李相丰, 何建勇, 田威, 韩果红, 白秀峰[1]2002年在《安普霉素生物合成途径的研究》文中研究指明安普霉素产生菌黑暗链霉菌 (S.tenebrarius) 1- 16经亚硝酸胍 (NTG)、硫酸二乙酯 (DES)诱变筛选获得了生物合成阻断变株。微生物转化实验结果表明 2 -脱氧链霉胺 (2 - DOS)、巴龙霉胺和安普霉胺是安普霉素生物合成的中间体。阻断变株共合成实验结果明确了各阻断变株阻断位点间的关系及上述中间体在安普霉素生物合成中的衍生次序。依据以上实验结果 ,我们提出了安普霉素可能的生物合成途径。
李相丰[2]2001年在《安普霉素生物合成途径的研究》文中指出本文以安普霉素产生菌-黑暗链霉菌S.tenebrarius1-16及由此菌株诱变获得的低产菌株90＃等和生物合成阻断变株D101等来研究安普霉素的生物合成途径。 稳定同位素示踪实验的核磁共振检测结果表明，[2-~(13)C、~(15)]-丝氨酸参与了安普霉素生物合成，~(15)N被标记到安普霉素分子的5个氨基的氮原子上，而~(13)C未被标记到安普霉素分子中，证实丝氨酸是安普霉素生物合成过程中氨基供体。 菌体内S-腺苷甲硫氨酸（SAM）含量的测定结果表明，甘氨酸在安普霉素生物合成过程中提供C˙_7位氨甲基中甲基的过程为甘氨酸经四氢叶酸到SAM，然后由SAM将甲基转移到安普霉素的C˙_7位氨基上。S.tenebrarius1-16、低产菌株和生物合成阻断变株的前体添加实验表明，2-脱氧链霉胺（2-DOS）、巴龙霉胺和安普霉胺是安普霉素生物合成的前体。依据上述实验结果和共合成实验结果，我们提出了安普霉素的可能生物合成途径。 苏氨酸与α-氨基-β-羟基戊酸（AHV）的添加实验结果表明，这两个氨基酸与丝氨酸一样，对安普霉素的生物合成有显着的促进作用。 建立了水解制备2-DOS、巴龙霉胺、辛二糖胺和安普霉胺的实验操作方法。
肖剑萍[3]2014年在《暗霉素定向生物合成研究》文中提出妥布霉素是临床使用的重要抗生素,其产业化生产菌黑暗链霉菌Tt-49主产安普霉素、氨甲酰妥布霉素和妥布霉素等复合物。利用基因工程技术,先阻断安普霉素的生物合成,后进一步阻止氨甲酰基修饰,获得单组分妥布霉素工程菌。在此基础上,插入可能负责庆大霉素C3',C4'脱羟基作用的基因模块,探索其与安普霉素和妥布霉素生物合成基因组合的可能性。具体内容如下：1.aprH基因缺失突变株TH304的构建：构建重组质粒pTH407,经接合转移导入黑暗链霉菌Tt-49,得到单交换工程菌TH303。经松弛培养后,利用影印筛选和PCR鉴定,获得aprH基因缺失突变株TH304。经发酵检测,TH304生产力约2250μ/mL,为Tt-49的75%。TLC分析和MS分析确认,TH304不再合成安普霉素,主要积累氨甲酰妥布霉素。但与Tt-49相比,TH304生长周期较长,产孢能力差,不利于生产上的应用。2. aprJ基因缺失突变株TJ302的构建：构建重组质粒pTJ401,导入黑暗链霉菌Tt-49,获得aprJ基因缺失突变株TJ302。发酵结果显示,TJ302不再合成安普霉素,主要积累氨甲酰妥布霉素,总效价约2500 μ/mL,为Tt-49的85%。经考察发现,TJ302生长性状稳定,适合进一步改造。3. tobZ基因缺失突变株TJZ308的构建：将重组质粒pTZ501,导入黑暗链霉菌TJ302,获得tobZ基因缺失突变株TJZ308。发酵结果显示,TJZ308为单组分妥布霉素产生菌,且发酵单位与TJ302相近。发酵提取妥布霉素无需层析分离,就能达到药典规定的质量标准,解决了困扰企业几十年的关键技术难题,填补了国内外的研究空白。4.