姚继广[1]2001年在《CO_2激光辐射绵羊精液生物学效应的研究》文中提出本研究选用co_2激光照射绵羊精液，探讨了co_2激光运用于家畜育种的可能性。 实验分为五个组。四个实验组照射剂量分别为3.57J/cm~2、7.14J/cm~2、14.28J/cm~2和28.56J/cm~2，另设一对照组。照后精液在37℃孵育，在孵育的0时、2时和6时，测定了精子的活力、活率、精子畸形率、精清中乳酸脱氢酶（LDH）活性和Ca~+、Mg~+、Zn~+离子的浓度变化；在孵育的0～2小时还测定了精子对~(32)P_i摄入量。 结果表明，3.57J/cm~2、7.14J/cm~2和14.28J/cm~2剂量的激光均能刺激绵羊精子活力，提高精子活率，而对精子形态未见不良影响，对精清中LDH活性没有发现显着影响，照后（0小时）检查，精子活力分别比对照组提高了7.28个百分点、7.8个百分点和5.88个百分点（P＜0.01），孵育6小时，分别比对照组提高了10.38个百分点、10.75个百分点（P＜0.05）和1个百分点。7.14J/cm~2组精子活率比对照组提高了6.04个百分点（P＜0.05）。 在采用的剂量范围内，改变了精子细胞膜的通透性，表现为精子对~(32)P_i的摄入量增加，对Ca~+摄入和Zn~+释放的加强，以3.57J/cm~2和7.14J/cm~2的剂量效应最显着，对Mg~+的通透性没有改变。 28.56J/cm~2剂量组对精子的活力有不良影响，造成精子顶体不可修复的损伤，提高了精清中LDH活性。 结果分析后得知：3.57J/cm~2和7.14J/cm~2剂量对改善精液品质，提高精子的代谢功能状态，增强精子活力最有效；14.28J/cm~2剂量，虽然对精子的代谢、活力有效应，但不能保持，认为是临界剂量；28.56J/cm~2剂量，对精子功能有损害作用，认为是抑制剂量。 本研究直接为。。z激光在绵羊育种中的应用提供了重要的科学依据和奠定了理论基础。
常卫华[2]2011年在《重离子辐射对绵羊卵母细胞体外成熟、受精及发育的影响》文中进行了进一步梳理体外受精技术是指在实验室条件下,人为模拟雌性动物生殖道内环境,使获能精子和成熟卵子完成受精形成合子的过程。它是继人工授精(AI)技术、胚胎移植(ET)技术以后动物繁殖领域的第叁次革命。近年以来,随着市场经济的向前发展,绵羊产业化前景越来越广阔,体外受精技术越来越受到人们的重视。然而,由于受到各种因素的制约,绵羊体外受精技术仍不稳定,体外受精率不高,胚胎发育率低、质量差,而且很难重复。对此,我们进行了重离子辐射对绵羊卵母细胞体外成熟、受精及早期胚胎发育影响的试验研究,主要结果如下:1.成熟液中,添加不同配比浓度的FSH和LH对卵母细胞的体外成熟影响显着,其中10μg/ml FSH+10μg/ml LH(1:1)时卵母细胞体外成熟率最高,为61.2%。2.在绵羊卵母细胞体外成熟液中添加不同浓度的丙酮酸钠,其卵母细胞体外成熟率不同。添加0.2g/L的丙酮酸钠,卵母细胞体外成熟率最高;而添加0.4、0.6g/L的丙酮酸钠,其体外成熟率显着下降。3.重离子束辐射绵羊卵母细胞对其体外成熟影响显着,1.0和1.5Gy的照射剂量与对照组相比可以明显促进卵母细胞的体外成熟,且1.0Gy剂量辐照其促进效果更好,而2.0Gy剂量进行照射则抑制卵母细胞体外成熟。4.在绵羊体外受精过程中,采用冻精或鲜精做体外受精,其早期胚胎的发育情况并无显着性差异。因此,在体外受精的试验过程中,冻精也能获得预期的试验目的。5.重离子束辐射绵羊精液并做体外受精后,早期胚胎发育有着显着变化。0.5、1.0Gy剂量辐照精液,绵羊早期胚胎的卵裂率、桑葚胚率显着升高,囊胚率无显着变化;1.5 Gy剂量辐照精液,卵裂率显着提高,而桑葚胚率和囊胚发育率显着降低;2.0 Gy剂量辐照精液,其卵裂率、桑葚胚率、囊胚发育率均极显着降低。6.0.5、1.0Gy剂量的重离子束辐射绵羊卵母细胞,体外受精后的卵裂率、桑葚胚率、囊胚发育率显着升高;而2.0Gy剂量组的卵裂率、桑葚胚率、囊胚发育率极显着降低,其中囊胚发育率为0。
