唐玉阳[1]2000年在《利用人HLA Ⅰ类分子表型特异性细胞观察恶性疟原虫CTL表位的内源递呈及其与Ⅰ类分子的交连反应》文中指出杀伤性T淋巴细胞(CTL)是红细胞前期恶性疟原虫免疫防护的关键环节。有效的CTL反应可以阻断疟原虫的生活周期，是目前极受关视的疟疾疫苗设计方案。HLA Ⅰ类分子的多态性限制了旨在刺激产生CTL的免疫治疗工作对人群的保护范围，使抗疟疫苗的研究明显复杂化。CTL多表位重组疫苗的构建是目前解决HLA Ⅰ类分子多态性一个较好的途径。当前恶性疟CTL疫苗研究所面临的另一个问题是缺乏合适的动物模型。开展有关的体外研究，对疫苗潜在的免疫原性进行体外预测，不仅是必然的，而且是可能的。 近年来的研究发现一些HLA Ⅰ类分子结合肽的锚定位点的氨基酸残基具有重叠性，这些锚定残基被称为HLA分子结合肽基序(Motif)，具有相同肽基序一类HLA Ⅰ类分子组成一个HLA Ⅰ类分子结合超亚型(Supertype)，现有的几乎所有的HLA-A和-B分子都被包括在九个这样的超亚型中。每个结合超亚型对应的共同的肽基序则称为共用肽段(supermotif)。含有相应共用肽段的肽常可与同一结合超亚型的不同HLA Ⅰ发生交连反应。HLA结合亚型和共用肽段的发现，为克服MHC多态性的CTL疫苗设计提供了一个崭新的设想，即通过寻找能与多个HLA Ⅰ类分子结合的表位，代替上述常见多表位疫苗的研究。从而避免了后者繁琐复杂的工作，提高了工作效率，是CTL疫苗研究的新方向。 本实验所选用两个恶性疟抗原CTL表位TR和SH，均来自非洲株系，其中TR来自thrombspondin相关的尚未命名蛋白(TRAP)，为HLA-2.1限制；SH来源于子孢子肝细胞结合抗原1(SHEBA)，己证实与HLA-B51有高亲和力。上述两个恶性疟CTL表位分别含有HLA-A2和HLA-B7超亚型的共用肽段。 将对应于以上表位的DNA序列设计成微型基因tr和sh。并将其分别克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1／Hygro(+)，构建两个重组质粒pcDNA3.1／tr和
孙元欣[2]2017年在《AA中miR34a促进T细胞活化和HLA-G抑制B细胞生长的作用及机制研究》文中研究指明[研究背景]再生障碍性贫血(再障,aplastic anemia,AA)是一种由多种病因引起的获得性骨髓衰竭综合征,临床表现为不同程度的全血细胞减少所致的贫血、出血和感染,尤其是重型再障,起病较急,进展迅速,重度贫血、脏器出血以及严重感染发生率高,严重威胁患者的生命安全,是难治性血液系统疾病之一。再障发病呈世界性分布,国内发病率远高于西方国家,并以中青年居多。再障发病机制复杂,呈明显异质性和重叠性,主要概括为"种子""土壤"和"虫子"三个方面:"种子"造血干细胞缺陷,包括造血干细胞量的减少和质的缺陷;作为"土壤"的造血微环境异常,包括骨髓基质细胞和造血生长因子的异常;而"虫子"则代表紊乱的免疫功能,异常活化的T细胞及其分泌的细胞因子使造血干细胞凋亡增多;此外某些遗传因素也被认为与再障的发病有关。近年来,随着免疫学以及细胞遗传学等技术的发展,再障的发病机制的研究获得长足进步,目前普遍认为获得性再障是一种T细胞异常活化导致的自身免疫性疾病,免疫攻击的靶细胞主要是骨髓中的造血十/祖细胞。除此以外,许多潜在的自身抗原能够诱导异常的免疫反应进而攻击造血干/祖细胞,其相应的自身抗体已被大量检测到,提示B细胞介导的体液免疫在再障发病中也起到一定作用。MicroRNA(miRNA)是一类序列高度保守的,长度约为19～25个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA,通过和靶基因信使RNA(mRNA)碱基配对引导沉默复合体降解mRNA或阻遏其翻译,从而对基因进行转录后表达的调控,参与生命过程中的许多重要进程,包括早期发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化以及脂肪代谢等。随着生物信息学的发展,越来越多的miRNA分子及其作用被发现,其中miR 146a和miR 182分别在固有免疫和适应性免疫方面发挥着重要的调节作用。既往研究表明在一些自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等,许多异常表达的miRNA通过作用于其靶基因参与疾病的发生发展,而miRNA与再障的相关性研究少有报道。本课题中我们首先收取3个重型再障患者和3个健康对照的骨髓T细胞,应用miRNA芯片技术筛选出两组中差异表达的miRNA,经扩大样本量验证后得出miR34a表达量在再障骨髓T细胞中明显升高,进而进行功能实验并建立再障的动物模型,探讨miR34a及其靶基因在再障发病机制中的作用,明确miR34a介导T细胞活化的分子机制,为近一步阐明再障的免疫发病机制以及再障的靶向治疗提供了理论依据。人白细胞抗原(human leukocyte antigen.HLA)-G是一种非经典的HLA I类基因,不同于经典的HLAI类基因,HLA-G表现为低度多态性,其编码蛋白主要存在于母胎界面的滋养层细胞、胸腺、角膜、胰腺以及红系祖细胞和内皮前体细胞。HLA-G分子有七种异构体,包括4种膜表面蛋白和3种可溶性蛋白,通过直接作用于表达其抑制性受体免疫球蛋白样转录子(immunoglobulin-like transcripts,ILTs)的细胞发挥免疫抑制效应,诱导免疫耐受。ILTs主要包括三种:ILT2(LILRB1/CD85j),ILT-4(LILRB2/CD85d)和 KIR2DL4(CD158d),其中ILT2主要见于NK细胞、淋巴细胞和树突状细胞,ILT4主要见于单核细胞、树突状细胞和巨噬细胞。近年来随着研究深入,HLA-G/ILTs的免疫抑制作用受到越来越多的关注,现已发现在器官移植、肿瘤、病毒和细菌感染以及自身免疫性疾病等病理情况下HLA-G蛋白表达异常,影响T、B、NK等免疫细胞的正常作用,从而诱导免疫耐受和肿瘤的免疫逃逸等。再障是一种免疫紊乱导致的造血衰竭综合征,目前尚无文献报道HLA-G是否参与再障发生发展,本课题通过检测再障患者骨髓和外周血细胞中HLA-G及其受体的表达情况,初步探讨HLA-G/ILTs在再障免疫紊乱中发挥的作用,有可能为再障的免疫机制研究开辟新的领域。第一部分:AA中miR34a/DGK ζ增强骨髓T细胞活化的作用及机制研究研究目的:通过miRNA芯片技术筛选出AA骨髓T细胞中异常表达的miRNA分子,扩大样本量验证该miRNA分子的表达量,分析其与临床特征的关系,通过临床标本检测以及建立再生障碍性贫血的动物模型,明确该miRNA分子在AA骨髓T细胞活化中的作用,近一步确定该miRNA的靶基因并探讨其参与T细胞活化的分子机制,从而为AA的免疫机制研究提供新的思路。研究方法:1.