刘蔚[1]2001年在《线粒体ATP敏感性钾通道及其开放剂抗心肌缺血作用的研究》文中研究表明缺血性心脏病(冠心病)是严重危害人类健康的疾病之一,其发病机理和防治措施的研究一直是医学领域的热点。在欧美心血管疾病的死亡率占第一位,其中一半以上为缺血性心脏病。我国心血管疾病的死亡率虽不如欧美国家那么高,但近年有逐渐增加的趋势。因此,我们迫切需要有效的冠心病治疗方法。 目前抗心肌缺血药物仍是冠心病的首选治疗措施。抗心肌缺血药主要是通过扩张冠状动脉增加冠脉血流量以调整氧的供应,或是降低心肌耗氧量以改善供求关系。常用的药物有硝酸酯类、Ca~(2+)拮抗剂和β-受体阻滞剂等。虽然这些药物有一定的抗心肌缺血作用,但其抗缺血的心肌保护作用均不十分理想。原因是这些药物不同程度地具有一些副作用,如长期应用硝酸酯类产生耐药现象,Ca~(2+)拮抗剂和β-受体阻滞剂的负性肌力作用以及低血压、心律失常等。因此开发和研制疗效确切、副作用少的抗心肌缺血药是心血管研究领域面临的重要课题之一。 80年代初Noma首先报道心肌细胞膜存在ATP敏感性钾通道(K_(ATP))。K_(ATP)是受细胞内ATP调节的一种内向整流钾通道,随后研究证实,该通道开放可以产生心脏保护作用。近年来研究发现K_(ATP)开放保护作用的靶点可能位于细胞内,线粒体膜K_(ATP)可能是抗心肌缺血药物的新作用靶点。线粒体K_(ATP)开放,膜去极化,K~+内流,使线粒体容积增加,促进线粒体呼吸。因而增强组织细胞对缺氧的耐受性,提高机体的内源性抗缺氧能力。 二氮嗪是一种苯并噻二嗪类衍生物,六十年代初期在美国合成并上市。
刘蔚, 汪海[2]2001年在《抗心肌缺血药物的新靶点:线粒体ATP敏感性钾通道》文中认为ATP敏感性钾通道 (KATP)是心脏保护作用的调节位点。随着KATP药理学和分子生物学特征的深入研究 ,发现KATP开放剂介导的心脏保护机制并不依赖于动作电位时程(APD)的缩短和负性肌力作用 ,而与线粒体功能有关。细胞内存在线粒体KATP(mitoKATP)。mitoKATP开放的心脏保护作用机制尚不十分清楚 ,可能与K+ 内流 ,线粒体膜去极化 ,降低Ca2 + 超载 ,基质容积增加有关 ,后者可增加ATP合成、促进线粒体呼吸
叶治[3]2009年在《线粒体ATP敏感性钾离子通道及活性氧介导七氟醚迟发型脑保护作用机制探讨》文中研究表明临床上常见的严重颅脑外伤手术、控制性降压、颅内动脉瘤夹闭术和冠状动脉旁路移植术以及颈动脉内膜剥脱术等的病人都具有潜在脑缺血的可能。例如:为便于脑动脉瘤手术实施和减少术中出血,常将脑动脉血管短暂夹闭,然而随着受阻血管血流的恢复,往往会导致局部性脑组织缺血/再灌注(ischemic-reperfusion injury,I/R)损伤。而在实际工作中,临床医生不仅关心术中的神经系统的保护,更关心术后神经功能的恢复。探求脑缺血损失的发病机制、减轻脑缺血性损伤、降低脑缺血性疾病的致残率和死亡率,已成为近年来神经科学领域广大工作者致力的研究目标。与脑缺血预处理相似,吸入麻醉药预处理与缺血损伤之间也有短暂的重要联系,包括两个重要时期:预处理早期阶段,即中断预处理刺激后5 min～2 h出现;第二个保护时期,延迟预处理期,出现在预处理刺激停止后12～24 h,并可持续24至72 h。已有研究证实七氟醚具有早期预处理的脑保护效应,在大鼠海马脑片模型中,反复吸入七氟醚(每天一次持续30 min,连续4天)能够诱导迟发型脑保护作用。目前,仍未知单次给予七氟醚是否能够诱导迟发型脑保护效应,值得进一步研究。大量研究证实,线粒体内膜ATP敏感钾通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channels,mitoK_(ATP)),是吸入麻醉药预处理产生心肌保护作用的重要机制之一。而脑组织的mitoK_(ATP)通道蛋白浓度是心肌含量的6～7倍。因此我们有理由推测mitoK_(ATP)通道参与了七氟醚的迟发型脑保护作用。开放后的mitoK_(ATP)通道如何进一步介导脑保护作用?现在认为活性氧(reactive oxygen species,ROS)可能作为一种关键的细胞内信息物质,介导缺血缺氧预处理和mitoK_(ATP)开放剂预处理的心肌及脑保护作用。因此本课题探讨脑遭受缺血再灌注损伤前24 h,单次给予60 min七氟醚预处理是否产生迟发型脑保护效应,以及mitoK_(ATP)通道及ROS的作用。本课题首先通过观察缺血后大鼠的神经功能及测定脑梗塞容积百分比,并通过HE染色评定CA1区神经元形态学改变,明确不同浓度的七氟醚对SD大鼠产生迟发型的脑保护作用;其次第二部分通过加入特异性mitoK_(ATP)通道阻断剂及ROS清除剂,观察缺血后大鼠的神经功能及测定脑梗塞容积百分比和缺血侧项叶皮层神经元PKC-ε和-δ两种同功酶的膜转位变化,探讨七氟醚迟发型脑保护作用可能是通过mitoK_(ATP)通道和ROS所介导的,且PKCε和δ是否作为mitoK_(ATP)通道的下游靶点参与了七氟醚迟发型脑保护效应;之后,进一步研究和探讨p38MAPK信号通路可能也为mitoK_(ATP)通道的下游蛋白信号分子,参与了七氟醚诱导迟发型脑保护中的作用;随后,通过检测缺血后胞浆细胞色素C(Cytochrome C,Cyt C)的释放和Caspase-3活性变化,以及TUNEL染色等证实七氟醚迟发型预处理可以通过mitoK_(ATP)通道及ROS介导,抑制缺血再灌注损伤后神经元的凋亡,明确七氟醚迟发型脑保护机制;最后通过用紫外分光光度计测定各组缺血侧皮层神经元线粒体通透转运通道(MPTP)开放程度,Western-blot检测Bcl-2/Bax蛋白表达情况,探讨七氟醚预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后线粒体通透性转换孔的影响及可能机制,证实了激活和开放mitoK_(ATP)通道在七氟醚抑制MPTP开放发挥迟发型脑保护效应中起到重要作用。结果证实:(1)缺血前24h,短暂的予以2.4%及4.0%的七氟醚预处理可增强大鼠耐受局灶性脑缺血损伤,产生显着的迟发型脑保护效应,但短时间高浓度(4.0%)吸入七氟醚有引起动脉血pH值及MAP降低的趋势。(2)mitoK_(ATP)通道和活性氧介导七氟醚对局灶性脑缺血再灌注损伤的迟发型保护作用,其机制可能与调控PKC-ε转位激活有关,但PKC-ε转位激活仅发生于脑保护的早期相,提示可能有其他的信号通路机制参与七氟醚迟发型脑保护作用。(3)七氟醚可以诱导大脑皮层磷酸化p38MAPK表达的增加,且p38MAPK可能做为线粒体ATP敏感性钾离子通道抗脑缺血再灌注损伤中的下游通路,参与了七氟醚预处理的迟发型脑保护作用。(4)七氟醚通过抑制缺血后细胞色素c释放、Caspase-3的激活以及神经元的凋亡发挥迟发型脑保护作用,其作用可能与线粒体ATP敏感性钾离子通道(mitoK_(ATP))以及活性氧有关。(5)七氟醚预处理能通过激活mitoK_(ATP)通道上调bcl-2蛋白的表达,抑制MPTP开放发挥迟发型脑保护作用。总之,脑缺血缺氧所致的神经元损伤并非是单一的病理生理过程,而是一系列复杂的生化级联反应。七氟醚的脑保护作用也并非单一作用于上述的某一环节,而是多位点、多途径、交互作用的结果。第一部分七氟醚对大鼠缺血再灌注损伤的迟发型脑保护作用目的观察缺血前24 h单次予以2.4%或4.0%的七氟醚(sevoflurane,Sevo)60 min是否产生迟发型的脑保护作用。方法健康SD雄性大鼠60只,体重250～280 g,随机分为4组:假手术组(S组),单纯缺血再灌注组(IR组),2.4%七氟醚组(Sevol组),4.0%七氟醚组(Sevo2组)。