A1细胞为包装细胞。在PCR扩增出EGFP基因序列的基础上,分别构建克隆载体pEASY-T3-EGFP和重组表达载体puro-pBabe-EGFP。采用磷酸钙转染法与竞争包装法相结合的方法将puro-pBabe-EGFP与包装载体pVSV-G共同转入239 10A1细胞中以产生逆转录病毒。病毒原液经滴度检测后,采用低温超速离心的方法浓缩200倍。浓缩病毒液以注射的方式导入鸡胚的囊胚下腔进行原始生殖细胞(PGCs)的鸡胚内转染,然后将鸡胚置于孵化箱中进行孵化。待孵化5.5d时,随机选取试验鸡胚,提取其全胚基因组DNA进行检测。其结果为:1)克隆载体的PCR鉴定结果以及测序结果与理论序列的比对结果表明,已成功构建出与预期设计完全一致的克隆载体pEASY-T3-EGFP;2)表达载体的PCR鉴定结果、测序结果与理论序列的比对结果以及表达载体瞬转入胎牛中肾成纤维细胞中的表达结果表明,已成功构建出与预期设计完全一致并且具有体外表达EGFP活性的重组表达载体puro-pBabe-EGFP;3)由病毒原液的滴度测定数据计算出试验得到的逆转录病毒滴度为2.3×10~5/ml,结果表明采用磷酸钙转染法与竞争包装法相结合的方法包装出高滴度的逆转录病毒;4)PCR检测鸡胚基因组DNA整合EGFP基因的结果为,有75%的鸡胚呈阳性;在PCR检测基础上进行Southern杂交检测,结果有66.7%的鸡胚呈阳性。表明包装逆转录病毒已经将EGFP基因整合到基因组中,同时也证明了以MoMLV为骨架的转录病毒载体可感染不同物种来源的细胞。综上所述,本研究结果不仅为采用逆转录病毒感染法制备转基因鸡提供了可行性依据,同时也为进一步证明逆转录病毒感染法是一种可应用于多种动物的高效转基因工具提供了依据。此外,本研究结果为深入开展转基因鸡与以鸡蛋为生物反应器相关的转基因家禽的研究奠定了基础。
曹碧云[10]2016年在《抗HIV化合物SJP-L-5的结构改造与活性研究》文中研究指明艾滋病(AIDS)是一种由人类免疫缺损病毒(HIV-1)引起的全球性传染病。HIV-1是一种逆转录病毒,在人体细胞中主要经过逆转录、整合、转录翻译完成病毒复制,而其逆转录过程须由病毒特异性的逆转录酶完成。基于病毒逆转录酶在其复制周期中的重要作用以及人体细胞中没有这种酶,设计合成针对病毒逆转录酶的抑制剂成为了抗HIV-1研究的热点。逆转录酶抑制剂可分为两类,分别是核苷类(NRTIs)和非核苷类(NNRTIs)逆转录酶抑制剂,而非核苷类抑制剂活性更强、毒性更低、选择性也更好。目前,临床上主要应用高效抗逆转录病毒疗法(HAART)来改善病人的临床治疗效果,NNRTIs是其重要组成部分。但HIV-1极易产生变异形成耐药毒株,从而制约临床药物治疗的效果。因此,研发高效低毒、抗耐药性强的新型NNRTIs是目前抗艾滋病药物研究的重要方向之一。五味子科植物是一种有悠久应用历史的传统中药材,具有护肝解毒、止咳祛痰、抗氧化、抗肿瘤等作用。近几年研究发现,五味子科植物中所含的联苯环辛烯类木脂素对HIV-1病毒复制早期还具有显著的抑制作用,能够抑制病毒在细胞内的复制。课题组与中科院昆明植物研究所合作合成了一些与联苯环辛烯类木脂素结构类似的化合物,并从中筛选出化合物SJP-L-5,其活性超过天然产物并且结构更加简单,合成路线也比较短。但SJP-L-5的水溶解性不是很好,同时对其进行药代动力学研究时发现其代谢速度过快,这些会对进一步的药物开发研究产生影响。基于以上的研究分析,本论文确定了以SJP-L-5结构为基础,保留联苯胺结构,对其进行结构改造,得到了一系列新化合物。本论文一共包括四章。第一章综述了艾滋病现状及抗HIV药物研究进展,重点介绍了非核苷类逆转录酶抑制剂的研究进展。第二章报道了基于化合物SJP-L-5结构的衍生物的合成及其活性研究。合成研究主要完成了以下三个方面的工作：一是以SJP-L-5为起始原料,通过水解得到其羧酸衍生物再通过缩合反应得到目标化合物；二是以SJP-L-5为起始原料,通过反应得到其胺类衍生物再通过缩合反应得到目标化合物,三是由3,4-(亚甲基二氧)-苯乙酸、3,4,5-三甲基苯乙酸、4-溴-N,N-二甲基苯胺和对溴苯胺出发,通过合成得到了基于化合物SJP-L-5联苯胺结构的衍生化合物。之后对这些化合物进行了抗HIV-1活性研究,发现大部分衍生物对HIV-1病毒的抑制活性和对健康细胞的毒性都有所增强,故对HIV-1的治疗指数相对较低。第三章记录了实验的具体操作和化合物的波谱数据。第四章对本文的主要工作进行了总结。总之,本文共合成得到了类似SJP-L-5联苯胺结构的40个新化合物,并对其进行了活性研究。尽管尚未发现具有较高抗HIV治疗指数的化合物,但也为此类化合物的后续研究提供了指导依据。
参考文献：
[1]. 逆转录酶的功能性研究[D]. 李晓军. 吉林大学. 2016
[2]. 绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞中enJSRV囊膜蛋白的细胞生物学作用[D]. 张宇飞. 内蒙古农业大学. 2016
[3]. 免疫调节因子ABIN1抑制HIV-1复制的机制研究[D]. 陈世优. 武汉大学. 2017
[4]. 逆转录病毒载体的应用现状及前景展望[J]. 张继文, 杨桂连, 王春凤. 生物技术. 2010
[5]. 携带口蹄疫病毒（FMDV）前导蛋白基因逆转录病毒载体的构建及其在牛肾细胞中的表达[D]. 周建华. 中国农业科学院. 2008
[6]. 斑马鱼内源性逆转录病毒囊膜蛋白的结构和功能[D]. 石剑. 武汉大学. 2014
[7]. 基于逆转录病毒载体的高效表达系统的建立和应用[D]. 许建. 中国人民解放军军事医学科学院. 2008
[8]. 细胞因子SAMHD1生物学功能的研究[D]. 赵可. 吉林大学. 2016
[9]. 逆转录病毒为载体制备转基因鸡的初步研究[D]. 张秋婷. 东北林业大学. 2009
[10]. 抗HIV化合物SJP-L-5的结构改造与活性研究[D]. 曹碧云. 云南大学. 2016
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