标本采集:收集49例AA患者和28例健康对照的骨髓标本,其中49例AA患者中包括33位重型再障患者和16位非重型再障患者。2.筛选miRNA分子:取3例重型再障患者和3例健康对照的骨髓单个核细胞,经免疫磁珠分选出CD3+T细胞,应用miRNA芯片技术筛选两组骨髓CD3+T细胞中差异表达的miRNA分子。3.验证芯片结果:实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)法检测骨髓单个核细胞中miR34a的表达情况,并分析miR34a与再障患者临床特征的相关性。4.确定miR34a在骨髓naive T细胞的表达情况:免疫磁珠分选8例重型再障患者和8例正常人naive T和non-naive T细胞,应用PCR检测naive T和non-naive T细胞在两组中的表达量,明确miR34a表达重升高并非AA骨髓T细胞活化所致的反应性升高。5.确定miR34a在AA中发挥作用的靶基因:应用PCR及免疫印迹法(western blot)检测miR34a可能的靶基因二酯酷甘油激酶(diacylglycerol kinase.DGK)ζ在骨髓单个核细胞的表达水平,并分析miR34a和DGKζ表达相关性。6.体外功能实验探究miR34a在AA骨髓T细胞活化中的作用6.1慢病毒转染AA骨髓单个核细胞:将含有miR34a抑制序列和无义序列的慢病毒转染AA骨髓单个核细胞,5天后收集细胞后在荧光显微镜下观察并用流式细胞术检测慢病毒转染效率。6.2流式细胞术检测T细胞活化:收集细胞后标记CD4和CD8以及T细胞活化的标志分子CD25和CD69,比较两组中CD4+和CD8+T细胞的活化水平。7.比较miR34a基因敲除小鼠(miR34a-/-)和正常野生小鼠(wild-type,WT)在骨髓造血系统的区别:进行外周血细胞和骨髓造血干/祖细胞计数,同时流式细胞术检测两组外周血、骨髓、脾脏、淋巴结等处的CD4+和CD8+细胞的比例。8.小鼠体外功能试验探究miR34a在T细胞活化中的作用:取miR34a-/-和WT小鼠的脾脏和淋巴结细胞于细胞培养板中,加入anti-CD3和anti-CD8 mAbs刺激T细胞活化,比较两组T细胞活化状态、增殖情况以及下游信号分子的表达水平。8.1 T细胞表面活化标志检测:应用流式细胞术检测T细胞表面CD25和CD69的表达水平。8.2 T细胞增殖检测:应用流式细胞术直接检测两组T细胞Brdu的掺入率以及CFSE标染后应用流式观察细胞分裂以明确miR34a对T细胞增殖的影响。8.3 T细胞活化信号通路中分子检测:应用western blot检测两组细胞中DGKζ的表达量以及下游信号分子ERK的磷酸化水平。9.构建再障的动物模型:将miR34a-/-和WT小鼠的淋巴结细胞经尾静脉注入经亚致死量照射的半相合受体鼠,监测小鼠血常规变化,12天后比较两组小鼠骨髓造血情况以及T细胞增殖情况。将小鼠股骨进行石蜡包埋切片后HE染色观察骨髓增生情况,应用流式细胞术检测两组小鼠骨髓中造血干/祖细胞比例和数量,同时检测两组中T细胞的比例。结果:1.芯片结果:应用芯片技术在重型再障和健康对照骨髓T细胞之间筛选出31个表达明显差异的miRNA分子,其中16个过表达而15个表达水平降低。2.验证芯片结果:RT-PCR检测miR34a表达量在AA中明显升高,且在重型再障组和非重型再障组之间差别较大。同时miR34a水平与再障患者的外周血中性粒细胞数和网织红细胞计数均成反比。但在AA组中miR34a水平在naive T细胞和non-naive T细胞之间无明显差别。3.确定靶基因:参照既往文献报道和生物信息学软件分析,选取7个基因作为候选基因,其中DGKζ mRNA水平在AA组中明显低于健康对照组且与miR34a水平成负相关,AA骨髓单个核细胞中DGKζ蛋白含量亦明显降低。同时AA组骨髓T细胞表达CD69水平明显高于对照组。4.下调再障骨髓T细胞中miR34a的表达量使T细胞活化水平降低:转入miR34a抑制序列的再障骨髓T细胞表达DGKζ明显增多,其表面CD69和CD25表达量明显降低。5.MiR34a-/-小鼠和野生型小鼠骨髓造血细胞量的比较:miR34a-/-小鼠外周血和骨髓中CD4+T细胞的比例较野生小鼠明显降低,而在外周血各系细胞数、骨髓有核细胞数、骨髓造血干/祖细胞数以及CD4+T细胞和CD8+T细胞在脾脏和淋巴结等处的比例在两组均无明显差别。6.MiR34a-/-小鼠的体外功能实验证明miR34a敲除能够显著降低小鼠T细胞的活化水平和增殖能力:小鼠淋巴结细胞在体外经anti-CD3和anti-CD8 mAbs刺激后,miR34a-/-组T细胞表面的CD69和CD25水平较野生组明显降低,Brdu掺入率亦明显减低,CFSE染色显示miR34a-/-组细胞分裂率明显低于野生组。除此以外,作为降解二脂酰甘油(diacylglycerol,DAG)的重要激酶DGKζ在T细胞活化以后明显降低,但在miR34a-/-组其降低幅度明显小于野生组,同时T细胞活化信号通路中的下游分子ERK的磷酸化水平在MiR34a-/-组明显低于对照组。7.再障动物模型中miR34a敲除使T细胞功能减弱:应用野生型和miR34a敲除的淋巴结细胞均可成功构建再障动物模型,两种淋巴细胞均可在受体鼠骨髓中攻击造血干/组细胞,但在miR34a-/-组受体鼠骨髓中造血干/组细胞比例和数量明显高于野生组,同时miR34a-/-组骨髓中CD8+T细胞比例明显低于野生组。结论:1.再障患者和健康对照的骨髓T细胞miRNA表达谱存在明显差异,提示miRNA分子可能参与AA中T细胞介导的免疫紊乱。2.逆转AA骨髓T细胞中miR34a的表达水平可以明显降低T细胞的活化水平。3.再障动物模型的建立更加证明了 miR34a基因敲除后T细胞活化增殖能力减弱。4.再障中升高的miR34a通过作用于DGKζ显著增强了 T细胞的活化水平,从而在AA的发生发展过程中发挥重要作用,有望成为AA治疗的新靶点。第二部分:AA中HLA-G/ILT2抑制骨髓B细胞生长的作用及机制研究研究目的:明确HLA-G及其受体ILT2、ILT4在AA骨髓和外周血中的表达情况,探究HLA-G/ILT2相互作用对AA骨髓中B细胞的影响以及可能的分子机制,为再障的免疫机制研究提供新的方向。研究方法:1.标本采集:收集46例再障患者和28例正常对照的外周血和骨髓,其中包括31例重型再障患者和15例非重型再障患者,分离血浆、骨髓上清和单个核细胞。2.应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测再障组和对照组骨髓上清和外周血浆中可溶性HLA-G的水平。3.应用real-time PCR检测再障组和对照组骨髓和外周血单个核细胞中HLA-G、ILT2和ILT4在转录水平的表达量。4.应用流式细胞术检测再障组和对照组骨髓和外周血单个核细胞表面HLA-G、ILT2和ILT4蛋白的表达量。5.应用流式抗体标染再障患者和健康对照骨髓中CD19+B细胞表面的sIgD和sIgM.