七氟醚预处理组在制备MCAO模型前24h,吸入浓度为2.4%或4.0%七氟醚+氧气60 min;而S组和IR组在制备MCAO模型前24 h,吸入浓度为100%氧气60 min。24 h后用10%水合氯醛(300～350mg/kg)麻醉大鼠后,分离右颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉,结扎颈外动脉和颈总动脉近端,经颈总动脉向颈内动脉插入栓线,放置到大脑前动脉起始部,阻断大脑中动脉。S组只分离血管,不阻断大脑中动脉的血流。缺血2 h,再灌注6,24,72 h后,用神经功能缺陷评分观察动物神经行为学改变、TTC染色法测大鼠脑梗死容积百分比。额外取12只雄性成年SD大鼠随机分为IR组,Sevo1组,Sevo2组。均用4.0%七氟醚(氧流量4.0 L/min)动物麻醉面罩吸入诱导麻醉,2.4%七氟醚(氧流量1.5～2.0 L/min)面罩持续吸入维持麻醉深度。分离、暴露右侧股动脉,动脉置管后缝合局部皮肤。停用七氟醚,待大鼠清醒后,放入七氟醚麻醉预处理箱内,接好持续动脉测压,体温测量装置。Sevo1组,Sevo2组通过麻醉气体挥发罐持续输入含有2.4%或4.0%七氟醚的O_2(4L/min),而IR组持续输入100%的纯氧。叁组大鼠均保留自主呼吸。在七氟醚或氧气预处理前5 min以及结束时抽取动脉血检测动脉血气、血糖并记录平均动脉压(MAP),心率(HR),体温(T)等参数。结果IR组缺血2 h,再灌注6,24,72 h后,神经功能缺陷评分分别为4(2～6),4(3～6)及4(3～6),脑梗死容积百分比分别为22.6±4.0%,33.7±4.3%,31.1±3.4%。与IR组相比,缺血2 h,再灌注6,24,72h后,Sevo1组和Sevo2组均明显改善神经功能及显着减少脑梗死面积(P＜0.05),神经功能缺陷评分Sevo1组分别为2(1～5),3(1～4),3(2～5),Sevo2组分别为2(1～4),3(2～4),3(1～5)。脑梗死容积百分比Sevo1组分别为:14.3±3.5%,23.4±4.7%,25.7±3.0%;Sevo2组分别为:15.6±4.5%,23.8±3.7%,27.1±4.0%。但Sevo1组与Sevo2组之间神经功能缺陷评分及脑梗死容积差异无统计学意义(P＞0.05)。与IR组相比较,Sevo1组,pH值,动脉血二氧化碳分压(PaCO_2),动脉血氧分压(PaO_2),血糖(BS)以及血流动力学参数(MAP,HR),体温(T)均无显着差异;但Sevo2组pH值较IR组及Sevo1组有所降低,差异有统计学意义。结论缺血前24 h,短暂的七氟醚预处理可增强大鼠耐受局灶性脑缺血损伤,产生显着的迟发型脑保护效应。短时间高浓度吸入七氟醚有引起动脉血pH值及MAP降低的趋势。第二部分PKCε参与七氟醚预处理诱导的迟发型脑保护作用及mitoK_(ATP)通道和ROS的影响目的探讨七氟醚预处理对大鼠局灶性缺血再灌注损伤的迟发型脑保护作用和对PKC-ε,δ转位激活的影响以及与mitoK_(ATP)通道和活性氧(ROS)生成的关系。方法健康雄性SD大鼠,体质量220～300 g,采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型(middle cerebral arteryocclusion,MCAO)并随机分为7组:假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)、七氟醚预处理组(Sevo组)、mitoK_(ATP)通道阻断剂5-羟葵酸盐(5-HD)+七氟醚(5-HD+Sevo组)、ROS清除剂2-硫基丙酰氨基乙酸(2-MPG)+七氟醚(MPG+Sevo组)和单纯5-HD组及MPG组。除假手术组外,其余各组大鼠阻闭右侧大脑中动脉2 h,再灌注6,24和72 h。假手术组(S);缺血再灌注组(I/R):吸入100%纯氧60min,24 h后行大脑中动脉阻闭(MCAO),缺血2 h,再灌注6,24,和72 h;七氟醚组(Sevo):制备MCAO模型前24 h,吸入浓度为2.4%七氟醚+97.6%氧气60 min;5-HD+Sevo组:七氟醚预处理之前30 min,腹腔内注射mitoK_(ATP)通道阻断剂5-羟葵酸盐(5-HD)40mg/kg,余同七氟醚组;MPG+七氟醚组(MPG+Sevo):七氟醚预处理之前30 min,经尾静脉予以ROS清除剂MPG 20 mg/kg,余同七氟醚组;单纯5-HD组:吸入氧气前30 min,腹腔内注射mitoK_(ATP)通道阻断剂5-羟葵酸盐(5-HD)40 mg/kg,余同I/R组;单纯MPG组(MPG):吸入氧气前30 min,尾静脉给予MPG 20 mg/kg,余同I/R组。缺血2h,再灌注6,24和72 h后进行神经功能缺陷评分(NDS)并取脑组织,运用TTC染色测算脑梗死容积百分比,再灌注6,24 h后运用Western-Blot法测定PKC-ε,δ膜转位水平。结果I/R组相比,七氟醚能明显改善缺血后的神经功能,减小脑梗死面积,而发挥迟发型脑保护作用(P＜0.05),七氟醚预处理前30 min腹腔内注射mitoK_(ATP)通道阻断剂5-羟葵酸盐(5-HD)(40 mg/kg)或尾静脉给予ROS清除剂2-硫基丙酰氨基乙酸(2-MPG)(20 mg/kg)能拮抗七氟醚迟发型脑保护效应(P＜0.05),单独使用5-HD及MPG则无明显影响(P＞0.05)。I/R组,MPG+Sevo组,MPG组之间脑梗死容积以及神经功能评分差异无统计学意义(P＞0.05)。此外,与I/R组相比,七氟醚显着促进PKC-ε,而非PKC-δ的膜转位激活,且仅发生于再灌注后6 h(P＜0.05),七氟醚的此效应同样可以被mitoK_(ATP)通道阻断剂5-羟葵酸盐(5-HD)或ROS清除剂2-MPG所废止。结论mitoK_(ATP)通道和活性氧介导七氟醚对局灶性脑缺血再灌注损伤的迟发型保护作用,其机制可能与调控PKC-ε转位激活有关。第三部分p38MAPK参与七氟醚预处理迟发型脑保护效应及线粒体ATP敏感性钾离子通道的作用目的研究七氟醚迟发型预处理对大鼠皮层脑组织p38蛋白磷酸化激活的影响以及线粒体ATP敏感性钾离子通道的作用。方法实验分两部分,A)40只SD实验大鼠结束七氟醚预处理前0 h及七氟醚预处理后2 h、6 h、12 h、24 h、3 d,7d通过Western-bolt法检测p-p38MAPK表达情况;B)50只SD大鼠随机分为6组:缺血再灌注组(I/R)、七氟醚组(Sevo)、5-HD+七氟醚组(5-HD+Sevo)、SB 203580+七氟醚组、单纯SB 203580(SB)和单纯5-HD组(5-HD)。缺血2 h,再灌注24后进行神经行为学评分,TTC法检测脑梗死容积百分比以及Western-bolt法检测缺血侧顶叶皮层神经元磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)的水平。结果A):与对照组(七氟醚预处理前,即0 h)相比较,吸入七氟醚后2 h,p38MAPK磷酸化(p-p38MARK)明显增加,随着再灌注时间延长,p-p38MARK表达也逐渐增强,于再灌注后24 h达到高峰,并可至少持续3 d,再灌注7 d后基本回落至初始水平。B)与I/R组相比较,七氟醚预处理组能显着改善大鼠缺血后神经功能和明显减小脑梗死面积,但是七氟醚预处理前使用5-HD及SB203580干预,可以取消七氟醚预处理的脑保护作用。而与I/R组相比较,单独使用5-HD及SB203580对实验结果无明显影响。