岳文斌, 张春善, 宋明则, 刘亚萍[3]1994年在《CO_2激光对绵羊精子呼吸效应的研究》文中进行了进一步梳理本文研究表明，低剂量的激光可以提高精子的活力和呼吸，两者之间存在有强的正相关关系，说明激光辐照精子后，促进了精子的呼吸，合成了较多的ＡＴＬ提高了精子的活力。
季新成[4]2010年在《牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒分子生物学检测技术研究》文中提出牛传染性鼻气管炎(IBR)和牛病毒性腹泻(BVD)是危害养牛业的两种重要病毒性传染病,给养牛业造成巨大的经济损失,我国进出境牛及其产品大多有对这两种疫病检疫的要求。牛精液中可携带这两种病毒,其在人工受精技术中的广泛应用是将该病传播给未感染牛群及地区的重要途径之一。目前对牛精液中这两种病的检测大多采用病毒分离的方法,因精液自身的细胞毒性及抗病毒活性,致使检测灵敏度极大的降低。虽然PCR方法已应用于这两种病毒的检测,但因精液中抑制PCR扩增成分的存在,致使检测灵敏度降低或操作复杂,抑制成分的存在也常造成假阴性结果的发生。结合进出境检验检疫工作,本研究完成了以下内容:1.采用Institue pourquier公司的IBRV血清抗体检测试剂盒完成了新疆地区684份牛血清IBRV抗体检测,检出阳性血清370份,最高阳性率达97.6%,最低为5.0%,平均为54.1%。在近3年具有流产史记录的四个牛群中,有3个牛场牛IBRV抗体阳性率高达100.0%,1个牛场为12.5%,平均为90.5%。结果显示该病已在新疆普遍存在,感染没有明确的地域分布。2.根据牛疱疹病毒1型(BHV1)gB基因序列,设计引物和荧光探针,通过搭桥法PCR扩增,构建了BHV1内标法荧光定量PCR共扩增模板,进一步构建了共扩增荧光PCR检测体系,该体系可以检测到10个拷贝/PCR反应的核酸分子。经对牛精液中抑制荧光PCR扩增成分进行分析和去除方法的研究,将该方法直接用于牛精液中IBRV的检测,可检测到牛精液中0.02 TCID50病毒,检测时间在2.5h之内。检测灵敏度比不含内标的荧光PCR检测方法低10倍,比病毒分离方法高500倍,比普通PCR方法高50倍,比OIE已报道的方法灵敏度高40倍。通过对120份新鲜牛精液、40份冷冻牛精液和39份牛鼻腔拭子检测,得到阳性样品27份。含有共扩增内标模板的检测体系可对反应体系进行监测,指示并校正假阴性结果,从而达到提高PCR检测准确率的目的。通过对定期采集的10头牛血清样品IBRV抗体检测,发现精液阳性牛血清抗体不一定为阳性,血清抗体阳性牛精液中也不一定带毒,本试验结果初步表明不能以血清抗体阴阳性做为精液是否带毒的依据。鼻腔拭子带毒也只是间歇性的。3.采用Idexx公司BVDV血清抗体检测试剂盒完成了新疆地区875份牛血清BVDV抗体检测,共检出抗体阳性血清759份,最高阳性率为100.0%,最低为55.0%,平均为86.7%,从已有的数据来看,近3年有过流产史的牛血清BVDV抗体阳性率普遍偏高。感染牛没有明显的年龄差别。结果显示该病已在新疆普遍存在,且有不断增强的趋势。与病毒中和试验相比较,ELISA操作简便,并具有较好的敏感性和特异性,两者符合率为80.0%。4.采用Idexx公司BVDV抗原检测试剂盒从160份牛血清中检测出6份阳性血清,对这6分血清和随机选择的20份肛门拭子进行了病毒分离,成功分离出8株BVDV,8株分离毒株TCID50为4.38×103～5.82×106。