以此将CD19+细胞分为祖/前B细胞、未成熟B细胞和成熟B细胞,同时应用流式细胞术检测ILT2在各群细胞的表达量。6.体外功能实验:从正常对照骨髓单个核细胞中应用免疫磁珠分选CD19+ B细胞,将其种于铺有OP9基质细胞的培养板中,同时加入细胞因子IL-7、SCF和Flt3-L。实验组加入重组人HLA-G蛋白或含有高浓度HLA-G的再障患者骨髓上清,通过比较各组B细胞Brdu的掺入率明确HLA-G对B细胞生长的作用。除此之外,应用anti-ILT2和anti-HLA-G中和抗体阻断HLA-G/ILT2的结合,比较阻断组和非阻断组B细胞Brdu掺入率证明HLA-G对B细胞生长的作用。研究结果:1.可溶性HLA-G在再障骨髓上清中明显高于正常对照组,但在外周血浆中两组无明显差别,同时发现在骨髓上清中可溶性HLA-G水平明显高于外周血浆,提示可溶性HLA-G在骨髓和外周血中分布不均,在此二处对免疫细胞的作用强度可能不同。2.再障组骨髓单个核细胞中ILT2mRNA的表达量明显高于对照组,外周血中无明显差别;同时外周血和骨髓中ILT4 mRNA的表达量在两组中无明显差异。3.再障组骨髓B细胞表达ILT2蛋白的比例明显高于对照组,CD4+T细胞、CD8+T细胞和CD14+单核细胞表面ILT2、ILT4蛋白水平在两组无明显差异,外周血单个核细胞中亦无明显差异。4.再障骨髓B细胞各亚群比例呈现异常,成熟B细胞比例明显增高,而原/祖B细胞比例明显降低;同时各亚群表达ILT2的水平有差异,对照组成熟B细胞表达ILT2水平最高,未成熟B细胞次之,原/祖B细胞最低,而在再障组成熟B细胞表达ILT2水平与对照组无异,而原/祖B细胞和未成熟B细胞表达ILT2明显增高。5.HLA-G/ILT2相互作用抑制骨髓B细胞的生长:与空白对照相比,与重组人HLA-G蛋白或含有高浓度HLA-G的再障患者骨髓上清共孵育的骨髓B细胞Brdu掺入率明显降低,而应用anti-ILT2或anti-HLA-G抗体干扰HLA-G和ILT2结合的阻断组B细胞Brdu掺入率明显高于非阻断组。同时与富含sHLA-G的再障骨髓上清共培养的正常骨髓B细胞的Brdu掺入率较加入正常对照骨髓上清组明显下降。结论:1.具有免疫抑制作用的HLA-G及其受体ILT2在再障骨髓中异常表达,提示HLA-G/ILT2可能参与再障免疫紊乱状态的发生发展。2.体外功能实验证明可溶性HLA-G与骨髓B细胞表面ILT2结合能够抑制骨髓B细胞的生长,提不再障骨髓上清中异常升高的可溶性HLA-G作用于高表达IILT2的原/祖B细胞和未成熟B细胞从而抑制其生长,最终导致原/祖B细胞和未成熟B细胞明显减少,而成熟B细胞比例相对增高。3.抑制HLA-G和ILT2结合有助于再障骨髓B细胞数量的恢复,为再障B细胞相关免疫机制研究提供了新方向。
孙培龙[3]2013年在《携带HLA-G慢病毒转染大鼠原代培养肝细胞及对抗大鼠肝移植排斥反应的研究》文中研究说明目的：人类白细胞抗原G(HLA-G)因为在母体胎儿之间的免疫耐受中发挥了关键性作用而被注意,提示它可能应用于器官移植。HLA-G在体外诱导表达已被证实有诱导免疫耐受的特性,移植术后患者体内HLA-G的表达已被证实与移植术后急性和慢性排斥反应发生率降低有关。我们使用转染携带人HLA-G基因的慢病毒转染大鼠原代培养肝细胞及大鼠移植肝脏,在体外及在体条件下探讨HLA-G的表达是否有直接保护移植肝脏免受排斥反应损伤的效果。方法：1、取260只健康雄性SD大鼠,分三个阶段进行,先建立大鼠原位肝移植模型的手术训练和探索。手术熟练后,取40只SD大鼠和40只Wistar大鼠,建立SD至Wistar大鼠肝移植急性移植排斥反应模型。2、建立携带HLA-G的慢病毒表达体系。3、进行SD大鼠肝细胞原代培养。4、将携带人HLA-G的慢病毒转染SD大鼠原代培养肝细胞,转染后7天,通过免疫荧光、RT-PCR和Western Blot实验进行检测,分别从病毒转染、mRNA水平和蛋白水平全面评价HLA-G慢病毒转染的效果。5、采用kamada二套管法建立SD和Wistar大鼠的原位肝移植模型45例,随机分为三组,每组15例。实验组在SD大鼠的供体肝脏取下后,从门静脉输注2ml包含有107TU/ml携带HLA-G基因的慢病毒,将携带人HLA-G的慢病毒转染大鼠供肝,与不加任何处理的对照组和术后规律使用FK506的对照组进行对比,对比术后三组肝组织中的HLA-G的表达水平、术后第7天、第14天和第56天的AST和BIL值以及病理切片、术后生存天数。探讨携带HLA-G基因的慢病毒转染供肝,是否可对抗大鼠急性肝移植排斥反应。结果：1、经训练,成功建立SD至Wistar大鼠肝移植急性移植排斥反应模型。2、携带人HLA-G的慢病毒可成功转染SD大鼠原代培养肝细胞。3、转染携带有HLA-G'慢病毒的实验组术后7天大鼠的AST和BIL值,与术后使用FK506的对照组差别有显著性(P<0.05),与术后不加处理的对照组差别有极显著性(P<0.01)。转染携带有HLA-G慢病毒的实验组术后12天、56天大鼠的AST和BIL值,与术后使用FK506的对照组差别有显著性(P<0.01)；转染携带有HLA-G的实验组的AST和BIL值,与术后不加处理的对照组差别有极显著性(P<0.01)。对照组中位生存时间12.00天,FK506组中位生存时间70.50天,HLA-G组中位生存时间91.50天,各组之间差别有显著性(P<0.01)。提示这种治疗可延长受体大鼠的存活期。病理切片结果显示,转染携带有HLA-G慢病毒的实验组和术后使用FK506的阳性对照组,术后7天病理切片仅有轻度排斥反应,而术后不加任何处理的阴性对照组则显示为重度排斥反应。术后56天,FK506组病理切片显示存在轻度排斥反应,而HLA-G组无排斥反应。结论：1、转染携带有HLA-G慢病毒作为治疗性的手段用于大鼠肝移植急性排斥反应模型,能有效保护大鼠移植肝的功能和延长存活期。2、体外实验及动物实验均表明,肝细胞对慢病毒介导的基因转移易感,表明慢病毒对肝细胞有很高的转导效率,且转入的外源基因可长期表达。图16幅,表9个,参考文献316篇
周浩, 黎纬明, 张敏, 刘峥嵘, 邹萍[4]2007年在《细胞膜表达的HLA-G诱导免疫耐受性树突状细胞的产生》文中研究指明为了探讨体外诱导免疫耐受性树突状细胞(dendritic cell,DC)产生的方法及其机制,利用人HLA-G1真核表达载体转染K562细胞并与DC共培养后,用流式细胞术检测DC表面CD80、CD86、ILT3和ILT4分子表达情况,同时采用氚胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法检测DC对T细胞功能的影响。结果表明,膜表达的HLA-G1分子与树突状细胞作用后,DC表面免疫共刺激分子CD80、CD86表达下调,而抑制性分子ILT3、ILT4表达上调。HLA-G1作用后DC异基因抗原诱导淋巴细胞增殖的活性明显下降。结论:HLA-G1分子可以在体外条件下,下调DC表面免疫共刺激分子水平,促进ILT3、ILT4表达,诱导免疫耐受性树突状细胞产生。