结论七氟醚可以诱导大脑皮层磷酸化p38MAPK表达的增加,且p38MAPK可能做为线粒体ATP敏感性钾离子通道抗脑缺血再灌注损伤中的下游通路,参与了七氟醚预处理的迟发型脑保护作用。第四部分七氟醚预处理对局灶性脑缺血再灌注损伤神经元凋亡的影响及机制目的探讨七氟醚预处理对局灶性脑缺血再灌注损伤后神经元凋亡、Caspase-3激活以及细胞色素c释放的影响。方法利用MACO法建立大鼠局灶性脑缺血模型,以酶活性测定、Western Blot免疫组化和TUNEL法对Caspase-3活性变化和激活、细胞色素c释放以及神经元凋亡进行规律性观察。结果缺血2 h,再灌注6,24,72 h后,假手术组(Sham)胞浆未见明显的细胞色素C释放及活性Caspase-3。与Sham组相比较,缺血再灌注组(I/R)细胞色素C胞浆释放及活性Caspase-3明显增加。与I/R组相比较,七氟醚预处理显着减少细胞色素C的胞浆释放及活性Caspase-3增加。七氟醚预处理前给与线粒体ATP敏感性钾离子通道(mitoK_(ATP))抑制剂5-HD以及活性氧(ROS)清除剂2-MPG,可以废除七氟醚抑制细胞色素C释放及活性Caspase-3增加的效应(P＜0.05),但与I/R组相比较,单纯给与5-HD及2-MPG,对缺血后各时点细胞色素C的胞浆释放无明显影响。缺血2 h,再灌注24 h后使用TUNEL法检测凋亡神经元显示,与I/R组相比,七氟醚能明显减少缺血后神经元的凋亡,同样线粒体ATP敏感性钾离子通道(mitoK_(ATP))抑制剂5-HD以及活性氧(ROS)清除剂2-MPG,可以废除七氟醚抑制神经元凋亡的效应。结论七氟醚通过抑制缺血后细胞色素c释放、Caspase-3的激活以及神经元的凋亡发挥迟发型脑保护作用,其作用可能与线粒体ATP敏感性钾离子通道(mitoK_(ATP))以及活性氧有关。第五部分七氟醚预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后线粒体通透性转换孔的影响目的探讨七氟醚预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后线粒体通透性转换孔的影响及可能机制。方法雄性SD大鼠随机分为5组:假手术组(Sham组);缺血损伤组(I/R组):吸入纯氧60 min,24h后行大脑中动脉阻塞2 h,再灌注24 h造成局灶性脑缺血再灌注;七氟醚预处理组(Sevo组):缺血前24 h吸入2.4%七氟醚60 min;5-HD+Sevo组:腹腔内注射5-HD 40 mg/kg,30 min后同Sevo组。5-HD组:腹腔内注射5-HD 40 mg/kg,30 min后同I/R组,用紫外分光光度计测定各组缺血侧皮层神经元线粒体通透转运通道(MPTP)开放程度,Western-blot检测Bcl-2/Bax蛋白表达情况。结果I/R组线粒体(_(max) A_(520)—_(min) A_(520))呈现快速下降,且比假手术组更为显着(P＜0.05);与I/R组相比较,七氟醚预处理组(Sevo)能缓解Ca~(2+)诱导的(_(max)A_(520)—_(min)A_(520))的下降(P＜0.05);但七氟醚预处理前腹腔内注射线粒体ATP敏感性钾离子通道特异性抑制剂5-HD 40mg/kg,可取消七氟醚的此作用,而单独使用5-HD则无影响。同样,与I/R组比较,七氟醚可明显增加bcl-2蛋白表达(P＜0.05);七氟醚预处理前使用5-HD,可以取消七氟醚增加bcl-2蛋白表达的效应(P＜0.05);除假手术组外,各组间Bax的表达差异无统计学意义。结论七氟醚预处理能通过激活mitoK_(ATP)通道上调bcl-2蛋白的表达,抑制MPTP开放发挥迟发型脑保护作用
陈婵娟[4]2014年在《基于心肌mitoK_(ATP)通道龙牙楤木总皂苷对大鼠缺血再灌注心脏的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景及目的冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease, CHD)是冠状动脉粥样硬化导致冠状动脉血管管腔狭窄,或者动脉粥样硬化斑块阻塞冠脉,或(和)因冠状动脉痉挛等功能性改变导致心肌缺血缺氧或坏死而引起的心脏病,是严重危害人类健康的常见病。心肌梗死(myocardial infarction, MI)是指心肌缺血性坏死,是在冠状动脉病变的基础上发生的冠状动脉血供急剧减少或中断,导致相应心肌严重而持久急性缺血出现心肌坏死；是冠心病急性冠脉综合征严重类型。本病病死率高,我国本病发病率也在逐年增多。近年来,溶栓、经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention, PCI).主动脉-冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass grafting, CABG)得到广泛应用,使闭塞的冠状动脉再通,缺血缺氧的心肌得到血液再灌注,濒临坏死的心肌细胞得以存活,缩小梗死面积,减轻心肌重塑,改善了患者预后,挽救了许多急性心肌梗死患者的生命。然而研究发现缺血后再灌注有时不仅不能改善病情,反而加重功能结构损伤。这种在缺血基础上恢复血流后组织损伤反而加重,甚至发生不可逆损伤的现象称为缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, IR).如何做到既尽早恢复缺血组织血流,又不发生再灌注损伤,是缺血性疾病防治中亟待解决的重要课题。龙牙楤木为五加科楤木属植物,主要分布于我国东北地区,资源丰富；其根茎皮叶性平味辛有小毒,具有祛风除湿,健胃利水,活血止痛,补气安神,强精滋肾之功效。现代研究表明龙牙楤木总皂苷(Aralsides, Ar)具有抗氧化、抗心肌缺血、保护心肌作用。已有研究证明龙牙惚木提取物通过提高抗氧化酶活性,减少自由基的生成,稳定线粒体内游离Ca2+浓度对线粒体产生保护作用。龙牙楤木总皂苷的心肌保护作用机制则可能是通过增加SOD的活力,对抗氧自由基对心肌细胞的毒害作用,从而减轻心肌细胞的损伤。综上,龙牙楤木总皂苷通过增强细胞抗氧化作用,减少自由基及脂质过氧化物导致的细胞膜损伤等机制起到保护心肌缺血再灌注损伤的作用。与研究其他中药抗心肌缺血再灌注损伤机理寻找多个作用靶点一样,我们也需要通过研究龙牙楤木总皂苷对缺血再灌注心肌的保护作理,明确是否龙牙楤木总皂苷的作用机制也存在多个作用靶点。线粒体是细胞氧化磷酸化反应发生的重要场所,参与自由基生成、钙超载等环节,在心肌缺血再灌注损伤中,线粒体结构和功能都会受到不同程度的损伤。近年来研究发现,线粒体内膜上存在叁磷酸腺苷敏感性钾通道(mitoKATP),对生物膜的稳定性、线粒体及心肌细胞的功能起着非常重要的作用,开放ATP敏感性钾通道具有保护缺血再灌注心肌的作用,因此心肌细胞线粒体叁磷酸腺苷敏感性钾通道(mitochondria ATP-sensiive potassium, mitoKATP)是心肌缺血再灌注损伤的重要治疗靶点。本课题旨在探讨龙牙楤木总皂苷对心肌细胞线粒体叁磷酸腺苷敏感性钾通道(mitoKATP)是否具有正性作用,进而提出假说：龙牙楤木总皂苷通过开放线粒体敏感性钾通道,调节线粒体膜电位、减少线粒体形态、结构和功能的损伤,促进线粒体呼吸功能的恢复,减少ATP的水解,进而促进能量物质的合成,稳定心肌细胞细胞膜,减轻心肌缺血再灌注损伤。本论文分文献综述和实验研究两部分。文献综述部分包括Langendroff离体心脏逆行灌流方法的沿革及应用、与mitoKATP通道相关的心血管离子通道药理学研究、冠心病的中医药临床治疗和研究进展和龙牙楤木总皂苷药物化学成分和药理学研究进展四部分。