对BVDV阳性血清的中和效价为1:23～1:26。8株分离株之间的同源性为87.5%～99.7%;与NADL株核苷酸序列同源性为82.0%～94.8%;与KE9株核苷酸序列同源性为81.0%～82.0%;分离株之间具有较高的同源性,表明该8株病毒与NADL株为同一基因型。5.建立了牛精液中BVDV荧光RT-PCR检测方法,该方法可检测到新鲜牛精液和冷冻牛精液中0.0125TCID50的病毒。灵敏度比常规RT-PCR高100倍,比病毒分离法高200～2000倍,研究发现,新鲜精液本身对RT-PCR扩增具有一定的抑制性,精液冻存液中的卵黄是抑制RT-PCR扩增的主要成分。用该方法对120份新鲜精液40份冻存精液进行检测,没有检测到阳性样品。对定期采集的10头牛血清BVDV抗体进行了检测,结果表明不能以血清抗体结果作为精液是否带毒的判定标准,血清抗体效价至少持续半年以上。6.根据IBRV gB基因、BVDV5’UTR区和犬新孢子虫Nc-5基因,通过PCR扩增各目的基因的特异性片段,成功构建了各特异性基因的重组质粒,在此基础上,建立了上述3种病原的多重PCR检测方法。将标有荧光染料的PCR产物变性后与芯片上寡核苷酸探针杂交,经系列反应条件的优化,建立了IBRV、BVDV和N. caninum 3种病原的基因芯片检测方法,本研究对叁种病原重组DNA的检测灵敏度均为103拷贝/反应。对牛精液中IBRV和BVDV两种病毒的检测灵敏度约为0.1TCID50,且具有较好的特异性和可重复性。经检测应用,进一步证明了该方法的可行性。7.建立了IBRV、BVDV和N. caninum xMAP悬浮液态芯片检测技术。对基因组DNA分别进行xMAP悬浮芯片单重和多重目标物的检测试验,建立的方法具有较好的特异性和可重复性。对BVDV重组质粒可检测到102拷贝/反应,对NCP和IBRV的检测灵敏度为103拷贝/反应。比PCR灵敏度高10~100倍。经检测应用,进一步证明了该方法的可行性。根据检测项目的不同,对临床样品分别采用了病毒分离、普通PCR、荧光PCR、基因芯片和悬浮芯片等方法进行了检测,结果表明,荧光PCR具有较高的灵敏度,悬浮芯片和基因芯片灵敏度次之。目前虽然有采用荧光PCR法、基因芯片法和悬浮芯片法等技术对动物疫病检测的研究,但尚未见将这些技术作为一个整体进行研究的报道,也没有以共扩增内标模板对检测结果进行质量控制的研究。本研究搭建了DNA病毒、RNA病毒和寄生虫病芯片检测技术平台,为今后更多动物疫病检测技术的研究开展奠定了基础。并同步完成了精液带毒与血清抗体关系进行了分析。结果的取得为出入境检验检疫条款的制定和检测方法的选择提供了依据,为进出境动物检验检疫提供了必要的技术储备。
易康乐[5]2008年在《Figla和BDNF对猪和牛卵母细胞及早期胚胎生长发育的影响》文中提出本研究系统评述了目前哺乳动物卵泡和卵母细胞发生分子调控机制的研究进展,探讨了生殖系a因子(Figla)和脑源性神经生长因子(BDNF)在猪和牛卵母细胞和胚胎的表达情况,进一步优化了猪和牛早期胚胎的体外培养体系。研究中首次克隆获得牛生殖系a因子全长cDNA序列585bp,编码194个氨基酸的成熟蛋白,其功能保守区与小鼠、人和类人猿等哺乳动物的同源性达到了90%以上;优化了SYBR Green I实时荧光定量PCR技术,使之能对牛和猪卵母细胞和早期胚胎中相关基因的表达进行较为准确的检测分析,从而使对微量材料进行大量的基因表达分析成为现实;首次证实了Figla和BDNF在猪和牛的卵母细胞和早期胚胎中均有表达,且BDNF在牛体细胞核移植囊胚中的表达量要显着低于体外受精和孤雌激活的囊胚;以现有培养体系为基础,添加BDNF可促进猪和牛体外培养的早期胚胎的发育。而添加神经生长因子(NGF)可促进牛体外培养的早期胚胎的发育。