庆大霉素3',4'脱羟基酶基因与妥布霉素生物合成基因的组合研究：构建将红霉素启动子ermE*组装于genB3-P-B4基因模块上游的重组质粒pZP606,导入黑暗链霉菌TJZ308,组合至妥布霉素生物合成基因簇的tobZ位点,获得工程菌TZP310。发酵结果显示,TZP310发酵单位显着下降,仅300μ/mL左右。经MS分析确认,genB3-P-B4基因模块的插入,破坏了妥布霉素的正常合成,使代谢产物停滞于尼泊拉胺。5.庆大霉素3',4'脱羟基酶基因与安普霉素生物合成基因的组合研究：构建重组质粒pDP605,导入黑暗链霉菌ST314,组合至安普霉素生物合成基因簇的aprD3-D4位点,获得工程菌TDP306,其发酵单位与ST314相近。经MS分析确认,TDP306仍积累卡那霉素B, genB3-P-B4基因模块的插入,并未达到定向合成地贝卡星的预期效果。但确定了外源基因的插入位点,为进一步研究庆大霉素3',4'脱羟基酶基因在链霉菌中的表达,生物合成地贝卡星奠定了基础。
程杉[4]2003年在《安普霉素生物合成相关基因aprC、aprD的研究》文中研究说明将黑暗链霉菌H6中与安普霉素抗性基因上游连锁的BglⅡ-BamHI约4.0kb的片段亚克隆、测序，结果表明在这一范围内没有完整的开放阅读框架。原因可能为这一部分己达到了安普霉素生物合成基因簇的末端，不再编码安普霉素生物合成相关基因。 克隆抗性基因下游4.8kb片段，测序表明这个片段中有两个完整的ORF：ORFC和ORFD；和一个不完整的ORF：ORFF。经网上Blast分析，结果表明ORFC编码的蛋白与海藻糖和麦芽糖水解酶(trehalose and maltose hydrolase)或海藻糖和麦芽糖磷酸化酶(trehalose and maltose phosphrylase)同源，命名为aprC。ORFD编码的蛋白与UDP-葡萄糖-4-异构酶(UDP-glucose-4-epimerase)同源，命名为aprD。ORFF是不完全的ORF，该阅读框架编码的蛋白进行网上blast分析，在GenBank中没有发现与之明显同源的蛋白，无法确定其具体功能。这一ORF命名为aprF。 抗性基因下游片段和报告基因ermE、xylE插入到质粒pHZ132中，构建用于接合转移质粒。通过接合转移的方法将质粒导入黑暗链霉菌H6中，筛选基因发生重组的菌株，得到编号H6-42-4重组菌株，PCR实验证明质粒DNA已经整合到黑暗链霉菌H6染色体DNA上，传代实验证明基因重组菌株有良好的基因稳定性。H6-42-4号菌株发沈阳药科人学硕十毕业论文 摘要酵不产生安普霉素，因此克隆得到的prC、p rD基因和安普霉素生物合成相关。 将获得的妥布霉素生产菌株H6－42－4通过NTG诱变和NTG复合妥布霉素耐受诱变筛选妥布霉素高产菌株，效价达到 2095 u／ml，其中含有氨甲酚妥布霉素引．9％。
倪现朴[5]2011年在《黑暗链霉菌aprD3和aprD4基因的研究及卡那霉素B高产菌株的构建》文中指出黑暗链霉菌主要产生氨甲酰妥布霉素、氨甲酰卡那霉素B和安普霉素叁种抗生素,氨甲酰妥布霉素和氨甲酰卡那霉素B是4,6取代2-脱氧链霉胺类氨基糖苷抗生素,而安普霉素是4取代2-脱氧链霉胺类抗生素,且结构中有一独特的八碳糖。氨甲酰妥布霉素和氨甲酰卡那霉素B结构非常相似,差别只在氨甲酰卡那霉素B的C-3’位为羟基而氨甲酰妥布霉素C-3’位为氢,安普霉素虽然与它们结构有较大差异,但其C-3’位也为氢。推测氨甲酰妥布霉素和氨甲酰卡那霉素B为同一生物合成途径合成,其生物合成基因簇为妥布霉素生物合成基因簇,而安普霉素有其独立的生物合成途径,妥布霉素生物合成基因簇和安普霉素生物合成基因簇均已经被克隆。