Langendroff离体心脏逆行灌流方法是本实验的基础造模方法,综述一从离体心脏灌流的发明、逆行灌流的原理、原则、恒压恒流两种不同的灌流模式、实验必要条件、生理学参数的测量、可能出现的误区、实验的设计与特殊应用等方面,全面回顾了该方法的规范化流程、优缺点及使用注意事项。综述二从电生理学的发展沿革、离子通道的概念、生理结构、生理特征、分类、药物作用于离子通道的作用机理、KATP的分类、分布、生理学作用、药理学特点、相关疾病等方面系统总结了与KATP通道相关的心血管离子通道药理学研究。综述叁回顾了传统中医学对冠心病、心肌缺血再灌注损伤病因病机、辨证论治的认识过程,总结了中西医结合医学对冠心病、心肌缺血再灌注损伤诊断和治疗的研究进展,概述了中药复方、单味中药、中药提取单体对心肌缺血再灌注损伤的作用研究进展,提示中医药对心肌缺血再灌注损伤的防治具有良好的应用前景。综述四是龙牙楤木总皂苷药物化学成分和药理学研究进展。实验研究部分目的：(1)探索大鼠急性心肌梗死模型缺血再灌注损伤心肌保护问题；明确心肌细胞线粒体ATP敏感性钾通道与缺血再灌注损伤的关系；(2)观察龙牙楤木总皂苷对心肌细胞线粒体ATP敏感性钾通道的开放作用；(3)阐明龙牙楤木总皂苷抗心肌细胞缺血再灌注损伤的机制。方法：使用Langendroff离体心脏逆行灌流系统建立大鼠离体心脏灌流模型,对照组(假手术组)以K-H液行常规恒压持续平衡灌注125min；同对照组平衡20min后模型组结扎冠状动脉左前降支靠近分支处停灌(缺血)30min后K-H液复灌(再灌注)75min；二氮嗪(Diazoxide, DZ)组处理同模型组,复灌时以含50umol/LDZ的改良K-H液复灌75min；龙牙楤木总皂苷组处理同模型组,复灌时以含5mg/L龙牙楤木总皂苷的改良K-H液复灌75min；5-羟基癸酸组(5-hydroxydecanoate,5-HD)处理同模型组,复灌时以含100umol/L的5-HD的改良K-H液复灌75min;5-HD加龙牙穗木总皂苷组处理同模型组,复灌时先行给予100umol/L的5-HD的改良K-H液复灌15min,再以含50mg/ml龙牙楤木总皂苷的改良K-H液复灌60min。伊文思蓝、TTC染色观察心肌梗死、缺血面积；记录左心室压力及心率变化过程,比较各组平衡20min、局部缺血30min、再灌15min、再灌30min、再灌75min的血流动力学指标及灌流液中肌酸激酶(creatine kinase, CK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)漏出量。各组经以上处理后,分别切取心尖部心肌2块,分别用以制备透射电镜标本观察心肌超微结构和心肌细胞线粒体超微结构、提取线粒体用罗丹明-123(Rhodamine123, R-123)染色以流式细胞仪检测线粒体膜电位。结果：益气活血中药提取物龙牙楤木总皂苷与mitoKATP开放剂DZ有类同的作用,可以减少大鼠心肌缺血再灌注损伤过程中心肌酶、乳酸脱氢酶的释放、改善血流动力学、改善心律、保护心肌细胞和心肌细胞线粒体的结构和功能,维持缺血再灌注损伤过程中心肌细胞线粒体的膜电位。而一些作用大部分可被mitoKATP阻滞剂5-HD解除。结论：龙牙楤木总皂苷可以增强再灌注过程中心脏舒缩功能,减少心肌细胞心肌酶的漏出,保护心肌纤维、心肌细胞和线粒体的结构形态,稳定线粒体膜电位,保护线粒体的功能；这些作用都与mitoKATP通道开放剂DZ类同,且都可被mitoKATP通道阻滞剂5-HD取消,可以认为是通过mitoKATP通道起作用的。
魏珂[5]2003年在《线粒体ATP敏感性钾通道与幼兔心脏保护的关系研究》文中研究指明目的：1．了解药物(二氮嗪)预处理对幼兔心脏有无保护作用，并与缺血预处理(IPC)对比。2．探讨线粒体ATP敏感性钾通道(mK_(ATP))在预处理过程中的作用及其机制。 方法：大耳白兔(兔龄小于28d)34只随机分成5组：Ⅰ组(n=8)：K-H缓冲液灌注30min后St.ThomasⅡ号停跳液(STH)停跳；Ⅱ组(n=8)：K-H液平衡灌注15min后二氮嗪(100μmol/L)灌注5min，再用K-H液灌注10min，STH停跳；Ⅲ组(n=5)：K-H液平衡15min后用5-HD(100μmol/L)与二氮嗪(100μmol/L)共同灌注5min，再用K-H液冲洗10min，STH停跳；Ⅳ组(n=8)：K-H液平衡15min后，全心缺血5min，复灌10min行IPC，STH停跳；Ⅴ组(n=5)：K-H液平衡至10min，5-HD(100μmol/L)灌注5min后行IPC，STH停跳。建立langend(?)rff模型，常温(38℃)停灌30分钟，复灌45分钟，模拟I/R过程。观察并监测再灌后心脏血流动力学变化、冠脉流出液心肌酶、心肌组织内ATP含量，电镜下观察心肌损伤程度并对线粒体进行形态学半定量分析。 结果：I/R后二氮嗪预处理组的线粒体评分较IPC组(P＜0.05)和对照组(P＜0.01)低，5-HD与二氮嗪合用后线粒体评分仍较对照组低(P＜0.05)。二氮嗪预处理组和IPC组LVDP、±dp/dt_(max)恢复在多个时间 重庆医科大学硕_l研究生学位论文点上均优于对照组，而再灌末心肌组织ATP含量也高于对照组(尸<0.01)，冠脉流出液中的叁种心肌酶值均较对照组降低(尸<0.01)。 结论:1.二氮嗦预处理能产生与IPC相似的心肌保护作用，并且较IPC对线粒体的保护效果更好。2.mKATP通道和细胞膜KATP通道(sKATP)共同参与了IPC过程，且以mKATP通道的作用为主。
高琴[6]2008年在《线粒体相关通道/孔道作为心肌保护靶点的研究》文中研究表明线粒体是维持细胞存活的关键细胞器。当机体遭受各种应激刺激时,线粒体内ATP含量急剧下降,糖酵解致使各种有害产物堆积,激活某些内在机制,导致细胞凋亡、坏死的发生。心肌缺血复灌时,线粒体功能失常是诱导细胞凋亡和坏死的主要因素之一。如何保护线粒体从而保护心肌免受损伤引起越来越多的重视,线粒体机制已成为研究心肌保护作用的热点。线粒体内外膜上存在的诸多离子通道/孔道可能参与心肌保护。线粒体渗透性转换孔道(mitochondrial permeability transition pore,mitoPTP)是存在于线粒体内外膜之间的一种非特异性通道,参与对抗缺血/复灌损伤的心肌保护作用,是缺血/复灌损伤的终末效应器之一。mitoPTP的活动可能受其上游的离子通道的调节。线粒体钙单向转运体(mitochonddrialcalcium uniporter,MCU)是介导钙离子从线粒体外进入线粒体基质的重要途径,参与调节线粒体内外钙的动态平衡。线粒体上的两种钾离子相关通道——线粒体ATP敏感性钾通道、线粒体钙激活钾通道调节钾离子进入线粒体,维持线粒体容积,同时调节线粒体钙离子和氧自由基的活动,也参与心肌保护机制。这些离子通道/孔道是否是心肌保护的共有通路,离子通道是否参与调节mitoPTP的活动值得关注。近年来的研究表明,关于心肌保护的干预措施主要包括缺血预处理、药物预处理和新近出现的缺血后处理。已证实缺血预处理的心肌保护机制涉及促进线粒体ATP敏感性钾通道的开放、抑制线粒体钙单向转运体和线粒体渗透性转换孔道的开放等,药物预处理和后处理是否通过类似的机制发挥心肌保护作用尚未明确。本研究给予实验动物心肌叁种不同类型的干预:内源性细胞因子肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、外源性药物puerarin及非药物的程序性氧供控制缺血后处理,在离体心脏缺血复灌损伤、心肌细胞缺氧复氧损伤和氧化应激损伤、高钙诱导线粒体损伤等不同层次模型上着重观察不同类型的干预是否均通过共同的线粒体离子通道/孔道的参与和线粒体后的信号转导发挥心肌保护作用。