（1克拉玛依市独山子人民医院 新疆 克拉玛依 833600）
（2石河子大学第一附属医院 新疆 石河子 833008）
【摘要】 目的：探讨孕中期血清筛查联合无创性产前基因在唐氏综合征患儿诊断中的应用。方法：选择2011年1月至2014年1月来我院产科门诊进行常规产前检查的孕中期孕妇2236例，清晨抽取静脉血进行血清筛查甲胎蛋白（AFP）和游离β-绒毛膜促性腺激素（β-HCG），并用产科筛查软件Multicalc计算唐氏综合症（DS）、18-3体综合症（ES）和神经管缺陷（NTD）患病风险切割值；分选胎儿有核红细胞（FNRBC），并进行基因分型分析，追踪随访孕妇妊娠结局，收集胎儿患病情况。结果：2236例孕妇中筛查出高风险孕妇63例，其中DS高风险36例，ES高风险16例，NTD高风险11例；2173例低风险孕妇的基因均为正常二倍体1:1基因型，36例DS高风险孕妇检出11例三体型基因型，16例ES高风险孕妇检出异常基因型7例，其中3体型4例，嵌合体型2例，易位型1例，11例NTD高风险孕妇均为正常二倍体型；妊娠随访结果11例基因型异常DS高风险孕妇，2例流产，对流产胎儿和活产胎儿进行细胞核分型均确诊为DS；7例基因型异常的ES高风险孕妇，三体型和嵌合体型各出现1例流产，对流产胎儿和活产胎儿进行细胞核分型均确诊为DS，11例NTD高风险孕妇，均正常娩出胎儿，对活产胎儿进行细胞核分型确诊1例NTD，低风险孕妇活产或流产胎儿未检出基因型异常。结论：血清筛查联合无创产前基因诊断操作简便、经济，筛查结果准确可靠，可以用于临床推广。
【关键词】 唐氏综合症；胎儿有核红细胞；基因诊断；孕中期；筛查
【中图分类号】R714 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）30-0128-03
Application of serum screening and gene diagnosis of Down’s syndrome in the second trimester of pregnancy
【Abstract】Objective To explore application of serum screening and gene diagnosis of Down’s syndrome in the second trimester of pregnancy. Methods 2236 cases of women in the second trimester of pregnancy from Jan. 2011 to Jan. 2014 were collected to our study. Veinal blood was drawn for detection of serum AFP and freeβ-HCG, risks of Down syndrome (DS), Edwards Syndrome (ES) and neural tube defect (NTD) were assessed by the obstetric screening software. Fetal nucleated red blood cells were sorted and enriched from maternal peripheral blood, than gene type of FNRBC would be analysis by PCR. All of the pregnancy women were follow up to pregnancy outcome. Results Among 2236 cases of pregnant women,63 cases were at high risk of DS, 36 cases for ES, and 16 cases for NTD, 11 cases of DS high risk pregnancy women were detected with trisomic gene type, 7 cases of ES high risk pregnancy women were detected with abnormal gene type, 4 cases for trisomic gene type, 2 cases for chimeric gene type, 1 cases for metathetic gene type, other of the pregnancy women were detected none of abnormal gene type. The fetal and live births were identified by the nuclear typing, results showed 11 cases of DS high risk pregnancy womenwith trisomic gene type were diagnosis with DS, 7 cases of ES high risk pregnancy with abnormal gene type were diagnosis with ES, and there was 1 more NTD cases had been detected. Conclusion Operation of serum screening and gene diagnosis of Down’s syndrome are convenient and economical, screening results are accurate and reliable, worthy be application for clinical use.