由于氨甲酰妥布霉素和安普霉素结构中都有C-3’位脱氧结构,且前体的对应位置为羟基,所以推测它们的生物合成途径中有C-3’位脱氧这一过程。因此,通过实验证实氨甲酰妥布霉素和安普霉素生物合成中C-3’脱氧有关的基因不仅可以为2-脱氧链霉胺类氨基糖苷抗生素的脱氧机制研究打下基础,而且可以在此基础上通过基因工程的方法构建只产目标产物的组份优化的菌株。对已经报道的氨基糖苷类抗生素合成基因进行生物信息学分析,推测安普霉素生物合成基因簇中的aprD3和aprD4可能参与安普霉素和妥布霉素生物合成中的脱氧。为了研究aprD3基因的功能,通过基因阻断试验对其进行阻断。以黑暗链霉菌H6总DNA为模板PCR扩增同源片段,构建阻断质粒。质粒通过接合转移的方法转化黑暗链霉菌H6,依次筛选单交换和双交换菌株。与出发菌株相比,aprD3阻断变株产生一新的抗生素。通过质谱和核磁对其结构进行确证,证实该新组分为氧化安普霉素,说明AprD3参与安普霉素生物合成中脱氧过程。AprD3是首个得到实验证实的参与2-DOS类氨基糖苷类抗生素的脱氧结构形成的酶。通过基因阻断试验对aprD4基因功能进行研究,aprD4阻断变株不再产生氨甲酰妥布霉素,而氨甲酰卡那霉素B的产量大幅度提升,同时产生氧化安普霉素,说明AprD4同时参与氨甲酰妥布霉素和安普霉素生物合成中脱氧过程。氨甲酰卡那霉素B经水解能够得到卡那霉素B,卡那霉素B是合成抗生素地贝卡星和阿贝卡星的原料。如果能得到卡那霉素B组份优化的高产菌株,将具有重大的应用价值。为阻断安普霉素和氨甲酰妥布霉素的合成,构建基因阻断质粒,将黑暗链霉菌H6基因组删除4.2kb片段,该片段包括完整的aprQ基因和aprD3、aprD4部分序列。对阻断变株SPU313进行发酵培养,对发酵产物进行鉴定。阻断变株只产生氨甲酰卡那霉素B,而不再产生其他抗生素。对阻断变株效价进行测定,氨甲酰卡那霉素B的产量是出发菌株H6的五倍。但氨甲酰卡那霉素B需经水解才能得到卡那霉素B,为了直接发酵生产卡那霉素B,将负责氨甲酰基转移的基因tacA进行阻断,从而得到了卡那霉素B高产菌株。证明通过基因工程方法不仅可以去除杂质组分,而且可以得到原始菌株中不产生的目标产物。
杨洪涛[6]2007年在《林可霉素产生菌的基因改造》文中研究指明林可霉素(Lincomycin)是由林可链霉菌(Streptomyces lincolnensis)产生的一类林可糖胺类抗生素，具有抗革兰氏阳性菌的作用。在林可链霉菌基因功能不完全明确，国内外研究报道较少的情况下，探索式的对林可链霉菌加以基因改造，期望提高林可霉素发酵产量，得到适应工业化发酵生产的菌株。本论文在林可霉素生物合成关键基因lmbH终止密码子后插入了一段去掉启动子的安普霉素抗性基因apr，使apr和lmbH处于同一转录单位。希望apr在lmbH的启动子的带动下转录并且表达，根据重组菌株抗安普霉素能力的强弱建立林可霉素高产菌株筛选模型。林可链霉菌发酵实验证实重组菌株具有了安普霉素抗性，但对浓度的敏感度较差，林可霉素的发酵产量下降为33％，因此该实验方案并未获得成功。本论文构建了带有红霉素抗性基因启动子PermE的透明颤菌血红蛋白基因vgb，并将它整合进林可链霉菌黑色素生物合成基因melC中，希望失活melC的同时表达血红蛋白VHb。实验证实重组菌株不再产生黑色素，且VHb得到表达，表现出生物学活性。不同装瓶量摇瓶发酵实验表明在正常溶氧条件下重组菌株的林可霉素产量同对照菌株相近，但在低氧条件下表现出远高于对照菌株的林可霉素生产能力，说明该重组菌株具有在低溶氧条件下保持一定发酵水平的优良特性，具备工业化发酵生产的要求。因此该实验方案获得成功。