曹忻[6]2008年在《血管内皮生长因子促进绵羊卵母细胞体外成熟机理研究》文中研究表明本研究通过10个系列试验,在绵羊卵母细胞体外培养液中添加血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF),研究VEGF对绵羊卵母细胞体外受精及胚胎发育的影响,并通过绵羊卵母细胞成熟过程中细胞的形态学结构、细胞骨架、胞内丝裂原活化蛋白激酶(P44/p42 Mitogen-activated Protein Kinases,P44/p42 MAP kinases)、蛋白激酶C (Protein Kinase C,PKC)和酪氨酸蛋白激酶(Protein Tyrosine Kinases,PTK)活性的变化,以及VEGF及其两受体KDR/Flk-1和Flt-1在绵羊卵母细胞成熟过程中表达的研究,揭示VEGF对绵羊卵母细胞体外成熟的作用和机理。一、血管内皮生长因子对绵羊卵母细胞体外成熟、体外受精及胚胎发育的影响试验1:不同浓度VEGF对绵羊胚胎体外发育的影响在绵羊卵母细胞体外成熟培养液(TCM199+胎牛血清)、HSOF受精液及SOF胚胎发育液中添加不同剂量的VEGF(对照组0 ng/ml、试验组Ⅰ5 ng/ml和试验组Ⅱ10 ng/ml),研究其对卵母细胞成熟和早期胚胎发育的影响。结果显示:对照组、试验组Ⅰ、试验组Ⅱ卵母细胞成熟率分别是80.68%、86.09%和85.22%。试验组Ⅰ和试验组Ⅱ与对照组相比,极显着的提高了卵母细胞成熟率(P<0.01),但试验组Ⅰ和试验组Ⅱ之间差异不显着。试验组Ⅰ和试验组Ⅱ的卵裂率分别是75.18%和73.48%,高于对照组的69.38%,但差异不显着。试验组Ⅰ的桑葚胚率和囊胚率是45.45%和30.06%,极显着的高于对照组37.61%和23.65%(P<0.01);同时试验组Ⅱ的桑葚胚率和囊胚率是40.25%和27.80%,低于试验组Ⅰ,高于对照组,但差异不显着。结果表明:体外培养液中添加5ng/mlVEGF为适宜添加量,VEGF明显提高了受精卵发育到桑葚胚和囊胚的能力。试验2:BSA成熟培养液中添加VEGF对绵羊卵母细胞体外成熟、体外受精及胚胎发育的影响本试验采用在成分相对明确的BSA成熟培养液系统中,添加不同浓度VEGF,检测对卵母细胞成熟和胚胎发育的作用。成熟培养液(TCM199+BSA)中分别添加0 ng/mlVEGF对照组、5 ng/ml、10 ng/ml的VEGF试验组卵母细胞成熟培养后,经体外受精和体外培养。结果显示:试验组Ⅰ和试验组Ⅱ的成熟率分别是83.98%和80.23%,对照组是75.76%。试验组Ⅰ和试验组Ⅱ与对照组相比,极显着的提高了绵羊卵母细胞的成熟率(P<0.01),并且试验组Ⅰ和试验组Ⅱ之间差异显着(P<0.05)。试验组Ⅰ的卵裂率是79.39%,高于试验组Ⅱ和对照组的72.24%和75.85%,差异不显着。试验组Ⅰ桑葚胚率是45.03%,明显高于试验组Ⅱ和对照组38.85%和38.94%的桑葚胚率,差异不显着。试验组Ⅰ囊胚率是23.54%,极显着高于对照组的18.09%(P<0.01);试验组Ⅱ囊胚率是21.05%,高于对照组Ⅰ的18.09%,差异不显着。结果表明:BSA成熟培养液中添加5ng/ml VEGF为适宜添加量,对绵羊卵母细胞体外胚胎的发育有积极的促进作用。试验3:VEGF添加对绵羊卵母细胞体外受精多精入卵的影响在绵羊卵母细胞体外成熟培养液(TCM199+BSA)中添加不同剂量的VEGF(对照组0 ng/ml和试验组5 ng/ml)成熟培养,经体外受精培养后,地衣红染色结果显示:试验组和对照组的受精率分别是83.86%和75.75%,多精入卵率分别是7.68%和12.64%,未受精率是8.47%和11.60%。