我们着重观察线粒体渗透性转换孔道、线粒体钙激活钾通道和线粒体钙单向转运体、线粒体ATP敏感性钾通道在叁种干预中的作用,并进一步探讨其可能的上下游机制。本实验采用结扎冠状动脉左前降支30 min,复灌120 min复制局部缺血/复灌损伤模型和大鼠心脏全心停灌30 min,复灌120 min复制全心缺血/复灌损伤模型。连续记录离体心脏左心室发展压、左室作功(心率与发展压的乘积)和左室舒张末压力等各项心室力学指标。分光光度法测定冠脉流出液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)含量;TTC染色法测定心肌梗死面积;测定心肌细胞formazan含量反映心肌细胞活性。分离心肌线粒体,分光光度法测定线粒体高钙诱导下520 nm吸光度的变化反映线粒体渗透性转换孔道的开放。同时建立心肌细胞缺氧/复氧损伤模型和H_2O_2诱导心肌细胞损伤模型,台盼蓝拒染法测定细胞存活率;采用荧光技术测定心肌细胞缺氧线粒体膜电位的变化和氧自由基的变化。结果发现,在离体心脏缺血/复灌损伤模型上,内源性细胞因子TNF-α预处理明显减少心脏缺血/复灌后的心肌梗死面积,降低复灌期冠脉流出液中LDH含量,促进左室发展压、左室作功和左室舒张末压的恢复。线粒体渗透性转换孔道开放剂atractyloside(Atr)、线粒体钙激活钾通道阻断剂paxilline(Pax)和线粒体钙单向转运体开放剂spermine(Sper)增加了冠脉流出液中LDH含量和心肌梗死面积,减弱了心室收缩功能的恢复。线粒体渗透性转换孔道抑制剂cyclosporin A(CsA)、线粒体钙激活钾通道开放剂NS1619明显减少心脏缺血/复灌后的心肌梗死面积,降低复灌期冠脉流出液中LDH含量,促进左室发展压、左室作功和左室舒张末压的恢复。线粒体钙激活钾通道阻断剂Pax未改变CsA的作用,线粒体渗透性转换孔道开放剂Atr减弱了NS1619的作用。在分离的心肌线粒体实验模型上,10 U/ml TNF-α预处理离体大鼠心脏后分离线粒体,高钙诱导下520 nm处吸光度的下降明显低于对照组;线粒体钙激活钾通道阻断剂Pax和线粒体钙单向转运体开放剂Sper均减弱了高钙诱导下TNF-α对520 nm处吸光度的影响。在离体大鼠心脏缺血复灌损伤模型上,外源性药物puerarin明显减小了心肌细胞活度,降低了冠脉流出液中LDH含量,复灌期心室收缩功能恢复程度明显增加。线粒体钙激活钾通道阻断剂Pax、线粒体ATP敏感性钾通道阻断剂5-hydroxydecanoate(5-HD)和线粒体渗透性转换孔开放剂Atr均减弱了了puerarin的作用。在心肌细胞缺氧/复氧损伤模型和H_2O_2诱导损伤模型上,puerarin增加了心肌细胞存活率,Pax、5-HD和Atr和PKC阻断剂chelerytheline减弱了puerarin的作用。采用荧光技术观察心肌细胞。puerarin降低了缺氧诱导下荧光探针TMRE的强度,提示线粒体膜电位去极化程度降低,5-HD和Atr减弱了puerarin的作用。同时puerarin降低了缺氧和H_2O_2诱导下荧光探针DCF的强度,提示线粒体ROS释放减少,Pax和chelerytheline减弱了puerarin的作用。分离心肌线粒体模型上,puerarin预处理离体大鼠心脏后分离线粒体,520 nm处吸光度的下降明显低于对照组:5-HD和Pax减弱了puerarin对520 nm处吸光度的影响。在离体心脏缺血复灌损伤模型上,非药物的程序性氧供控制——缺血后处理明显提高了心肌细胞活度,降低了冠脉流出液中LDH含量,复灌期心室收缩功能恢复程度明显增高。线粒体钙激活钾通道阻断剂Pax、线粒体ATP敏感性钾通道阻断剂5-HD减弱了了缺血后处理对心肌的作用。δ阿片受体阻断剂naltrindole和κ阿片受体阻断剂nor-binaltorphimine均减弱了了缺血后处理对心肌的作用。缺血后处理后分离大鼠心脏线粒体,高钙诱导下后处理组520 nm处吸光度的下降明显低于对照组。总之,内源性细胞因子TNF-α抗缺血/复灌心肌损伤的作用可能与其抑制线粒体渗透性转换孔道的开放有关,同时抑制了线粒体钙单向转运体的开放,促进了线粒体钙激活钾通道的活动。外源性药物puerarin可发挥抗心肌缺血/复灌损伤和抗氧化作用,其机制可能与其促进线粒体钙激活钾通道和线粒体ATP敏感性钾通道的开放,抑制线粒体渗透性转换孔道的开放有关,同时有PKC的参与。缺血后处理的心肌保护作用机制涉及内源性阿片受体激动剂的释放,以及线粒体钙激活钾通道和线粒体ATP敏感性钾通道的开放。线粒体钙单向转运体、线粒体ATP敏感性钾通道、线粒体钙激活钾通道可能是线粒体渗透性转换孔道的上游途径。线粒体离子通道/孔道可能是机体重要的心肌保护的共同途径,包括内源性因子、外源性药物和血流程序控制在内的各种干预措施其细胞内作用靶点是线粒体的离子通道/孔道,随后通过线粒体后信号转导发挥心肌保护作用。
房晓祎[7]2011年在《二氮嗪对窒息新生大鼠心肌线粒体保护作用机制研究》文中提出背景与目的新生儿窒息如未及时救治可引起各器官系统缺氧缺血损伤,而复苏后又可导致再灌注损伤,其中心脏、脑等器官对缺氧缺血/再灌注损伤较敏感,多种机制参与该过程。线粒体是细胞“能量工厂”,通过氧化磷酸化作用产生细胞生存所需90%的叁磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)。近年来,人们对凋亡的认识已逐渐由细胞核为中心的调控模式转变为以线粒体为中心的调控模式,多种损伤机制最终通过影响线粒体功能导致心肌细胞凋亡或坏死,而线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)开放是缺血/再灌注导致线粒体损伤并最终致细胞死亡的关键性事件。近年研究发现,线粒体ATP敏感性钾离子通道(mitochodrial ATP-sensitive K+ channels,mitoKATP)开放对多种组织细胞缺氧缺血损伤有保护作用,参与了缺血预适应和缺血后适应心肌保护作用。对mitoKATP通道的深入研究发现,该通道与MPTP之间存在密切关系,但其相互作用机制仍未完全阐明。本研究以窒息诱发心肌缺氧缺血损伤的新生大鼠为研究对象,观察心肌损伤程度、心肌细胞凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)表达量,检测心肌MPTP开放度、线粒体膜电位(ψm)变化、线粒体活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)生成量,并观察以特异性mitoKATP通道开放剂二氮嗪(Diazoxide)干预后心肌损伤程度以及线粒体功能的变化,以期阐明窒息新生大鼠心肌细胞MPTP开放度与心肌损伤之间的关系、mitoKATP通道开放剂对窒息后心肌细胞MPTP开放度的影响,并进一步阐述mitoKATP通道开放剂对缺氧缺血/再灌注损伤后心肌保护作用机制,为窒息后心肌损伤的治疗提供新策略。方法成年Sprague Dawley(SD)母鼠怀孕第21天行剖宫产,随机分为正常分娩组及动脉夹闭组,正常分娩组不夹闭子宫动脉,所分娩新生鼠为对照组;动脉夹闭组孕鼠以夹闭子宫动脉方法制作宫内窒息新生大鼠模型,再将存活新生大鼠随机分为窒息组、二氮嗪组、格列苯脲组、溶剂组。