曾扬[5]2016年在《人MHC转基因小鼠模型建立及其应用基础研究》文中研究指明动物模型在疾病致病机制、疫苗和药物的研发评价等临床前试验和基础实验研究中发挥了重要作用。但现有动物模型仍存在一定的局限性,如小鼠和非人灵长类动物,在遗传背景、生理及免疫状态上均与人类存在着差异,尤其是MHC限制性的差别,无法消除种属特异性的影响,难以准确反应人类免疫特征,导致许多临床前动物实验结果与人体临床反应迥异。此外,免疫缺陷小鼠NOD/SCID小鼠等尽管在移植和肿瘤免疫等研究中得到应用,但由于小鼠H-2与人HLA限制性的差异,仍存在着免疫排斥及移植效率低等问题。因此,如何培育出人源化程度更高、能够更加有效模拟人类免疫反应的动物模型是目前人源化动物模型研究亟待解决的关键科学问题之一。MHC是广泛存在于人类和哺乳动物中多态性最为丰富的基因之一,参与T细胞在胸腺中的选择,发挥限制性作用调节免疫应答等。小鼠和人类的MHC在结构和功能上虽十分相似,但其MHC免疫限制性功能却完全不同。人MHC优势基因型分布存在种族差异,中国人群与欧美、中东及其他地区MHC优势基因型有显著差异。中国人群HLA-I类优势亚型以HLA-A2、A11和A24为主,而欧美人群则主要是A2、A1和A3等;中国人群HLA-II类分子优势亚型主要是DR09、DR15和DR01等,而欧美及中东人群则以DR01、DR03和DR04为主。人MHC转基因小鼠模型是通过将HLA转入小鼠基因组中,同时敲除小鼠H-2的重要组分,从而排除H-2对外源HLA的竞争性抑制,能够更加准确、有效的反应HLA作用特征。本课题旨在构建能够体现中国人群优势MHC基因型的HLA-A11/DR1双转基因小鼠模型并以此为基础进行疫苗的评价和新发病原表位鉴定等实验研究;构建和培育人MHC免疫缺陷小鼠模型HUMAMICE(HLA-A2+/+/DR1+/+/H-2-β2m-/-/IAβ-/-/Rag2-/-/IL-2rγ-/-/Perf-/-),建立人源细胞移植免疫重建小鼠模型,为病原感染模型研究、肿瘤和移植免疫机制研究及疫苗、药物评价等提供技术支撑。1.人MHC(HLA-A11/DR1)双转基因小鼠模型建立及其应用基础研究1.1 HLA-A11/DR1小鼠模型建立及免疫功能分析:构建包含HLA-A11启动子、轻链β2m,重链α1和α2、H-2-Db的α3和跨膜区的HLA-A11嵌合转基因载体,通过显微注射导入小鼠受精卵中,胚胎移植后获得HLA-A11转基因首建鼠;选择A11表达量最高的转基因首建鼠与HLA-A2/DR1小鼠进行杂交,构建稳定遗传的HLA-A11+/+/DR1+/+H-2-β2m-/-/IAβ-/-小鼠;鉴定到HLA在小鼠基因组中的整合及H-2的敲除;检测到HLA在A11/DR1小鼠脾细胞表面的表达显著强于C57BL/6及全阴小鼠;HLA-A11/DR1小鼠体内检测到相对正常数量的CD8+和CD4+T细胞,说明HLA能够满足淋巴细胞在胸腺中完成选择,发育为成熟的t淋巴细胞;利用已知hla-a11表位hiv-pol177-188和hiv-gp16032-45能特异性刺激a11/dr1小鼠产生hla-a11限制性ctl反应,证明a11/dr1小鼠具有hla-a11限制性免疫反应功能。1.2hla-a11/dr1小鼠模型在疫苗研发及评价中的应用(1)hla-a11/dr1小鼠模型在疫苗免疫评价中的应用:将商业化疫苗啤酒酵母基因工程乙肝疫苗和新型疫苗hiv-mep1作为模式抗原,免疫后小鼠血清中特异性igg抗体均显著上升;elispot检测表明以hiv-mep1和hiv-1多肽刺激,均产生了高水平的特异性细胞免疫;在hbsag疫苗的刺激下,a11/dr1小鼠产生的ifn-γ是c57bl/6小鼠的3-4倍。证明hla-a11/dr1小鼠在特异性抗原的刺激下产生了良好的体液和细胞免疫,能应用于疫苗的免疫评价中,尤其适用于细胞免疫反应的评价。(2)以hla-a11/dr1小鼠模型为基础的hla-a11限制性ctl表位筛选鉴定:通过生物信息学技术综合预测和分析了24个ebovgp蛋白和mers-covs蛋白与hla-a11结合力较强的候选表位。利用hla-a11/dr1小鼠验证和鉴定得到2个ebov-gp(ebov-gp76-84和ebov-gp423-431)和4个mers-cov-s(mers-s152-160、mers-s720-728、mers-s889-897和mers-s1092-1100)的hla-a11限制性表位肽。实验表明该转基因小鼠模型可有效进行病原表位筛选和鉴定。2.人mhc免疫缺陷小鼠(humamice)的建立及人源细胞移植小鼠模型研究2.1humamice的建立及免疫缺陷功能分析(1)humamice的制备及鉴定:将hla-a2/dr1小鼠(hla-a2+/+/dr1+/+/h-2-β2m-/-/iaβ-/-)与rag2-/-小鼠、il-2rγ-/-小鼠和perf-/-小鼠进行杂交繁殖,获得人mhc免疫缺陷小鼠humamice(hla-a2+/+/dr1+/+/h-2-β2m-/-/iaβ-/-/rag2-/-/il-2rγ-/-/perf-/-)。鉴定了hla的整合,h-2-β2m、iaβ、rag2、il-2rγ和perf的敲除及稳定遗传,检测到a2特异性表达;humamice体内未检测到cd3+cd4+、cd3+cd8+和cd19+cd20+细胞,表明在rag2、il-2rγ和perf缺陷的共同作用下,humamicet、b及nk细胞缺失。(2)humamice的免疫缺陷功能分析:取humamice和a2/dr1小鼠的免疫器官进行he染色,发现humamice的脾脏萎缩、胸腺发育不全,脾小体和胸腺小叶结构不完整甚至缺失,a2/dr1小鼠则具有结构正常的胸腺和脾脏。将ramos皮下接种以上两种小鼠,30天后,humamice均产生肿瘤,而a2/dr1小鼠则未发生肿瘤。向已发生肿瘤的humamice过继回输a2/dr1小鼠(接种ramos后未发生肿瘤)的脾细胞、cd8+t及其他免疫细胞,均能在一定程度上使humamice的肿瘤变小。结果表明humamice的免疫器官发育不成熟、免疫功能缺陷,移植肿瘤细胞后能够成瘤,能够支持肿瘤模型的建立。2.2humamice人源细胞移植和免疫重建特征分析(1)人源细胞(hpbmc)移植humamice及其免疫反应功能分析:筛选获得hla-a2+/dr1+pbmc样本;在小鼠全身辐射处理后的24h内进行人源细胞移植,10天后用hbsag疫苗免疫小鼠。在humamice进行hla匹配的hpbmc移植的60天内,实验组的体重较对照组并未显著下降,说明在humamice进行人源pbmc移植后并未发生gvhd反应。hbsag疫苗免疫humamice后,血清中hbsag特异性igg人源抗体在加强免疫后显著上升,igm人源抗体则在二免时达到顶峰。