试验组受精率极显着高于对照组(P<0.01);试验组多精入卵率极显着低于对照组(P<0.01);试验组的未受精率显着低于对照组(P<0.05)。结果表明:VEGF明显降低了多精入卵率,有效的抑制了绵羊卵母细胞受精过程中的多精入卵现象的发生。二、VEGF促进绵羊卵母细胞体外成熟的机理研究1、VEGF对绵羊卵母细胞体外成熟过程中细胞核成熟和细胞质成熟的影响试验4:在绵羊卵母细胞体外成熟培养液(TCM199+BSA)中添加不同剂量的VEGF(对照组0 ng/ml和试验组5 ng/ml)进行成熟培养,再采用地衣红染色技术,研究VEGF对绵羊卵母细胞体外成熟过程中染色体形态的影响。结果显示:试验组拥有正常染色体成熟卵母细胞的成熟率是87.42%,高于对照组的83.89%。结果表明:VEGF对卵母细胞体外成熟和维持染色体正常形态具有一定的促进作用。试验5:在BSA成熟培养系统中成熟培养后,采用免疫细胞化学和激光共聚焦显微技术,研究VEGF对绵羊卵母细胞体外成熟过程中α-tubulin蛋白和微管组织中心(Microtubule Organizing Centers,MTOCs)时空迁移和重新组装的影响。结果显示:试验组与对照组相比,极大的促进了α-tubulin从微管组织中心向染色体的空间迁移和重新组装。同时试验得出,试验组和对照组的微管蛋白和MII期染色体的正常分布率分别是77.50%和62.60%。试验组与对照组相比,极显着的提高了微管蛋白和MII期染色体的正常分布率(P<0.01)。结果表明:VEGF促进了MTOCs从胞内和皮质区的消失,并加速了α-tubulin重新分配和向染色体的聚集,有效的提高了卵母细胞核成熟质量。试验6:在BSA成熟培养系统中成熟培养后,采用免疫细胞化学和激光共聚焦显微技术,研究VEGF对绵羊卵母细胞体外成熟过程中皮质颗粒(Cortical Granule,CGs)时空迁移和重新组装的影响。结果显示:试验组与对照组相比,极大的促进了CGs从胞质向皮质区的时空迁移。试验组和对照组的皮质颗粒正常迁移分布率分别为79.24%和60.97%。试验组与对照组相比,极显着的提高了皮质颗粒正常迁移分布率(P<0.01)。结果表明:VEGF通过促进绵羊卵母细胞成熟过程中CGs的时空迁移,对绵羊卵母细胞胞质成熟具有积极促进作用。2、VEGF对绵羊卵母细胞体外成熟过程中细胞超微结构变化的影响试验7:在绵羊卵母细胞体外成熟培养液(TCM199+BSA)中添加不同剂量的VEGF(对照组0 ng/ml和试验组5 ng/ml)进行成熟培养,再结合透射电镜技术,研究VEGF对绵羊卵母细胞体外成熟过程中细胞超微结构变化的影响。结果显示:①VEGF有效促进了微绒毛的发育和变化,增加了游离端斜行插入透明带微绒毛的数量,促进了细胞内外物质交流和养分的吸收;②VEGF促进了皮质颗粒在卵母细胞成熟培养过程中向皮质区迁移的时间和空间变化;③发现特征性绵羊卵母细胞线粒体――带帽状线粒体,并且VEGF对线粒体的迁移有一定的促进作用;④VEGF的添加对卵母细胞成熟过程中脂滴数量的增加没有显着的作用,但VEGF减少了小脂滴聚集为大脂滴。3、VEGF对绵羊卵母细胞体外成熟过程中胞内磷酸化P44/p42 MAP kinases、PKC和PTK活性变化的影响试验8:在绵羊卵母细胞体外成熟培养液(TCM199+BSA)中添加不同剂量的VEGF(对照组0 ng/ml和试验组5 ng/ml)进行成熟培养,再结合酶联免疫技术,检测胞内磷酸化P44/p42 MAP kinases、PKC和PTK活性的变化。结果显示:绵羊卵母细胞成熟过程中叁种磷酸化激酶活性都呈波动变化,试验组的P44/p42 MAP kinases、PKC和PTK相对含量始终高于对照组相对含量。