对照组及窒息组新生鼠出生后不予任何药物干预,二氮嗪组在出生后腹腔注射mitoKATP通道开放剂二氮嗪3mg/kg,格列苯脲组在出生后腹腔注射二氮嗪3mg/kg及mitoKATP通道抑制剂格列苯脲300 g/kg,溶剂组在出生后腹腔注射药物溶剂0.1mM NaOH 0.5ml。每组各30只新生大鼠,于出生24h处死新生大鼠,10只取心脏血以酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法检测血清心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTn I),心肌组织用于分离线粒体,以荧光分光光度计检测MPTP开放度、线粒体ψm、ROS;10只取心肌组织切片以TTC染色方法检测心肌缺血面积;10只取心尖组织制作石蜡切片及超薄切片,以HE染色及电镜观察心肌细胞及线粒体形态变化、以免疫组化染色方法检测心肌组织AIF表达量。结果以均数±标准差( x±s)表示,采用SPSS for Windows 13.0统计软件进行资料分析。结果对照组、窒息组、二氮嗪组、格列苯脲组、溶剂组新生大鼠血清cTnI分别为0.08±0.04、0.40±0.29、0.10±0.04、0.33±0.17、0.34±0.20( g/L)(P<0.01),窒息组明显升高,二氮嗪干预后下降,格列苯脲组、溶剂组与窒息组相近。各组新生大鼠心肌组织切片以TTC染色观察心肌缺血面积,对照组、窒息组、二氮嗪组、格列苯脲组、溶剂组新生大鼠心肌缺血面积分别为8.01±3.48、42.50±15.90、14.79±3.98、31.51±20.86、28.37±14.36(%)(P<0.01),窒息组出现心肌点状坏死,二氮嗪干预后心肌缺血情况有所好转,接近正常组,格列苯脲组、溶剂组与窒息组相近。以HE染色观察新生大鼠心肌细胞损伤的病理改变,窒息组心肌细胞排列紊乱、细胞肿胀、部分细胞溶解,二氮嗪干预后心肌细胞肿胀有所减轻、排列好转,但尚未达正常,格列苯脲组及溶剂组结果与窒息组相近,格列苯脲抑制二氮嗪作用,溶剂对结果无影响。电镜观察窒息组心肌细胞核固缩、核崩解,线粒体空泡变性、外膜破裂、内膜肿胀,二氮嗪干预后线粒体空泡变性减少、线粒体肿胀较窒息组好转,格列苯脲组及溶剂组与窒息组结果相近。对照组、窒息组、二氮嗪组、格列苯脲组、溶剂组新生大鼠心肌组织AIF阳性细胞比例分别为:9.70±3.06、77.50±11.81、44.60±17.49、70.70±14.36、73.60±15.19(%)(P<0.01),窒息组较正常组明显升高,二氮嗪组表达下降,但仍较正常组高,格列苯脲组、溶剂组与窒息组差异无统计学意义;对照组、窒息组、二氮嗪组、格列苯脲组、溶剂组新生大鼠MPTP分别为118.10±19.10、79.40±10.57、106.40±14.61、72.50±11.21、76.20±3.79 (RFU)(P<0.01),ψm分别为1.61±0.08、2.01±0.09、1.86±0.15、1.96±0.27、2.10±0.29 (RFU)(P<0.01),ROS分别为237.10±53.33、875.30±206.62、308.50±103.12、787.40±261.35、892.00±151.45 (RFU)(P<0.01)。窒息组心肌MPTP开放增多、膜电位下降、ROS生成增多,二氮嗪干预后MPTP开放度降低、ROS生成减少,格列苯脲组以及溶剂组结果均与窒息组相近;各组新生大鼠血清cTnI水平与心肌MPTP开放度(RFU)的相关系数r为-0.384 (P<0.01),各组新生大鼠心肌AIF表达量与心肌MPTP开放度(RFU)的相关系数r为-0.725 (P<0.01),由于RFU越小提示MPTP开放度越大,cTnI值、AIF值与RFU值呈负相关,则表示cTnI值、AIF值与MPTP开放度呈正相关。结论1.窒息新生大鼠出现心肌损伤,表现为血清cTnI升高、心肌缺血及坏死、AIF表达增高;并呈现心肌线粒体损伤,表现为心肌线粒体空泡变性、心肌MPTP开放度增大、线粒体膜电位下降、ROS生成增多,cTnI值、AIF值与MPTP开放度呈正相关,提示窒息后心肌MPTP开放度增大是导致心肌损伤的重要原因;2.窒息新生大鼠经mitoKATP通道开放剂二氮嗪干预后,血清cTnI升高程度下降、心肌缺血面积缩小、心肌线粒体形态改善、AIF表达下降,提示二氮嗪干预可保护心肌线粒体功能,从而减轻窒息后缺氧缺血性心肌损伤;3.窒息新生大鼠经二氮嗪干预后心肌MPTP开放度下降、ROS生成减少,该作用可被mitoKATP通道抑制剂格列苯脲拮抗,提示二氮嗪保护心肌线粒体的作用是通过开放mitoKATP通道而起效的,该通道开放可能通过降低线粒体ROS生成,从而抑制MPTP开放,减少线粒体释放AIF,起到保护线粒体功能的作用,但是否通过直接抑制MPTP开放起作用尚需进一步研究证实。
李琳[8]2011年在《埃他卡林和纳他卡林对心肌的保护作用及其药理学机制的研究》文中进行了进一步梳理心血管疾病(CVD)致死人数大概占每年全球死亡人数的20%[1]。有专家称,目前我国正处于心血管疾病暴发的“窗口期”,如果不采取及时有效的干预行动,心血管病将在中国未来的10年内大流行。目前,治疗冠心病的药物主要以抗心肌缺血药物为主,但其心脏保护的作用效果有时并不十分理想,并常伴有各种各样的副作用,因此,研制出疗效好,针对性强,副作用少的新型治疗药物成为抗心肌缺血药物研究的重中之重。早期研究显示,ATP敏感性钾通道(K_(ATP))是心肌抗缺血缺氧的重要靶点[2-5]。但不仅不同组织的K_(ATP)所发挥的功能不同,其分子结构、生理学特性、病理生理和药理学特性也存在组织差异。因此,K_(ATP)开放剂(KCOs)也由于分别作用于不同的亚基,而会产生不同的药理学作用。虽然许多研究者认为K_(ATP)开放剂通过减少坏死、促进缺血后心肌功能恢复、抑制心肌挛缩并减少ATP水解来起到心肌保护作用,但是其具体的作用机制仍未被完全阐明。不过,随着近几年相关研究突飞猛进的发展,线粒体在心脏保护作用中所起的作用引起了人们的关注与重视,线粒体K_(ATP)(mitoK_(ATP))已经成为心肌保护作用的新靶标。埃他卡林(iptakalim, Ipt)是一个脂肪胺类新结构类型的ATP敏感性钾通道开放剂,本实验室早期研究证明:它是细胞膜K_(ATP)开放剂,其抗高血压作用和心血管活性均可被K_(ATP)拮抗剂格列本脲所对抗[6],可与K_(ATP)开放剂结合位点特异性结合[7];表明埃他卡林的保护作用与膜K_(ATP)激活有关。而埃他卡林对于K_(ATP)具有较高的亚型选择性:它对SUR1/Kir6.2无激活作用,对SUR2A/Kir6.2的作用弱,对SUR2B/Kir6.1的激活作用强,比对SUR2A/Kir6.2的作用强10倍,亚型选择性高[8-11]。另有研究表明,埃他卡林可拮抗H2O2诱导的PC12细胞氧化应激损伤作用,该保护作用可能与线粒体ATP敏感性钾通道相关[12]。但是目前,埃他卡林是否对心肌细胞氧化应激损伤有保护作用尚无报道,其作用机制也不明确。纳他卡林(natakalim, Nat)是埃他卡林的新衍生物,与埃他卡林有所不同的是,其具有选择性激动SUR2B/Kir6.1的作用[13-17],但其对于心肌细胞的作用机制也尚不明确。因此,为进一步探讨两种药物可能的作用机理,本实验应用二氮嗪为阳性对照药物,以H2O2在乳鼠原代心肌细胞上模拟建立心肌缺血再灌注损伤后的心肌细胞氧化应激损伤模型,观察两种药物的干预作用;并通过测定心肌线粒体的呼吸功能及基质容积变化,明确两种药物的药理学特征,为寻找到组织选择性强、毒副作用小、保护作用明确的新型抗缺血药物提供理论依据。