【Key words】 Down’s syndrome;Fetal nucle trisomic ated red blood cell; Gene diagnosis; The second trimester; Screening
唐氏综合征（Down syndrome，DS）是染色体异常而导致的疾病[1]，1959年发现DS患者的染色体组中多了一条21号常染色体，故又称21-三体综合征[2]。60%患儿在胎内流产，存活者有明显的智能落后、特殊面容、生长发育障碍和多发畸形，故也被称为先天愚型[3]。目前尚无有效的治疗方法，据统计，每出生1例DS患儿，造成约25万元的社会经济负担，而我国每年用于DS的医疗费用超过20亿元[4]。因此，积极开展安全有效预的防措施及早发现DS胎儿，立即终止妊娠是减少家庭和社会负担的重要举措[5]。近年来，唐氏综合症的筛查与检测方法发展迅速，其中怀孕中期进行母亲血清筛查最为典型，同时联合影像学、基因和细胞遗传学检测等手段同时进行，具有较高的诊断价值。本研究探究了孕中期给予母亲血清筛查联合产前基因检测对唐氏综合症胎儿的诊断价值，现报告如下。
1.材料与方法
1.1 临床资料
选择2011年1月至2014年1月来我院产科门诊进行常规产前检查的孕中期孕妇2236例，孕周14～20+6周，平均（16.7±3.8）周，孕妇年龄为19～42岁，平均为（27.41±6.38）岁，所有孕妇均为单胎妊娠，孕妇健康，排除患有严重贫血、心脏和肝肾功能障碍者。所有患者均签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1血清生化指标检测 清晨空腹时，抽取孕妇静脉血4ml，收集于EDTA抗凝管中，室温静置30min，3000rpm离心5min，取血清，储存于-80℃冰箱中，待样本收集完成后统一检测。血清甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、游离β-绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrop，β-HCG）采用时间分辨荧光免疫分析法检测，试剂盒购自试剂盒均购自德国罗氏诊断产品（上海）有限公司，操作按说明书进行。
1.2.2胎儿有核红细胞基因诊断 抽取孕妇肘静脉血8ml，收集于EDTA抗凝管中，立即颠倒混匀防止凝血，采血当天进行处理。用无菌磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline，PBS，pH=7.4）按1:1体积比稀释血液，用移液器轻柔吹打混匀，取相同体积的淋巴细胞分离液于离心管中，将稀释后的血液沿管壁缓缓加入，3000rpm离心20min，弃上层血浆，吸取中间层的单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC），得到的细胞用无菌PBS洗涤，2400rpm离心10min，弃上清，得到的细胞用1%多聚甲醛固定15min，用无菌PBS洗涤，2400rpm离心10min，弃上清，加入阻断非特性异性抗体IgG,反应5min，洗涤2次，用无菌PBS重悬细胞，调整浓度为1.0×107/ml，分别按体积比0.5μl/ml和0.1μl/ml加入抗体PE-GPA和FITC-CD71原液，避光冰浴45min，无菌PBS洗涤2次，2400rpm离心5min，将细胞重悬于500ulPBS中，置流式管中混匀，4℃冰箱避光保存，以备流式细胞术分选。在流式细胞仪上对样品进行分选，目标细胞为FITC和PE双标记阳性细胞，得到的细胞即为母血胎儿有核红细胞（fetal nucleated red blood cell，FNRBC），用瑞氏染色法染色后，在倒置显微镜下用毛细管挑选FNRBC，移入EP管中，提取细胞DNA。得到的PBMC DNA进行单细胞靶基因（STR位点）扩增和巢式PCR反应，对STR位点进行PCR分型。
1.3 诊断标准
孕妇孕周全部由产科医生核算，如有孕周无法推算的，经B超核算，收集孕妇年龄、体重、孕周、糖尿病及吸烟等相关因素结合AFP和β-HCG水平，用产科筛查软件Multicalc计算出胎儿患DS,18-3体综合症（Edwards Syndrome，ES）的风险切割值，DS高风险切割值为1:270，ES高风险切割值为1:350，超过切割值为相应疾病高危孕妇，神经管缺陷（neural tube defect，NTD）参考AFP中位数倍数（multiple of median，MOM），AFPMOM＞2.5为NTD高风险孕妇[6]。对高风险孕妇征求其知情同意后，抽取羊水进行产前诊断，对所有筛查的孕妇进行追踪随访，确诊胎儿患病情况。
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1.4 统计学方法
所有数据均采用SPSS 17.0进行分析，计量资料以均数±标准差（x-±s）表示，计量资料多组间的比较采用方差分析，组间比较采用SNK法，计数资料采用卡方检验，以P<0.05作为差异有统计学意义。