成熟培养16小时和20小时时,试验组P44/p42 MAP kinases(Erk1和Erk2)含量显着高于对照组(P<0.05);成熟培养16、21小时和24小时时,试验组PTK含量显着升高于对照组(P<0.05)。结果表明:VEGF添加到绵羊卵母细胞成熟培养液中,改变了PTK磷酸化水平,进一步引起信号传递分子MAP kinase和PKC的磷酸化,从而有效促进了绵羊卵母细胞体外成熟。4、VEGF及其受体KDR/Flk-1和Flt-1在绵羊卵母细胞体外成熟过程中的表达试验9:在绵羊卵母细胞体外成熟培养液(TCM199+BSA)中添加不同剂量的VEGF(对照组0 ng/ml和试验组5 ng/ml)进行成熟培养,再结合RT-PCR技术,研究VEGF及其受体KDR/Flk-1和Flt-1mRNA在绵羊卵母细胞体外成熟过程中颗粒细胞和卵母细胞细胞中的表达。结果显示:①卵母细胞培养前VEGF mRNA在卵母细胞中就有表达。在整个成熟过程中对照组中其表达一直持续,但比培养前的表达量有所下降;在试验组中,VEGF mRNA在卵母细胞中的表达呈下降趋势,到成熟培养24小时时表达量微弱;卵母细胞培养前VEGF mRNA在颗粒细胞中有表达。到培养8小时时,对照组表达量升高,但后期表达量明显下降。试验组在培养8小时时表达量就已经下降,24小时时持续低水平表达。②卵母细胞培养前Flt-1 mRNA在卵母细胞中有微弱表达,随着培养时间的延续表达量明显下降。培养8小时和24小时对照组比试验组表达强,到24小时试验组几乎检测不到Flt-1 mRNA的表达;卵母细胞培养前Flt-1 mRNA在颗粒细胞中有表达,到8小时时对照组表达加强,随培养时间延续其表达量下降,直至24小时检测不到。试验组从培养8小时开始就几乎检测不到Flt-1 mRNA的表达。③卵母细胞培养前KDR/Flk-1 mRNA在卵母细胞中有微弱表达,随着培养时间的延续,无论是试验组还是对照组其表达量都明显上升;卵母细胞培养前KDR/Flk-1 mRNA在颗粒细胞中有强表达,随培养时间的延续其表达量在对照组培养8小时时加强,但在试验组中减弱,培养到24小时时,两组表达量都很微弱。结果表明:外源VEGF的加入,改变了卵母细胞和颗粒细胞中VEGF及其受体KDR/Flk-1和Flt-1 mRNA的表达。试验10:结合免疫细胞化学和激光共聚焦显微技术,研究KDR/Flk-1和Flt-1蛋白在卵母细胞成熟观过程中颗粒细胞和卵母细胞中的表达。结果显示:绵羊卵母细胞成熟培养过程中,无论是在卵母细胞膜表面还是在颗粒细胞膜表面都检测到KDR/Flk-1和Flt-1蛋白的表达。
李冰[7]2006年在《钝顶螺旋藻/节旋藻藻蓝蛋白的提取纯化及抗肿瘤免疫效应研究》文中认为从海洋生物中寻找高效、低毒副作用的抗肿瘤药物是近年天然药物研究的新领域。近年来,随着海洋生物药学研究的不断深入,发现许多海洋生物尤其许多藻类,其体内含有各种特有药物功能。其中钝顶螺旋藻(Spirulina platensis,又称钝顶节旋藻Arthrospira platensis)中的藻蓝蛋白(C-phycocyanin, CPC)以其特有的营养和保健价值受到广泛的重视。因其水溶性、无毒、清亮且着色力强等优点,CPC被广泛用于食品着色剂和化妆品的添加剂。带有荧光,可用作荧光标记物。另有研究表明藻蓝蛋白具有抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗病毒、增强免疫力、清除自由基和保肝、降血脂等生理活性,这为螺旋藻在功能性食品和药品领域的开发提供重要的决策依据。目前有关藻蓝蛋白抗肿瘤免疫机理的研究国内外报道较少,本课题研究的主要目的旨在揭示藻蓝蛋白发挥作用的深层机理,以期更深层次的发挥其应用价值。