研究结果:一、埃他卡林和纳他卡林对乳鼠心肌细胞氧化应激损伤的保护作用埃他卡林和纳他卡林对细胞的保护作用可以有效地降低细胞膜的通透性,减少乳酸脱氢酶的外漏;提高超氧化物歧化酶的活性,有效提高细胞自身的抗氧化应激的能力;由此,可以有效地起到细胞的保护作用,提高损伤后细胞的存活率。并且,两种药物的这种细胞保护作用可被线粒体K_(ATP)通道阻断剂5-羟基癸酸酯所拮抗,也可被K_(ATP)通道阻断剂格列本脲阻断。提示,埃他卡林的作用途径可能是通过细胞膜K_(ATP)通道与线粒体膜K_(ATP)通道共同作用产生的。二、埃他卡林和纳他卡林对大鼠心肌线粒体呼吸功能的影响1、埃他卡林对大鼠心肌线粒体呼吸功能的影响①埃他卡林对NADH氧化呼吸链的R4、R3和RCR均没有显着的影响,但是能够提升大鼠心肌线粒体的P/O比值,说明埃他卡林能够减少生成固定数量ATP时所消耗的氧原子;②而对于琥珀酸氧化呼吸链,埃他卡林可以加快其R4呼吸速率从而降低其RCR,说明埃他卡林可以导致琥珀酸氧化呼吸链的轻度解偶联效应。二氮嗪也可以起到与埃他卡林相似的作用,但是埃他卡林在降低RCR方面的效果要略优于二氮嗪(P<0.05)。线粒体K_(ATP)通道特异性拮抗剂5-HD能够拮抗埃他卡林对线粒体FAD呼吸链的作用:5-HD存在时,R4下降,RCR升高,P/O比回落。结果说明埃他卡林对线粒体琥珀酸氧化呼吸链的作用是通过开放mitoK_(ATP)通道引起的;③埃他卡林可以降低线粒体悬液在540nm处的吸光值,5-HD可以拮抗这种作用,其结果从另一侧面证实了埃他卡林是通过开放mitoK_(ATP)通道起作用的。二氮嗪也可以降低其吸光值,并且其作用也可以被5-HD所阻断,验证了二氮嗪是线粒体ATP敏感性钾通道开放剂。2、纳他卡林对大鼠心肌线粒体呼吸功能的影响①纳他卡林与埃他卡林的作用稍有不同,其对于NADH氧化呼吸链的R3没有显着的影响,但可升高R4从而引起RCR降低。对于大鼠心肌线粒体的P/O比值也没有显着影响,说明纳他卡林对心肌线粒体NADH呼吸链能够起到轻微的解偶联作用,且5-HD可以阻断这种作用;②对于FAD氧化呼吸链,纳他卡林可以加快其R4呼吸速率从而降低RCR,说明纳他卡林可以导致琥珀酸氧化呼吸链的轻度解偶联效应。并且5-HD也能够拮抗纳他卡林对线粒体FAD呼吸链的作用:5-HD存在时,FAD呼吸链的R4下降、RCR升高,P/O比回落;③纳他卡林也可以降低线粒体悬液在540nm处的吸光值,加入5-HD后吸光值升高至对照组相近的水平,其结果从另一侧面证实了纳他卡林是通过开放mitoK_(ATP)通道起作用的。基于以上结果,本实验得出以下结论:埃他卡林和纳他卡林均可对心肌细胞过氧化氢损伤起到保护作用,并且两种药物的这种细胞保护作用可被5-羟基癸酸酯所拮抗,也可被K_(ATP)通道阻断剂格列本脲阻断。说明,埃他卡林与纳他卡林抗心肌损伤作用与mitoK_(ATP)通道的开放有关。埃他卡林和纳他卡林均可对线粒体氧化呼吸功能产生影响,但其作用的呼吸链途径与效果不同。埃他卡林仅能升高NADH呼吸链的P/O比值;而纳他卡林可降低NADH链的RCR,起到轻微解偶联作用,并可被5-HD阻断,说明纳他卡林通对mitoK_(ATP)对NADH链起作用。而对于琥珀酸氧化呼吸链,埃他卡林和纳他卡林均可起到轻微的解偶联作用,并可被5-HD做阻断,说明此作用是通过开放mitoK_(ATP)通道引起的。埃他卡林和纳他卡林均可降低线粒体悬液在540nm处的吸光值,5-HD可以拮抗这种作用,其结果从另一侧面证实了埃他卡林和纳他卡林是通过开放mitoK_(ATP)通道起作用的。综上所述,本实验第一次证实了埃他卡林和纳他卡林对H2O2所致的乳鼠心肌细胞氧化应激损伤具有保护作用,且其保护作用可能与mitoK_(ATP)通道有关;并且第一次在大鼠离体心肌线粒体上证实,埃他卡林和纳他卡林具有调节线粒体呼吸功能的作用,并且这一作用可被5-HD所拮抗,说明这一调节作用与mitoK_(ATP)通道开放有关。本研究为埃他卡林和纳他卡林开发为疗效好,针对性强,副作用少的新型抗心肌缺血药物提供了实验依据。
肖艳英[9]2011年在《七氟醚预处理对大鼠心肌的延迟性保护作用及其线粒体机制研究》文中认为研究目的：1.研究七氟醚预处理是否有延迟性心肌保护作用；2.探讨线粒体ATP敏感性钾通道(mito-KATP)和线粒体通透性转换孔(MPTP)在七氟醚预处理的延迟性心肌保护作用中角色；3.观察七氟醚预处理24小时后对大鼠心肌线粒体蛋白质组的影响；4.电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氧酶(NADH-DH)在七氟醚预处理后的表达改变。研究方法研究分为四部分：1.七氟醚预处理是否有延迟相的减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用。健康雄性SD大鼠随机分为4组(n=12)：假手术组(SHAM组)、缺血再灌注组(IR组)、七氟醚预处理后24h组(SEVO-24H组)和七氟醚预处理后48h组(SEVO-48H组)。SHAM组大鼠开胸后左冠状动脉前降支(LAD)只套线,不结扎；IR组大鼠LAD结扎阻断30min后再灌注120min；SEVO-24H组大鼠吸入2.5%七氟醚60min,24h后建立心肌缺血再灌注模型；SEVO-48H组大鼠吸入2.5%七氟醚60min,48h后建立心肌缺血再灌注模型。每组6只大鼠分别记录各组缺血前(T0)、缺血30min(T1)、再灌注30min(T2)、再灌注60min(T3)和再灌注120min(T4)时刻心率(HR)、平均动脉压(MAP)并计算心率收缩压乘积(RPP);再灌注结束后取颈内动脉血测定肌钙蛋白(cTnl),然后处死动物,伊文氏蓝和TTC染色法测心肌梗死面积。每组另6只动物于再灌注结束时电镜下观察各组心肌超微结构,并取心脏左室检测心肌ATP含量和分离线粒体检测线粒体呼吸控制率(RCR)；检测心肌丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性；免疫印记法检测心肌胞浆内细胞色素C(Cyto C)含量,以及心肌Bcl-2和Bax蛋白表达,分离心肌线粒体观察线粒体在200μM[Ca2+]环境下A520改变(提示线粒体肿胀程度),来判断MPTP通透性改变。2.Mito-KATI和MPTP在七氟醚预处理的延迟性心肌保护作用中角色。健康雄性SD大鼠随机分为11组(n=6)。假手术组(SHAM组)、缺血再灌注组(IR组)、七氟醚预处理组(SEVO组)、5-羟基癸酸(触发)+七氟醚预处理组[5-HD(T)+SEVO组]、5-羟基癸酸(触发)组[5-HD(T)组]、七氟醚预处理组+5-羟基癸酸(调节)+[SEVO+5-HD(M)组]、5-羟基癸酸(调节)组[5-HD(M)组]、苍术苷(触发)+七氟醚预处理组[ATR(T)+SEVO组]、苍术苷(触发)组[ATR(T)组]、七氟醚预处理+苍术苷(调节)组[SEVO+ATR(M)组]、苍术苷(调节)组[ATR(M)组]。SHAM组开胸不建立心肌缺血再灌注模型,IR组采取结扎LAD30min后再灌注120min建立在体心肌缺血.再灌注模型,SEVO组在建立心肌缺血再灌注模型前给予2.5%七氟醚吸入共60min。5-HD(T)+SEVO组、5-HD(T)组、ATR(T)+SEVO组组和ATR(T)组分别于七氟醚(氧气)吸入前10min给予5-HD(5mg/kg)或者ATR(5mg/kg)；SEVO+5-HD(M)组、5-HD(M)组.、SEVO+ATR(M)组和ATR(M)组于LAD结扎前15min给予5-HD或者ATR。