杨钧[7]2005年在《妥布霉素生物合成基因的研究》文中提出黑暗链霉菌H6(Streptomyces tenebrarius H6)产生叁种抗生素：安普霉素、氨甲酰妥布霉素和少量氨甲酰卡那霉素B。为研究其抗生素生物合成途径，对黑暗链霉菌H6染色体上的tbmA基因进行基因阻断实验，利用PCR获得tbmA基因内部863bp片段，构建基因阻断穿梭载体pSPU112，经接合转移导入黑暗链霉菌H6，筛选单交换阻断变株，并用Southern blot验证阻断变株的tbmA已经被破坏。经发酵产物分析，阻断变株不再合成氨甲酰妥布霉素，只合成安普霉素。首次从分子水平证明了tbmA只参与氨甲酰妥布霉素生物合成，而不参与安普霉素的生物合成。 为研究黑暗链霉菌H6中的妥布霉素生物合成基因簇，对李天伯等克隆得到约50kb连锁区域左右两端的片段(E片段、G片段)进行阻断实验，从而初步确定了此50kb区域中妥布霉素生物合成基因簇的大致范围。并通过Southern杂交的方法对此50kb区域与Madan Kumar Kharel等人克隆得到的13.8kb可能的妥布霉素生物合成基因簇间的关系进行初步研究，结果表明二者是完全独立的两个区域，并没有重迭的部分，因此推断50kb区域右侧未克隆到的部分仍包含妥布霉素生物合成基因，这为获得妥布霉素生物合成的完整基因簇，最终阐明妥布霉素生物合成途径奠定基础。 对50kb区域右端片段(G片段)进行酶谱分析和部分序列测定，发现一个完整的ORF和一个不完整的ORF。网上BlastX分析没有发现明显同源序列，推测为一个新基因，命名为tobH。利用tobH内部片段构建基因中断载体，通过接合转移导入黑暗链霉菌H6，发生同源单交换，获得阻断株H6(pSPU119)。Southern blot实验验证阻断位点正确，阻断株发酵组分中不再含有妥布霉素，表明tobH是妥布霉素生物合成途径中的重要基因。
田威[8]2002年在《安普霉素产生菌的研究》文中研究指明本文以尼拉霉素单一组分—安普霉素产生菌S.tenebrarius A04(发酵单位为2847u／ml)为出发菌株，通过对单孢子悬液和超声波破碎菌体的诱变处理并复合筛选模型，获得了遗传特性稳定的单组分高产菌株：A2-23、A2-30、ASM6、A1-16，摇瓶发酵单位达4800-5200u／ml。证明了UV处理复合耐受自身产物、UV处理复合耐受链霉素能获得较好的筛选结果。 以菌株A1-16为实验菌株，运用均匀设计方法，对发酵培养基、通气量、接种量等进行了考察，得到发酵培养基和种子培养基的优化配方。对叁级发酵工艺、补料工艺等发酵工艺条件进行了优化，进一步确定了中试发酵工艺条件，4m~3发酵罐上平均发酵单位达4478u／ml。 通过氨基酸添加实验研究了安普霉素生物合成途径中的氮的来源及调节机制。Glu、Gln及α—酮戊二酸添加实验结果表明Glu、Gln对菌体的生长无明显的影响，但能强烈促进安普霉素的生物合成，且相同浓度条件下Gln的促进作用明显高于Glu，而α—酮戊二酸则对安普霉素的生物合成有抑制作用。因而我们认为Gln可能是安普霉素生物合成氮元素的供体。Arg添加实验结果表明，Arg可能通过两种途径影响黑暗链霉菌体内的氮代谢：(1)Arg可能影响胞外蛋白酶的活性，进而促进含氮大分子物质的分解代谢，补充发酵过程中的氮素来源。(2)Arg可能在体内转化为Glu，同时增加了游离氨的含量，进而促进安普霉素的生物合成。