首先对钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的提取和纯化方法进行了改进。采用磷酸盐缓冲液循环冻融联合超生波破碎法,50%硫酸铵沉淀获得CPC,提取率达到13.1%。粗蛋白提取液再经过两次羟基磷灰石柱(HA)层析和sephacrylS-200HR凝胶层析对其进行纯化,纯度达到4.71%。纯化后的CPC在12% SDS-PAGE中得到两条带,分别是α和β两个亚基,分子量分别为21.4ku和17.0ku。结果表明,通过上述分离纯化过程得到了较高提取率和电泳纯度的CPC。然后我们对CPC的抗肿瘤免疫活性进行了研究。主要包括5个方面:①CPC的体外抑瘤作用研究:检测CPC对人宫颈癌细胞(HeLa)、乳腺癌细胞(MCF)、胃癌细胞(NKM)、卵巢癌细胞(SVOA)、人胚肺细胞(HEL)体外生长的影响。在体外培养条件下用不同浓度的CPC(终浓度为20,40,80,160μg/ml)处理这4种癌细胞和1株正常细胞,运用MTT法检测CPC对细胞生长的影响。结果显示CPC对这4种癌细胞均有不同程度的抑制作用,并存在浓度剂量效应,高浓度抑制作用强,但对正常细胞无明显影响。②CPC诱导HeLa细胞凋亡的分子免疫机理探讨:通过流式细胞仪检测CPC对HeLa细胞的细胞周期变化的影响,结果发现出现一个亚二倍体峰(G0/G1);电镜检测细胞的凋亡形态;琼脂糖凝
郝玉徽[8]2013年在《贫铀暴露对肾脏和免疫系统的影响及锌的解毒作用研究》文中认为研究背景和目的贫铀(depleted uranium，DU)是天然铀经过提炼浓缩铀(~(235)U)之后的剩余产物，其~(235)U含量低于0.712％。由于DU具有良好的穿透性和原料的廉价性，被广泛地用于核电站、平衡锤、辐射防护及军事活动中(如作为装甲材料及弹药成分)。在DU的生产和使用过程中，可能会不规范地释放到环境中，经呼吸道、消化道或皮肤进入体内，对周围居民的健康造成严重地威胁。DU可发射高线性能量转移的α、β粒子，既具有放射毒性，又具有重金属毒性，其生物学影响与接触剂量、持续时间、接触途径等多种因素有关。在大剂量急性暴露的条件下，肾脏是铀急性化学毒性的主要靶器官，可造成严重的肾近曲小管坏死，然而，DU引起肾脏毒性的准确机制还不清楚。在低剂量慢性暴露的情况下，可能会引起一系列有害的效应，如神经行为的异常、生殖毒性、遗传毒性和癌症等，然而，普遍关注的问题——长期摄入DU污染的食物对免疫系统的影响，目前还没有报道。因此，本研究分别建立DU急性暴露模型和经过食入途径的慢性暴露模型，分别评价急性DU暴露对肾脏的影响和慢性DU暴露对免疫系统的影响，深入探索急慢性DU暴露的作用机制，为DU生物学效应的研究打下基础。此外，针对DU中毒的救治，仍是国内外研究的重点和难点。现有的DU促排药在促排效果或安全性方面都或多或少存在问题。金属硫蛋白(metallothinein, MT)是一类广泛存在于哺乳动物器官和组织中的低分子量非酶蛋白，富含半胱氨酸，对重金属离子有很高的亲和力，并能清除多种自由基，可实现对金属的解毒，但其解毒机制仍不完全清楚。MT基因的表达，需要二价锌离子的参与，锌属于高效且安全的MT诱导剂。因此，可试图通过锌诱导机体产生MT来实现DU的解毒治疗，为临床上开发高效低毒的DU解毒药物提供新的思路，具有重要的实用价值和现实意义。研究方法首先分别利用人肾脏近曲小管上皮HK-2细胞和成年Sprague Dawley大鼠，暴露于不同剂量的DU，造成DU急性染毒模型，分别观察暴露于DU后24h对细胞存活率、凋亡及相关酶活力的影响，以及暴露于DU后4d对大鼠肾脏铀含量、肾功能、组织病理学及肾脏组织抗氧化水平的影响。