2.结果
2.1 血清筛查结果
血清AFP及β-HCG联合孕妇孕周等一般资料筛查出高风险孕妇63例，其余2173例为低风险孕妇，63例高风险孕妇中，DS高风险36例，ES高风险16例，NTD高风险11例。血清筛查结果阳性率为2.82%。
2.2 胎儿有核红细胞基因诊断
所有孕妇均成功分离得到FNRBC，对FNRBC的基因分型结果显示，2173例低风险孕妇的基因均为正常二倍体1:1基因型，36例DS高风险孕妇中检出11例三体型基因型，其余为正常二倍体型；16例ES高风险孕妇中检出异常基因型7例，其中3体型4例，嵌合体型2例，易位型1例，其余为正常二倍体型；11例NTD高风险孕妇均为正常二倍体型。
2.3 妊娠结果
对所有孕妇追踪随访至妊娠终点，11例基因型异常DS高风险孕妇，2例流产，其余正常娩出胎儿，对流产胎儿和活产胎儿进行细胞核分型均确诊为DS；7例基因型异常的ES高风险孕妇，三体型和嵌合体型各出现1例流产，其余均正常娩出胎儿，对流产胎儿和活产胎儿进行细胞核分型均确诊为DS；11例NTD高风险孕妇，均正常娩出胎儿，对活产胎儿进行细胞核分型确诊1例NTD。低风险孕妇活产或流产胎儿未检出基因型异常。
3.讨论
DS是最常见的染色体疾病，据研究报道显示，我国每年大概有2.6万例DS患儿出生，在活产新生儿中的发病率约为1/800，我国的唐氏综合症患儿累计超过60万[7]。DS患儿的出生，不仅给家庭与社会带来了沉重的负担，同时降低了国民的健康素质。DS的发病机制目前尚不清楚，但是可以确定的危险因素有怀孕年龄，因此，在我国多数医疗中心开展产前筛查时，往往只把超过35岁的孕妇纳入筛查DS的高危对象，然而研究显示80%的活产DS胎儿发生在低于35岁的孕妇中，因此对所有怀孕妇女开展产前筛查十分必要[8-9]。
DS产前筛查的目的是采用简便、安全、经济的方法在孕妇群体中发现高风险孕妇，目前已有70多个国家实施了DS产前筛查[10]，常用的产前筛查方法包括：羊水穿刺、绒毛活检、胎儿组织活检和脐静脉穿刺等，均为有创性操作，风险较高，可能会导致孕妇出血、胎儿感染甚至流产[11]，同时由于开展上述检查需要相关的设备和技术，我国幅员辽阔，部分边远地区的基层医院难以开展类似的产前筛查[12]。AFP是由胎儿肝脏分泌的糖蛋白，孕妇外周血中的AFP几乎全部来自胎儿，当胎儿患DS时，肝脏发育不全导致AFP水平降低，研究表明怀有DS胎儿的孕妇外周血中AFP的水平约为正常孕妇AFP水平的70%[13]，同时AFP还是诊断NTD的高灵敏度指标[14]；β-HCG是胎盘滋养层细胞合成和分泌的孕激素之一[15]，正常孕妇在怀孕后随孕周增加血清β-HCG水平迅速增加，到10周时达到最高水平，其后开始降低并维持于一定水平，而DS胎儿由于胎盘发育迟缓，达到最高水平的时间晚，因而在孕中期检测时仍维持在较高水平[16]。血清AFP、β-HCG筛查只需采集外周血，操作简便、安全，检查经济、快速，便于大范围推广，极易被孕妇接受。
近年来无创产前诊断成为研究热点，FNRBC因携带胎儿完整基因组、数量较多、有特殊的生物学特点，因而成为无创产前诊断的首选细胞[17]。染色体STR又称为微卫星DNA，它是一种可遗传的不稳定的且具有高度多态性的短的核苷酸重复序列，这种多态性标志已被广泛用于构建人类遗传连锁图谱、基因定位、遗传病诊断、肿瘤细胞染色体分离与重建以及亲子鉴定等法医学检查中[18]。正常二倍体胎儿STR位点基因型常表现为1:1的二条带图谱，三体胎儿常表现为1:1:1三体图谱或2:1双倍剂量图谱，3条带图谱是诊断三体的金标准，双倍剂量图谱为辅助诊断指标[19]。
本研究结果显示血清筛查63例高风险孕妇中，DS高风险36例，ES高风险16例，NTD高风险11例，血清筛查结果阳性率为2.82%，筛查阳性率与以往研究一致[20]。FNRBC核型分析显示36例DS高风险孕妇中检出11例三体型基因型，其余为正常二倍体型；16例ES高风险孕妇中检出异常基因型7例，其中3体型4例，嵌合体型2例，易位型1例，其余为正常二倍体型；11例NTD高风险孕妇均为正常二倍体型。对妊娠结局的追踪随访结果显示，11例基因型异常DS高风险孕妇，2例流产，对流产胎儿和活产胎儿进行细胞核分型均确诊为DS，7例基因型异常的ES高风险孕妇，三体型和嵌合体型各出现1例流产，其余均正常娩出胎儿，11例NTD高风险孕妇，均正常娩出胎儿，对活产胎儿进行细胞核分型确诊1例NTD，除1例NTD胎儿未检出，FNRBC筛查结果与妊娠结局完全一致，表明血清筛查结合无创FNRBC基因诊断能联合筛查筛查结果准确操作简便、经济，可用于临床筛查。
综上所述，血清筛查联合无创产前基因诊断操作简便、经济，筛查结果准确可靠，可以用于临床推广。
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论文作者:党迷1,王维云1,周迪2,赵海军2
论文发表刊物:《医药前沿》2016年10月第30期
论文发表时间:2016/11/1
标签：孕妇论文; 胎儿论文; 高风险论文; 筛查论文; 体型论文; 血清论文; 产前论文; 《医药前沿》2016年10月第30期论文;