(2)humamice人源细胞移植后的免疫重建效率的分析:在人源细胞移植后的第五、八周,检测发现humamice脾细胞中hcd45+t细胞占11.6%和9.70%,其中hcd45+hcd19+占45.2%和49.4%,hcd45+hcd3+占17.1%和16.1%,hcd3+hcd8+占hcd45+hcd3+的29.0%和30.0%、hcd3+hcd4+占hcd45+hcd3+的60.9%和59.0%。结果表明,humamice在进行hla-a2+/dr1+pbmc移植后,脾脏中发现人源细胞,其免疫系统获得重建。3.研究结论(1)本研究成功建立和培育了具有中国人群hla优势基因型的hla-a11/dr1(hla-a11+/+/dr1+/+/h-2-β2m-/-/iaβ-/-)双转基因小鼠模型,该转基因小鼠模型具有人mhc免疫限制性特征及正常的免疫应答功能,疫苗评价实验表明该模型可以有效地应用于疫苗免疫评价研究中。利用该小鼠模型开展了重要病毒新型表位的预测、筛选和鉴定,获得两个位于ebovgp蛋白和四个mers-covs蛋白中的hla-a11限制性ctl表位。上述研究表明该人mhc双转基因小鼠模型能够有效应用于针对中国人群的重要病原体hla限制性ctl和th表位的筛选和鉴定等研究中。本研究建立的人mhc双转基因小鼠模型为免疫限制性机制研究、疫苗的研发和评价等提供了一种新的技术手段。(2)本研究成功建立和培育了人mhc免疫缺陷小鼠模型humamice(hla-a2+/+/dr1+/+/h-2-β2m-/-/iaβ-/-/rag2-/-/il-2rγ-/-/perf-/-)。该小鼠模型不仅具有人mhci类及ii类分子限制性特征(即hla-a2和hla-dr1限制性),而且其t、b及nk细胞缺失,脾脏和胸腺发育不完全;在进行人源细胞(hla-a2+/dr1+pbmc)移植的三个月内humamice未发生gvhd反应,移植后小鼠脾细胞中检测出人源cd45+细胞(hcd3+cd8+、hcd3+cd4+)。移植后humamice小鼠免疫hbsag疫苗后,能够诱导产生特异性igm和igg人源抗体,表明该人mhc免疫缺陷小鼠模型的免疫系统获得了人源化重建。人mhc免疫缺陷小鼠模型(humamice)为病原感染动物模型的建立、人源抗体制备和药物评价等研究提供了一种新型免疫实验研究模型。
蒋应弟, 曾国敏, 石宁宁, 李西睿, 纪慧丽[6]2016年在《GGTA1~(-/-)五指山小型猪SLAI类基因分子特征及与HLA相似性分析》文中研究指明目的明晰α-1,3半乳糖基转移酶基因敲除(GGTA1-/-)的五指山小型猪SLA经典I类基因分子结构特征及其与人HLA的相似性,对研究异种器官移植细胞性排斥反应具有重要意义。方法采集6头祖代GGTA1-/-五指山小型猪耳组织,利用RT-PCR对SLA I类基因(SLA-1、SLA-3、SLA-2)扩增、克隆及测序,对序列进行BLAST分析,并采用生物信息学方法对SLA I类基因分子结构特征及其与人HLA的同源性进行分析。结果测序分析表明,共获得6条等位基因序列,其中4条为已公布的等位基因(SLA-1*0703、SLA-2*1102、SLA-3*0401、SLA-3*0403),另2条为新等位基因(SLA-1*0401wz01、SLA-2*11wz01)。五指山小型猪与人HLA同源性为70.5%~72.1%。SLA-1*0401wz01、SLA-1*0703、SLA-2*11wz01、SLA-2*1102和SLA-3*0401的CD8+分子识别的关键结合域与人HLA氨基酸序列比对,均仅在位点225、228处发生了突变(T→S、T→M),其他位点高度保守。SLA-2*11wz01和SLA-2*1102与人HLA I类基因NK细胞抑制性受体(killer inhibitory receptor,KIR)结合区氨基酸同源性较高,在NKTA-1亚型结合域内仅有1个氨基酸差异,而在NKTA-2和NKTA-3亚型结合域内有2个氨基酸差异。结论从免疫细胞介导的异种排斥反应角度出发,GGTA1-/-五指山小型猪SLA I类基因氨基酸序列与人HLA高度相似,可作为未来猪-人异种器官移植的良好供体之一。
刘岩厚[7]2013年在《中国汉族人群及维吾尔族人群HIV-1感染与高分辨率HLA class I基因频率关联研究》文中提出宿主的免疫遗传学背景,如HLA class I基因多态性,是影响HIV-1感染风险及艾滋病病程进展的重要因素。此前有关中国人群HLA的分型研究,未能提供HLA class I高分辨率基因频率与HIV-I感染风险的关联分析,难以满足疫苗设计和临床试验的要求。本文报道了中国汉族人群及维吾尔族人群HLA class I高分辨率基因频率与HIV-I感染风险的关联研究。本文样本为327名中国汉族人样本及161名中国维吾尔族样本。汉族人群及维吾尔族人群均包括HIV-1血清阳性及血清阴性个体。高分辨率HLA class I分型由PCR-SBT法(测序分型)辅以高分辨率PCR-SSP法(序列特异性引物)完成,两位点及三位点单倍型由最大期望值法估算。本文共鉴定了汉族人群中的HLA-A等位基因48个,HLA-B等位基因63个,HLA-Cw等位基因27个；鉴定了维吾尔族人群中HLA-A等位基因39个,HLA-B等位基因53个,HLA-Cw等位基因26个,未发现新等位基因。本文分析了中国汉族人群及维吾尔族人群的HLA class I等位基因和估算的单倍型分布,与其它地区和少数民族的中国人群进行了比较,并构建了HLA-A和HLA-B系统树。本文比较了中国汉族人群及维吾尔族人群中HIV-1阳性组和阴性组的高分辨率HLA class I等位基因频率和估算的单倍体型频率。本文发现中国汉族人群中HIV-1血清阴性组中HLA-B*5201(OR=0.24,95%CI:0.10-0.57;p:0.001, q=0.026)和HLA-A*0301(OR=0.25,95%CI:0.09-0.64:p=0.002,q=0.030)的等位基因频率显著高于HIV-1阳性组中的基因频率,该结果提示HLA-B*5201和HLA-A*0301在汉族人群HIV-1感染中可能具有保护作用。中国维吾尔族人群HIV-1阴性组中HLA-B*5101(OR=0.18,95%CI:0.06-0.49:p=0.002,q=0.056)的等位基因频率显著高于HIM-1阳性组的频率,该结果提示HLA-B*5101可能在维吾尔族HIV-1感染中具有保护性作用。估算的HLA class I单倍型中,汉族人群HIV-1阴性组中HLA-Cw*0304-B*4001(OR=0.21,95%CI：0.08-0.57；p=0.003,q=0.039)及维吾尔族人群中HIV-1阴性组中HLA-A*0201-B*5101(OR=0.02,95%CI：0.003-0.21；p<0.01,q<0.01)均高于阳性组。此外,汉族人群中HⅣ：1阴性组中HLA-B62s超型的频率也显著高于阳性组。本文在四位数字的高分辨率HLA class I分型结果中,观察到部分等位基因.频率和推算的单倍型频率在中国汉族人群和中国维吾尔族人群中分布有显著性差异。在本文采集的样本中,未观察到HLA class I等位基因纯合／杂合以及Bw4/Bw6纯合／杂合在HIV-1阳性组和阴性组间的显著差异。本文研究结果是中国高分辨率HLA class I分型数据库的补充,也对HIV-1疫苗研发及临床试验样本召集具有重要的作用。
