关键词：基因芯片；检测动物性食品；主要致病菌
致病菌因自身属于一种感染性疾病，已经成为近年来威胁人类健康与引起社会恐慌的关键因素，也是导致人类死亡的主要原因，加之细菌性生物武器备受恐怖组织的重视，多起生物恐怖时间证明生物恐怖袭击已经变成现实生活的威胁，这些致病菌的暴发与流程已经威胁到公共卫生的安全性，因此如何通过有效的检测手段进行致病菌的检测与有效预防、控制致病菌的发生、传播，是当前急需解决的主要问题。
1.基因芯片技术的应用分析
基因芯片技术由3部分组成：支持物、连接层与DNA分子探针阵列，该技术的应用细分为杂交图谱与分子杂交的检测分析、DNA方阵的构建、样品的制备与标记。其中芯片的制备作为基因芯片技术的核心内容，对于制备方法，主要包括原位合成法（在基因芯片上应用4种核苷酸形成所需的探针）与合成点样（在芯片上放置已经合成的探针）等2种方法。样品的制备与标记作为基因芯片技术的关键，能够通过PCR扩增或分离提纯样品的DNA与RNA，并标记靶基因。但是在制备与标记样品的过程中，必须在低温条件下，通过常规手段从细胞与组织种提取DNA，进行样品的扩增与标记。杂交反应需要结合探针的类型、研究目的与长度来确定，如果应用到基因表达检测种，杂交条件选择由于是高样品浓度、低温、低盐与时间较长，严谨性要求低，加之芯片杂交为固液两相反相杂交，必须将探针分析定位在基因芯片上，和液相的靶分子产生反应，才能处理核酸，增强杂交信号的强度，提高杂交速度。当基因芯片杂交结束后，需要采集与分析检测信号。但是考虑到采用的标记物的不同，相应的检测方法也不一样，较为常见的荧光标记是通过激光共聚集荧光扫描仪来检测信号，该检测方法经过放大后，能够裸眼观察，具有较强的灵敏度与特异性。
2.应用基因芯片检测动物性食品中主要致病菌
2.1菌株、培养基与试剂
菌株主要来源于检验检疫科学研、出入境检验检疫局、药品生物制品鉴定所和北京陆桥商检新技术公司，主要包括大肠杆菌O157：H7、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌、单增李斯特菌、伤寒沙门菌、小肠结肠炎耶尔森菌、绵羊李斯特菌、空肠弯曲菌、英诺克李斯特菌、蜡样芽胞杆菌、志贺氏菌和肠炎沙门菌，这些菌株在陆桥商检新技术公司进行培养，并从大连优先公司购买细菌DNA提取试剂盒、MgCI2、Ex Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、dATP、dGTP、dUTP和dCTP，紧接着从Gene Tranfer公司购买DNA标记试剂盒。但是对于样品的制备与增均培养，必须根据参试菌的要求进行。
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2.2分离提纯细菌基因组的DNA
待测致病菌样品经过培养分解后，需要将致病菌的模板DNA分离提纯。以本次动物性食品种主要致病菌为例，在无菌条件下，需要在营养肉汤上放置已经活化并经过生化鉴定的单个菌落，在37℃过夜培养后（原因是空肠弯曲菌需要在42℃的微需养袋中培养，才能提取分离。）放置在DNA提取试剂盒种，等待下一步检测。
2.3PCR产物的纯化和标记
致病菌之间在生物进化过程中，要比其他基因演化缓慢，因此必须通过相应的扩增引物将全部的致病菌基因扩增出来，并加以标记。例如在本次致病菌的PCR产物的纯化和标记操作中，在5L3mol/L NaAC和150L无水乙醇中加入PCR产物混合后，放置在20℃内等待30分钟，然后放入12000r/min离心10分钟，添加250L75%冷乙醇，再次放入12000r/min离心10分钟，做好干燥工作后，使用灭菌水溶解，最终将溶解后的产物与2L电池定量，借助试剂盒对PCR产物加以标记。
2.4基因芯片的制备
为了检测杂交后反应中非特异性杂交与假阴性的出现，需要设置阳性对照与阴性对照，然后在寡核苷酸的探针5'端增加连接臂，将寡核苷酸固定玻片上，并对连接臂的5'端进行氨基化修饰。紧接着配置芯片探针杂交液（NH杂交液、GS杂交液），结合芯片设计的及印第安阵点样图谱，提取浓度适当的探针溶液和Solution I，并按1:1比例混合放入96孔板中作为点样，根据点样程序调整基因芯片点样仪。待到点样结束后，将基因芯片放置过夜，最终使用真空离心法挥发基因芯片上的乙醇，进行干燥保存。
2.5杂交检测
将经过处理的芯片放在扫描仪上，对光的扫描强度进行调整，然后通过Imagene软件分析扫描结果，了解目标信号和背景信号的信噪比值。然后提取待测菌株，制备10被稀释菌液，使用200L菌液作为平板计数，取1mL菌液提取DNA，作为模板，通过PCR扩增，借助荧光物质标记，紧接着根据相应操作检测致病菌，并分别和其他目标细菌混合培养，做好基因芯片检测工作。以此同时提取致病菌呈阴性的出口冻鸡分割品作为模拟污染基质样品，在25g无菌称量模拟样品中添加225mL营养肉汤，放置在37℃过夜培养，最终在1mL的增菌培养基中提取DNA，进行基因芯片检测。另外，为了方便比对，还需选择30株菌株进行分离检测，提高检测的准确性。
2.6检测结果分析
对于这些致病菌检测结果分析，结果显示：鼠伤寒沙门菌的杂交检测敏感度是670cfu/mL，大肠杆菌O157：H7、空肠弯曲菌、鼠伤寒沙门菌、志贺氏菌和单增李氏菌具有较强的阳性信号，并且背景信号的平均值、非特异性的信号平均值、标识点的信号平均值和特异性的信号平均值与判定标准相符。大肠杆菌O157：H7和空肠弯曲菌为阳性，检测阳性率达到100%，表明基因芯片系统稳定性良好，具有较强的特异性。
总之，基因芯片技术的应用作为一项新型的核酸分析技术，它的出现与应用是将来分子生物学的发展主流，是后基因组时代关键的基因功能分析技术，因此在生命科学中应用基因芯片技术具有良好的发展前景，能够为实际检验检疫与卫生监督提供技术支撑。
论文作者:陈跃龙
论文发表刊物:《科技新时代》2018年4期
论文发表时间:2018/7/2
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