记录缺血再灌注过程中血流动力学指标HR、MAP和计算RPP,再灌注结束时比较各组心肌梗死面积和血清肌钙蛋白(cTnl)水平,电子显微镜下观察心肌超微结构。3.观察2.5%七氟醚预处理2/4小时后对大鼠心肌线粒体蛋白质组的影响。健康雄性SD大鼠随机分为3组(n=6)。假手术组(SHAM组)、缺血再灌注组(IR组)和2.5%七氟醚预处理组(SEVO组)。IR组大鼠采取结扎LAD30min后再灌注120min建立心肌缺血再灌注模型,SEVO组大鼠吸入2.5%七氟醚(共60min)2/4h后建立心肌缺血再灌注模型,SHAM组.不建立工R模型。于再灌注120min后取心肌左室,采用差速离心结合密度梯度分离线粒体,双向凝胶电泳法(2-DE)分离线粒体蛋白质,分析凝胶图像后找出差异蛋白,并用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定差异蛋白,并用免疫印记法验证其中的两个蛋白电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(NADH-DH)。4.电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(NADH-DH)在七氟醚预处理后表达变化。健康雄性SD大鼠随机分为7组(n=12)。假手术组(SHAM组)、缺血再灌注组(IR组)、七氟醚预处理组(SEVO组)、mitoKATP|沮断剂5-HD(5mg/kg)+七氟醚预处理组(5-HD+SEV0组)、活性氧清除剂2-MPG (20mg/kg)+七氟醚预处理组(MPG+SEVO组)、单独5-HD组和MPG组。5-HD组和2-MPG组均在七氟醚(或者氧气)吸入前10min静脉给予,每组6只大鼠于七氟醚(或氧气)预处理后/4h采用RT-PCR检测心肌VDAC1和NADH-DH的mRNA表达。除SHAM组外,其它各组大鼠于24h后采用结扎LAD的方法建立在体缺血再灌注模型,缺血30min后再灌注120min。再灌注120结束时检测心肌梗死面积和血清cTnI,电镜下观察心肌超微结构,Western blot法检测心肌VDAC1和NADH-DH,以及Bcl-2和Bax表达。研究结果：1.除SHAM组外,其它各组大鼠心肌缺血再灌注过程中HR、MAP和RPP均下降,但是各时间点组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。与SHAM组比较,IR组心肌缺血再灌注后显示明显的心肌梗死面积和心肌cTnI释放(P<0.05),电镜下观察到心肌形态改变提示心肌损伤严重。同时IR组线粒体功能明显受损,包括线粒体RCR降低和心肌ATP含量明显减少；心肌MDA含量增加而SOD活性降低；细胞浆Cyto C释放增加,Bcl-2/Bax比率降低,而线粒体通透性增加(与SHAM组比较,P<0.05)。而七氟醚预处理后24h和48h均能够减少缺血再灌注后心肌梗死而积和cTnI释放,电镜下观察心肌损伤亦减轻(与IR组比较,P<0.05)。七氟醚预处理24h和48h也能增加缺血再灌注后线粒体RCR和心肌ATP含量；降低MDA含量而增加SOD活性；减少细胞浆Cyto C,增加Bcl-2/Bax比率,降低线粒体通透性转换孔开放(与IR组比较,P<0.05)。但是SEVO-24H组和SEVO-48H组比较,在减少心肌坏死和线粒体损伤方而差异均无统计学意义(P>0.05)。2.应用2.5%七氟醚预处理24h后能够减少心肌缺血再灌注后心肌梗死而积和心肌酶释放,心肌超微结构显示损伤减轻(与IR组比较,P<0.05)。在七氟醚预处理前或者在结扎LAD前给予mito-K阻断剂5-HD,都将取消七氟醚预处理的作用,使心肌梗死面积和血清cTnI增加(与SEVO组比较,P<0.05)。而只有在结扎LAD前给予MPTP开放剂ATR才能取消七氟醚减少心肌损伤的作用(与SEVO组比较,P<0.05),在七氟醚吸入前给予ATR对心肌梗死面积和血清cTnI没有影响(与SEVO组比较,P>0.05)。3.二维电泳后得到的凝胶分析显示SHAM组、IR组和SEVO组分析的蛋白质点数平均分别为615±8,634±13和611±9,其中表达差异大于或者等于1.5倍的点有21个。选取差异蛋白质进行质谱分析,初步鉴定小15个蛋白质。这些蛋白质包括叁羧酸循环相关酶如丙酮酸脱氢酶(PDH),支链a-酮酸脱氢酶(BCKDH),异柠檬酸脱氢酶(ICDH):电子传递连相关成分包括NADH脱氢酶(NADH-DH),细胞色素C脱氢酶(COX),电子传递黄素蛋白(ETF)和ATP合酶；转运蛋白类如电压依赖性阴离子通道(VDAC)和线粒体内膜转运体(Tim9B):以及线粒体蛋白合成延长因子(EFTu).这些差异蛋白与能量的生成密切相关,除了BCKDH和EFTu外,这些蛋白质在缺血再灌注损伤后表达减少,而七氟醚预处理能够很大程度上挽回这些蛋白质损失(P<0.05)。七氟醚引起的线粒体蛋白质组改变,整体上提示线粒体能量产生和转运增加,有利于缺血再灌注后心肌能量的恢复。4.七氟醚预处理能够减少心肌梗死面积与cTnI释放(与IR组比较,P<0.05),它的作用被预处理前给予5-HD和2-MPG取消(与SEVO组比较,P<0.05)。七氟醚预处理后4h即发现VDAC1和NADH-DH的mRNA表达增加(P<0.05),与SEVO组比较,5-HD+SEVO组和MPG+SEVO组的VDAC1和NADH-DH的mRNA水平均下降(P<0.05)。七氟醚预处理24h后心肌VDAC1和NADH-DH蛋白表达增加,而事先给予5-HD和2-MPG能够取消七氟醚预处理引起的蛋白质改变(P<0.05)。研究结论：大鼠在体实验研究结果表明：1.七氟醚预处理(2.5%吸入60min)具有延迟性心肌保护作用,能减少在体大鼠心肌缺血再灌注损伤后心肌坏死和线粒体损伤。2. Mito-KATP在七氟醚预处理延迟性心肌保护作用的触发阶段以及调节阶段均起作用,而MPTP只在调节阶段起作用。3.七氟醚预处理24小时后心肌的线粒体蛋白表达谱发生改变,初步鉴定出的差异蛋白质提示,七氟醚预处理的延迟性心肌保护作用可能与线粒体蛋白质组重构有关。4.蛋白质组学找出的差异蛋白质VDACl和NADH-DH在七氟醚预处理后24h表达增加,可能是心肌保护蛋白,而mito-KTP和活性氧参与七氟醚预处理触发阶段启动基因转录。
周有林, 陈莹莹, 沈岳良, 夏强[10]2002年在《缺血预处理通过激活线粒体ATP敏感性钾通道延缓大鼠心肌缺血造成的细胞间脱偶联》文中提出目的:缺血预处理(IPC)可以延迟心肌缺血造成的心肌细胞间脱偶连,从而减少急性心肌缺血造成的恶性心律失常的发生。新近的研究发现,线粒体内膜上的ATP敏感性钾通道(mi-toK_(ATP)是IPC非常重要的触发和/或调节因素,本研究旨在研究IPC延缓心肌缺血造成的细胞间脱偶连是否由mitoK_(ATP)开放所介导。方法:SD大鼠离体心脏Langendorff灌流,用四电极法
参考文献：
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[8]. 埃他卡林和纳他卡林对心肌的保护作用及其药理学机制的研究[D]. 李琳. 中国人民解放军军事医学科学院. 2011
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[10]. 缺血预处理通过激活线粒体ATP敏感性钾通道延缓大鼠心肌缺血造成的细胞间脱偶联[C]. 周有林, 陈莹莹, 沈岳良, 夏强. 中国生理学会第21届全国代表大会暨学术会议论文摘要汇编. 2002
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