李文博[8]2016年在《胃癌患者外周血HLA-DR阳性单个核细胞PTEN的表达及其对PI3K/AKT信号通路的影响》文中认为目的1.检测胃癌患者外周血中HLA-DR阳性细胞的相对表达量。2.从基因和蛋白质水平分析胃癌患者HLA-DR阳性单个核细胞PTEN及PI3K/AKT信号通路特点,探讨PI3K/AKT信号通路在HLA-DR阳性单个核细胞中的调控作用。方法收集37例胃癌患者和33例健康人5ml EDTA抗凝的外周血液标本,通过流式细胞分析仪检测上述标本HLA-DR细胞的相对表达量。采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。HLA-DR阳性细胞的分选:用免疫磁珠法手工分选PBMC内HLA-DR阳性和阴性细胞。将分选后的HLA-DR阳性和阴性细胞分别进行核酸和蛋白质的提取,检测基因和蛋白质水平上的PTEN、PI3K、AKT、m TOR相对表达量,分析PI3K/AKT信号通路对HLA-DR阳性细胞的调节作用。以上实验数据重复三次,取其均数,结果以`X±S的形式描述,采用SPSS18.0进行统计数据处理,对于符合正态分布的数据组间差异性分析采用方差分析。P<0.05时有统计学差异。结果1.流式结果显示,HLA-DR细胞在胃癌患者与健康人外周血的相对百分比分别为[(13.11±3.01)%vs(9.02±1.42)%]。方差分析结果显示,P=0.01,<0.05,俩组数据存在差异。提示胃癌发生时,HLA-DR细胞在外周血的相对表达量明显高于健康对照组。2.Realtime PCR结果显示,健康人HLA-DR阳性细胞基因PI3K,m TOR的相对表达量高于HLA-DR阴性细胞,AKT的相对表达量无明显差异,但是,PTEN的表达却相反,在健康人HLA-DR阳性细胞的表达量低于阴性细胞,提示我们健康状态下,HLA-DR阳性细胞PTEN低表达有利于此类细胞PI3K信号通路的活化;肿瘤病人,PI3K,m TOR在HLA-DR阳性细胞的相对表达量高于阴性细胞,与健康人相同,但是,PTEN在阳性细胞中的表达量显著高于阴性细胞,于是我们推测,胃癌状态下,PTEN在肿瘤患者HLA-DR阳性细胞的高表达有可能成为HLA-DR阳性细胞PI3K信号通路的负性调控因素;之后,我们又分别比较了胃癌患者和健康人HLA-DR阴性和阳性细胞PI3K通路基因的表达,发现俩组人群,HLA-DR阴性细胞PI3K信号通路基因表达的差异性不显著,然而,HLA-DR阳性细胞却有明显差异,PI3K,m TOR在胃癌患者的表达明显低于健康对照,这意味着在基因水平上,胃癌患者HLA-DR阳性细胞PI3K信号通路的活化不如健康人群HLA-DR细胞。3.Westernblot结果显示,PTEN在健康人HLA-DR阴性及阳性细胞的表达量分别为1.27±0.52,0.78±0.24,胃癌患者HLA-DR阴性及阳性细胞PTEN的表达量为2.55±1.20,3.17±1.39,以上数据方差分析后获悉,F=15.07,P=0.000,PTEN的表达量组间与组内差异比较均有意义,其中,胃癌患者HLA-DR阳性细胞PTEN表达量增高尤为显著;PI3K在健康人HLA-DR阴性及阳性细胞的表达量分别为0.58±0.18,1.51±0.47,胃癌患者HLA-DR阴性及阳性细胞PI3K的表达量为1.38±0.61,2.12±0.54,方差分析结果显示,F=10.21,P=0.000,PI3K的表达量在各组之间的差异有统计学意义,PI3K在胃癌HLA-DR阳性细胞的相对表达量最高;AKT在健康人HLA-DR阴性及阳性细胞的表达量分别为0.77±0.24,0.64±0.16,胃癌患者HLA-DR阴性及阳性细胞AKT的表达量为0.94±0.19,1.02±0.24,方差分析结果显示F=5.41,P=0.007,AKT在各组间的表达亦有显著性差异,AKT在胃癌HLA-DR阳性细胞的表达量也相对增高。结论1.胃癌发生后,HLA-DR的表达量增加,APCs细胞抗原呈递能力增强,意味着肿瘤发生时,机体免疫系统抗肿瘤能力增强。2.PTEN在胃癌HLA-DR阳性单个核细胞基因和蛋白水平都呈现高表达,在一定程度上可以抑制PI3K/AKT/m TOR信号同路的过度活化,抑制HLA-DR细胞的过度增殖,提供有节制性的免疫应答,减少了免疫应答造成机体二重损伤的风险。
冯琦[9]2017年在《巨噬细胞极化和HLA-G异常在ITP中的作用和调控研究》文中指出第一部分巨噬细胞异常极化在ITP中的作用及调控研究研究背景:免疫性血小板减少症(Immune thrombocytopenia,ITP)是一种常见的自身免疫性出血性疾病,主要表现为患者血小板计数降低,出血风险增高。患者体内自身抗体介导血小板被单核/巨噬细胞过度清除和/或细胞毒性T细胞对血小板的直接杀伤是造成血小板破坏增多的重要原因,而另一方面,免疫介导的巨核细胞成熟障碍、凋亡异常会导致血小板生成不足。其中多种细胞免疫异常,包括Th1/Th2亚群失衡,髓样/淋巴样树突状细胞(myeloid/lymphoid dendritic cells,mDCs/1DCs)比例增高,调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)、耐受性DC细胞数量及功能缺陷等均参与了 IIP的发病。巨噬细胞在固有免疫及适应性免疫中都起到了关键性的作用,然其在ITP发病中的作用还有待研究。根据激活后巨噬细胞的表型及功能可以将其分为两类:经典激活的巨噬细胞(classically activated macrophage,M1)和替代激活的巨噬细胞(alternatively activated macrophage,M2)。M1 型巨噬细胞由干扰素-γ(interferon γ,IFN-γ)和革兰氏阴性细菌细胞壁成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激活化,表现为共刺激分子(CD80,CD86)表达增高,抗原递呈能力增强,分泌大量的促炎性细胞因子,如白细胞介素(interleukin,IL)-12等,发挥Th1型宿主免疫功能。M2型巨噬细胞由IL-4、IL-13及免疫复合物等刺激活化,表现为甘露糖受体(mannose receptor,MR),清道夫受体(scavenger receptor,SR)表达增高,分泌抗炎性细胞因子,包括IL-10等,诱导Tregs生成,发挥Th2型抗炎作用。