【关键词】冷冻禽畜肉类；沙门氏菌；快速分型检验；PCR检测技术
[Abstract] Objective: To explore the application value of real-time fluorescent PCR (quantitative real-time PCR) in the rapid typing of Salmonella in frozen poultry meat. Methods: 2000 frozen animal meat samples were collected from March 2017 to July 2019. The traditional standard method and real-time fluorescent PCR rapid detection technology were used to test and analyze the results. Results: the results of real-time PCR showed that 76 (positive rate 3.80%) of the samples were significantly higher than 38 (1.90%) of the traditional standard methods, the difference was statistically significant (P < 0.05); further identification of the detected Salmonella serotypes showed that the main serotypes were Haidebao serotype, Kentucky serotype, typhoid serotype and enteritis serotype. Conclusion: the real-time fluorescent PCR detection technology has a good effect in the rapid typing of Salmonella in frozen poultry and livestock meat, which is helpful to improve the detection rate of Salmonella, and it can be used for rapid typing, making up for the shortcomings of traditional standard test such as time-consuming and cumbersome operation, and has a higher clinical application value.
[Key words] frozen poultry meat; Salmonella; rapid typing test; PCR detection technology
沙门氏菌（salmonella）是一种常见的食源性致病菌，广泛分布于自然界内，随着现代临床检验技术的不断进步，临床发现的沙门氏菌超过1000余种，对人类以及动物健康均可造成严重影响。沙门氏菌的传统鉴定方法依据形态学特征、生理生化体征、培养特征、抗原特征、噬菌体特征等展开，不过该检验鉴定程序相对复杂，耗时长，不利于推广应用【1】。荧光定量PCR（ realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR）是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新定量试验技术，通过探针荧光染料或荧光标记的特异性，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。现有研究将该项技术引入冷冻禽畜肉类沙门氏菌快速分型检验中具有较好效果，鉴于此观点，本文抽取2017年3月-2019年7月冷冻禽畜肉类样品2000份展开分析，评价实时荧光PCR检验技术的应用价值，现报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料。抽取2017年3月～2019年7月冷冻禽畜肉类样品2000份展开分析，其中冷冻禽类897份，冷冻畜类1103份。
1.2方法。（1）试剂。选择北京路桥公司提供的生化试剂以及泰国S&A公司提供的分型鉴定血清、分离培养基、前增菌、后增菌。（2）仪器。采用全自动核酸提取工作站，以及哈尔滨贝登电子商务有限公司提供的实时荧光PCR仪、全自动微生物鉴定、药敏分析仪。（3）检测方法。检测内容均依据国家标准沙门氏菌检验方法展开增菌培养，随后采用全自动核酸提取工作站进行核酸的提取工作（磁珠法），待细胞裂解后，将细胞中核酸分子吸附于磁性颗粒上，待其反应一定时间后，利用磁場作用将液体与磁性颗粒进行分离，回收颗粒（磁珠- DNA混合物），并进行脱洗。待各项程序完成后采取PCR检测试剂盒展开实时荧光PCR反应检测，检验沙门氏菌灵敏度与特异度。待检验完毕后对PCR检测为阳性样品者进行增殖液接种、培养【2】；生化反应检测通过挑取无色半透明H25菌株与可疑菌落，将其置放于营养琼脂平板，在适量温度环境内（37℃）逐渐扩大培养，最后采用全自动微生物、药敏反应进行鉴定与分析，各项操作均依据说明书完成。血清学分型鉴定中将生化鉴定检验阳性菌种，将其点种于琼脂量低的琼脂平板内，在湿润环境下诱导等操作内容，随后依据按照单因子血清、多价血清展开血清学实验。
2结果
通过实时荧光PCR检测显示，本组样品中检出沙门氏菌76份（阳性率3.80%）明显高于传统标准方法38份（1.90%），差异具有统计学意义（P<0.05）；进一步对检出沙门氏菌血清分型鉴定显示以海德堡血清型、肯塔基血清型、鼠伤寒血清型、肠炎血清型为主。
表1 实时荧光PCR血清分型鉴定结果
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3讨论
近年来我国正处于经济快速发展阶段，随着人们生活水平的改善，对于禽类、畜类等肉制品需求愈发增高。而与此同时冷冻禽畜肉类批次增多、数量增大，这便对多批次巨量冷冻禽畜肉类检验工作提出更高要求。若检验周期延长不仅可影响整个冷冻肉类供应的产业链及时性，同时对冷库储存、周转等运作效率形成限制，增加了冷库储存周转压力。
沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的总称【3】。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首，我国内陆地区也以沙门氏菌为首位，具有菌型多样化、分布广泛、检验复杂等特点【4】。沙门氏菌的传统检验主要包括分离培养、前后增菌的检测、生化鉴定以及分型检验等程序，刘杰等人【5】的研究中指出，传统检验时间需要耗费4- 10d左右，由此可见其耗时表现费力，在现实工作中难以满足需求。实时荧光PCR检测技术主要利用DNA扩增反应，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法，在扩增期间，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以可成为定量的依据。在本次研究中通过实时荧光PCR检测显示，本组样品中检出沙门氏菌76份（阳性率3.80%）明显高于传统标准方法38份（1.90%），差异具有统计学意义（P<0.05）；由此可见实时荧光PCR检测技术确有较高检出率。进一步分型可见显示以海德堡血清型、肯塔基血清型、鼠伤寒血清型、肠炎血清型为主，这与张媛【6】的研究结果表现一致性。
综上所述，实时荧光PCR检测技术应用于冷冻禽畜肉类沙门氏菌快速分型检验中具有较好效果，有助于提升沙门氏菌检出率，可快速分型，弥补了传统标准检验耗时长、操作繁琐等不足之处，具有更高临床应用价值。
参考文献：
[1]陈思琦，于莹.核酸探针和PCR技术在食品检验中的应用[J].中国科技投资， 2017（24）.165-166
[2]胡 博.PCR技术在食品微生物检测中的应用[J].现代食品，2017（2）：36-37.
[3]杨 丹，郎慧柯.PCR技术在食品微生物检测中的应用价值[J].食品安全导刊，2017（30）：96.
[4]谢婷艺.多重PCR检测技术在食品微生物检测中的应用价值[J].食品安全导刊，2017（36）：106.
[5]刘杰，陈璐.PCR技术在食品微生物检测中的运用[J].食品安全导刊，2018（15）：113-115.
[6]张媛.PCR技术在食品微生物检测中的应用[J].现代食品，2018（7）：89-90.
论文作者:王云鹏
论文发表刊物:《世界复合医学》2020年1期
论文发表时间:2020/4/30