王普宏[9]2007年在《利用基因突变技术进行安普霉素单组分产生菌的选育》文中研究说明黑暗链霉菌H6(Streptomyces tenebrarius H6)产生叁种抗生素：安普霉素、氨甲酰妥布霉素和少量氨甲酰卡那霉素B。多年来科研人员对黑暗链霉菌的研究主要集中于常规诱变育种和优化生产工艺等方面，虽然取得一些好的进展，但对其抗生素合成的途径了解较少。二十世纪八十年代兴起的链霉菌基因工程研究，已在抗生素生物合成基因的克隆、产量提高、组分改善及杂合抗生素产生等方面取得长足的进步。为获得黑暗链霉菌H6安普霉素单组分产生菌，对黑暗链霉菌H6染色体上的tacA基因进行基因进行阻断实验，利用基因突变技术来选育安普霉素单组分产生菌。利用PCR分别获得tacA基因内部523bp片段和1063bp片段，将两片段重新连接到pIJ2925内。在构建好的质粒中加入xylE报告基因和ermE基因做为筛选标记，构建基因阻断穿梭载体。转化到大肠杆菌DH-5α。经接合转移导入黑暗链霉菌H6，筛选双交换阻断变株。经发酵产物分析，阻断变株不再合成氨甲酰妥布霉素，只合成安普霉素。从而获得安普霉素单组分产生菌。
毕海[10]2008年在《头霉素C产生菌关键基因改造》文中认为头霉素C(cephamycin C)是由棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)产生的一种β-内酰胺类抗生素,由于在其结构的7位含有一甲氧基,因此对β-内酰胺酶具有良好的稳定性,从而引起广泛的关注。由于棒状链霉菌主产物除了头霉素C外还包含克拉维酸等其他β-内酰胺类化合物,因此,如何在提高头霉素C产量的同时降低其他产物的含量成为目前研究的重点。本论文拟通过基因工程的方法,失活克拉维酸生物合成基因,从而构建只产生头霉素C的基因工程菌株。首先,将安普霉素抗性基因插入到棒状链霉菌pyc基因(克拉维酸生物合成的关键基因之一)片段中,得到重组质粒pBH14。通过接合转移的方法将上述质粒转入棒状链霉菌NRRL3585,利用抗性标记筛选同源双交换菌株获得基因阻断菌株NRRL3585-B1。结果显示插入失活的菌株克拉维酸生产能力大幅度下降,但同时头霉素C的生物合成也受到较大影响。然后,采用PCR的方法对pyc基因实施点突变,得到重组质粒pBH25,并将该质粒转入棒状链霉菌NRRL3585-B1,得到重组菌株。发酵结果显示重组菌株克拉维酸生产能力下降的同时头霉素C生物合成能力大幅提高。但对于重组菌株遗传稳定性研究表明,点突变pyc基因阻断突变株经多次传代后生产能力恢复至野生菌株水平,遗传稳定性不佳。使用Deletion失活的方法删除pyc基因中部15个碱基,得到重组质粒pBH35。将其转入棒状链霉菌NRRL3585-B1中,通过同源双交换菌株的筛选得到Deletion失活的阻断变株。发酵结果显示,该阻断变株合成克拉维酸的能力显着降低同时头霉素C的生产能力大幅提高。
参考文献：
[1]. 安普霉素生物合成途径的研究[J]. 李相丰, 何建勇, 田威, 韩果红, 白秀峰. 中国抗生素杂志. 2002
[2]. 安普霉素生物合成途径的研究[D]. 李相丰. 沈阳药科大学. 2001
[3]. 暗霉素定向生物合成研究[D]. 肖剑萍. 福州大学. 2014
[4]. 安普霉素生物合成相关基因aprC、aprD的研究[D]. 程杉. 沈阳药科大学. 2003
[5]. 黑暗链霉菌aprD3和aprD4基因的研究及卡那霉素B高产菌株的构建[D]. 倪现朴. 沈阳药科大学. 2011
[6]. 林可霉素产生菌的基因改造[D]. 杨洪涛. 沈阳药科大学. 2007
[7]. 妥布霉素生物合成基因的研究[D]. 杨钧. 沈阳药科大学. 2005
[8]. 安普霉素产生菌的研究[D]. 田威. 沈阳药科大学. 2002
[9]. 利用基因突变技术进行安普霉素单组分产生菌的选育[D]. 王普宏. 贵州大学. 2007
[10]. 头霉素C产生菌关键基因改造[D]. 毕海. 沈阳药科大学. 2008