M1/M2型巨噬细胞的极化状态能够影响淋巴细胞亚群分化并改变其免疫耐受功能,从而参与了多种自身免疫性疾病的发生发展,如类风湿性关节炎,多发性硬化等。然而,巨噬细胞的异常极化是否参与了 ITP的发病,目前尚缺乏研究证实。大剂量地塞米松(High-dose dexamethasone,HD-DXM)冲击治疗是国际公认的ITP临床治疗的首选方案。然而,HD-DXM治疗ITP的机制尚不完全明确,且仍有约1/3患者长期应用激素治疗无效。近年来,虽然有重组人促血小板生成素受体激动剂(recombinant human thrombopoietin receptor agonist,TPO-RA)、利妥昔单抗等新型药物的出现,部分患者仍对各种治疗反应不佳,迁延不愈进展为难治性ITP。全反式维甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA)是一种诱导分化剂,也是一种免疫调节剂,在多种自身免疫性疾病,包括类风湿性关节炎,狼疮肾炎中取得较好的疗效。Dai等人在最近的研究中发现ATRA联合泼尼松在难治复发性ITP患者中达到54.3%的总体有效率。研究发现,ATRA能够直接诱导T细胞分化,并能诱导DC向耐受性分化。ATRA联合IL-4还能够有效上调小鼠精氨酸酶-1(Arginase-1,Arg-1)的表达,而Arg-1被广泛认为是小鼠M2型巨噬细胞活化的重要标志之一。然而,ITP中是否存在巨噬细胞异常极化,HD-DXM和ATRA能否通过调节M1/M2极化在ITP中发挥治疗作用,尚需要体内外实验的多方验证。目的:(1)探究ITP中巨噬细胞的极化现象及其功能,明确其在疾病发生发展中的作用。(2)探究HD-DXM或ATRA对巨噬细胞极化及功能的调节作用,揭示HD-DXM和ATRA治疗ITP的可能作用靶点。方法:(1)收集ITP切脾患者及外伤脾破裂患者脾脏各5例,冰冻组织切片,分别标记抗人-CD68、诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)或CD163,荧光共聚焦显微镜下计数CD68+iNOS+细胞(M1)和CD68+CD163+细胞(M2)的数量。(2)入组未经治疗的ITP患者20例,采集外周血10ml,分选CD14+单核细胞,体外加入巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)诱导为M0巨噬细胞,并分别以LPS + IFN-γ或IL-4诱导为M1,M2。(3)流式细胞术检测 M1 和 M2 表面 CD163,CD206,CD209,CCR7,CD86 和CD80的表达。(4)酶联免疫标记法(enzyme-linked immunoabsorbent assay,ELISA)测定巨噬细胞培养上清中IL-12、TNF-α及IL-10的含量。(5)将诱导后的巨噬细胞分别与CD4+和CD8+T细胞共培养,5天后流式测定CD4+和CD8+T细胞增殖情况,CD4+CD49b+LAG-3+调节性T细胞(Type Ⅰregulatory T cell,Tr1)的比例。(6)收集巨噬细胞与CD4+ T细胞共培养上清,多因子试剂盒检测辅助性T细胞Th1/Th2相关细胞因子的含量。(7)上述20例未经治疗的ITP患者经HD-DXM治疗,另收取激素治疗无效的ITP患者23例,应用ATRA +泼尼松联合用药,分别收集两种药物治疗前后患者的外周血,体外诱导为M1,M2,测定其表型及对CD4+T细胞增殖的影响。结果:(1)荧光共聚焦显微镜显示ITP患者M1数量高于脾破裂患者(5.4 ± 0.9 vs 2.8±0.8,P<0.05),M2 数量未见明显差别(3.0 ±0.7 vs 3.2 ±1.3,P>0.05)。(2)流式结果显示ITP患者来源的M1和M2表面CD86和CD80的表达明显高于正常人;经DXM和ATRA干预后,M1和M2表面CD86,CD80,趋化因子受体 7(C-C chemokine receptor type 7,CCR7)的表达均降低,且 DXM 干预后CD163表达增加,ATRA干预后CD209的表达增加。(3)ELISA结果显示与正常对照相比,ITP来源的M1和M2分泌IL-12p70,TNF-α显著增高;经DXM或ATRA干预后的M1,M2分泌IL-12p70和TNF-α减少,而IL-10增加。(4)将巨噬细胞与T细胞共培养后,流式细胞术检测显示ITP患者来源的巨噬细胞刺激T细胞增殖的能力明显高于正常人;经DXM或ATRA调控的M1,M2对CD4+和CD8+ T细胞增殖表现出明显的抑制,且DXM或ATRA调控后的M2巨噬细胞能显著扩增Tr1细胞亚群。(5)检测共培养上清中Th1/Th2细胞因子的表达,结果显示DXM预处理的ITP患者M1和M2细胞能够增加CD4+T细胞分泌IL-4,IL-5和IL-13的能力并减少IFN-γ,IL-2和IL-12的分泌。ATRA预处理的ITP患者M1和M2同样增加CD4+T细胞分泌IL-4,IL-5和IL-13并减少IL-2和IL-12的分泌,然而只有ATRA预处理的M2型巨噬细胞能够减少CD4+T细胞分泌IFN-γ的能力。(6)本研究中,HD-DXM在未经治疗的ITP中总体有效(overall response,OR)率为85%,且治疗有效患者治疗后外周血单核细胞来源的M1和M2表面CD86,CD80,CCR7的表达均降低,CD163表达增加,与CD4+T细胞共培养后,刺激CD4+T细胞增殖的能力减弱;ATRA应用于难治性ITP中,OR率为69.6%,治疗有效者治疗后单核细胞来源的M1和M2表面CD86,CD80,CCR7的表达均降低,CD209表达增加,与CD4+T细胞共培养后,明显降低CD4+T细胞增殖能力。治疗无效者治疗前后巨噬细胞表型及功能均无明显差异。结论:(1)ITP中存在巨噬细胞向M1型过度极化的现象,且患者巨噬细胞免疫耐受功能受损。(2)HD-DXM或ATRA能够纠正ITP患者体内巨噬细胞的极化异常,诱导其向M2型极化,重塑机体免疫耐受。(3)这一研究揭示了 ITP发病的新机制,并证明了巨噬细胞为HD-DXM及ATRA在ITP中发挥治疗作用的靶点之一。第二部分HLA-G表达异常在ITP发病中的作用及调控研究研究背景ITP是一种常见的自身免疫性疾病,免疫失耐受是ITP中血小板破坏的重要原因之一。多种免疫调节细胞异常,包括自身反应性T、B细胞过度活化扩增,调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)、调节性B细胞(regulatory B cells,Bregs)、耐受性树突状细胞(dendritic cells,DCs)、髓源抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)数量及功能异常等,致使机体免疫耐受不能维持。继而自身免疫紊乱导致血小板被过度破坏,且巨核细胞成熟障碍造成血小板生成不足。人白细胞抗原 G(human leukocyte antigen-G,HLA-G)是一种非经典 HLAI类分子,包括膜结合型HLA-G(membrane-bound HLA-G,mHLA-G)和可溶性HLA-G(solubleHLA-G,sHLA-G)两种形式。目前发现的能够识别并结合HLA-G分子的免疫球蛋白样受体主要有三种:免疫球蛋白样转录物2(immunoglobulin-like transcript 2,ILT2/CD85j)、免疫球蛋白样转录物 4(immunoglobulin-like transcript 4,ILT4/CD85d)及杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immunoglobulin-like receptor,KIR2DL4/CD158d)。上述受体在 T、B淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞、自然杀伤性细胞(natural killer cells,NKs)表面存在差异性表达。研究发现,多种细胞可分泌或表达HLA-G,并通过与上述细胞表面的耐受性受体结合发挥免疫调节作用。自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等患者体内均存在HLA-G表达及功能异常,致使机体免疫失耐受或发生炎性紊乱。然而,HLA-G在ITP中的作用尚有待研究。目的:(1)探究HLA-G及其受体在ITP中的表达,并明确其在各种免疫细胞中的作用。(2)剖析体外应用重组人 HLA-G 蛋白(recombined human HLA-G,rhHLA-G),对纠正ITP免疫细胞功能异常的作用及机制,探寻ITP治疗的新靶点。方法:(1)收集30例ITP患者和15例正常对照的外周血,分离血浆、血小板、单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),免疫磁珠分选 CD14+单核细胞。(2)改良单克隆抗体血小板抗原固定试验(modified monoclonal antibody specific immobilization of platelet antigens,MAIPA)测定ITP患者抗血小板特异性自身抗体的表达。(3)酶联免疫标记(enzyme-linked immunoabsorbent assay,ELISA)测定 ITP 患者及正常对照血浆中sHLA-G的表达。(4)PBMC中加入外源性rhHLA-G培养3天后,流式细胞术测定CD4+、CD8+T淋巴细胞,CD14+单核细胞和CD19+B淋巴细胞表面mHLA-G和ILTs的表达,流式细胞术测定CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞的比例变化。(5)将rhHLA-G治疗3天后的PBMCs与自体或异体血小板共培养4小时,线粒体膜电位检测试剂盒(mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1)测定血小板凋亡。(6)CD14+单核细胞加入粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和 IL-6,培养 5 天后,加入 LPS 和 rhHLA-G,继续培养48小时,收集DCs,测定DCs表面CD86、CD80的表达。结果:(1)抗血小板自身抗体阳性的ITP患者体内HLA-G表达较正常人明显降低,而抗体阴性者与正常人无明显差异。(2)与正常对照相比较,ITP患者CD4+T细胞和CD19+B细胞表面mHLA-G和ILT2表达明显降低,CD14+单核细胞mHLA-G和ILT4表达降低。rhHLA-G能够上调上述细胞表面ILTs的表达。(3)rhHLA-G能够减少ITP患者PBMCs对自体及异体血小板的杀伤作用。(4)rhHLA-G能够降低DCs表面CD86和CD80的表达。(5)rhHLA-G 不能扩增 ITP 患者体内 CD4+CD25+Foxp3+ Treg 细胞。结论:(1)ITP中HLA-G和其抑制性受体ILTs表达降低。(2)rhHLA-G能够上调抑制性受体的表达,增强免疫细胞的抑制功能。(3)这一研究揭示了 ITP发病的新机制,为ITP的治疗提供了新思路。
高杰, 张晶晶, 王进, 张雯雯, 于迪[10]2013年在《别嘌醇致严重皮肤不良反应与江苏汉族人HLA-B~*5801等位基因的相关性研究》文中研究表明目的探讨HLA-B~*5801等位基因与江苏汉族人服用别嘌醇后发生严重皮肤不良反应(SCAR)的相关性。方法受试者为服用别嘌醇后发生SCAR者(SCAR组,36例)、服用别嘌醇6个月后未发生任何不良反应者(别嘌醇对照组,50例)和健康志愿者(健康对照组,167例)。取受试者外周静脉血,采用序列特异性引物引导的聚合酶链反应和直接测序方法检测HLA-B~*5801等位基因,分析SCAR与HLA-B~*5801等位基因之间的关系。结果 SCAR组36例中男性22例,女性14例,年龄21~87岁,中位年龄61岁;别嘌醇对照组50例中男性42例,女性8例,年龄49~93岁,中位年龄74岁;2组间性别分布差异有统计学意义(P=0.02)。2组患者别嘌醇日服用剂量均为0.1~0.3 g,中位剂量均为0.2 g。SCAR组患者在服用别嘌醇后5~47 d出现SCAR,其中药物超敏综合征、重症渗出性多形红斑药疹(SJS)、中毒性表皮坏死松解症(TEN)和SJS/TEN者分别为20、10、3和3例。SCAR组HLA-B*5801等位基因阳性率为97.2%(35/36),别嘌醇对照组为8.0%(4/50),健康对照组为12.0%(20/167),HLA-B*5801等位基因阳性者发生SCAR的风险显著高于阴性者(比值比=403,95%置信区间:43~3761,P=0.000)。HLA-B*5801等位基因检测预测别嘌醇致SCAR的敏感性及特异性分别为97.2%和92.0%。结论江苏省汉族人HLA-B~*5801等位基因与别嘌醇致SCAR具有强相关性,患者服用别嘌醇之前进行HLA-B~*5801等位基因筛查可能有助于减少别嘌醇所致SCAR的发生。
参考文献：
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[9]. 巨噬细胞极化和HLA-G异常在ITP中的作用和调控研究[D]. 冯琦. 山东大学. 2017
[10]. 别嘌醇致严重皮肤不良反应与江苏汉族人HLA-B~*5801等位基因的相关性研究[J]. 高杰, 张晶晶, 王进, 张雯雯, 于迪. 药物不良反应杂志. 2013
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