其次，3周龄昆明系小鼠，按照喂食饲料(含DU)剂量的不同分为4组：0(对照组)，3(DU3组)，30(DU_(30)组)，和300(DU_(300)组)mg/kg，喂食长达4个月，造成DU慢性染毒模型，评价小鼠天然免疫和获得性免疫功能的变化。最后，分别利用HK-2细胞、Sprague Dawley大鼠和MT基因敲除小鼠，进行锌对DU中毒的解毒作用及机制的研究，通过组织形态学、细胞超微病理学、流式细胞术、激光共聚焦显微镜技术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、分子生物学及蛋白组学等技术方法多角度评价锌对DU的解毒作用，深入探索锌对DU的解毒机制。研究结果及结论1.高于125μM的DU(硝酸铀酰)暴露后24h，均可引起HK-2细胞质膜和溶酶体膜的破坏，而导致乳酸脱氢酶(LDH)和N-乙酰-β-葡萄糖苷酶(NAG)从细胞内释放到培养液中，最终导致细胞的凋亡。另外，将Sprague Dawley大鼠急性暴露于不同剂量的DU(2.5、5、10mg/kg)，4d后观察发现，大于2.5mg/kg的DU暴露剂量均可引起明显的肾脏毒性，导致肾脏组织铀含量、血清尿素(BUN)和肌酐(Cr)均明显增高，组织病理学损伤严重，且随着DU暴露剂量的增高损伤逐渐加重。进一步研究发现，DU引起了肾脏组织氧化应激，导致抗氧化能力下降，脂质过氧化水平增高，可能是导致DU肾脏毒性的机制之一。2.3周龄小鼠喂食不同剂量的含DU饲料4个月后，各组血生化检查均无明显异常。在中剂量组(30mg/kg)和低剂量组(3mg/kg)，免疫学影响并不明显或影响相对轻微。但在高剂量组(300mg/kg)，小鼠的天然免疫功能下降，表现为腹腔巨噬细胞分泌的NO、IL-1、IL-18、TNF-α水平降低，脾脏自然杀伤细胞(natural killer cells，NK cells)的细胞毒性作用降低；小鼠的细胞免疫和体液免疫功能异常，表现为脾脏T细胞增殖能力下降而B细胞的增殖能力提高，血清总IgG、IgE的含量增高，迟发性超敏反应实验显示足跖增厚程度下降；流式细胞术实验发现脾脏mIgM+mIgD+双阳性细胞比例增高，CD3+细胞比例降低，CD4+/CD8+脾脏T细胞的比值降低；ELISA检测发现，脾细胞经过刺激后，释放IFN-γ和TNF-α的水平降低，而释放IL-4和IL-10的水平却增高。以上结果提示，造成高剂量组小鼠免疫功能障碍的原因主要与体内辅助T细胞(Th)1/Th2细胞因子平衡紊乱，引起机体各项免疫功能的调节失常有关。3.线粒体调节的凋亡途径和FasR调节的凋亡途径共同参与了DU引起的HK-2细胞的凋亡过程。而100μM锌预处理可明显抑制DU(500μM)引起的HK-2凋亡，通过降低细胞内活性氧的生成，增加过氧化氢酶(CAT)和还原型谷胱甘肽(GSH)的含量，抑制DU引起的sFasR和sFasL的过表达，抑制线粒体中的细胞色素c和凋亡诱导因子(AIF)释放到胞浆，抑制Caspases-9、Caspases-8和Caspases-3的激活以及促进了金属硫蛋白的表达。进一步观察发现，外源性金属硫蛋白也具有很好的抗DU引起的凋亡的作用。本研究结果证实了，锌通过一些独立的机制抑制了DU引起的凋亡，包括抗氧化效应、抑制Caspases-9、Caspases-8和Caspases-3的激活，并且金属硫蛋白可能参与了锌抗DU引起的凋亡过程。4.锌预处理(10mg/kg)对急性DU中毒(10mg/kg)具有明显的解毒作用，明显提高了大鼠暴露于DU后30d的存活率，使暴露于DU4d后的尿铀含量增加，肝、脾、肾铀含量降低，血清BUN、Cr及尿液NAG显着降低，并使血清IL-6和TNF-α、肾脏组织金属硫蛋白MT-1、MT-2的基因表达水平明显增高，CAT含量增高，丙二醛(MDA)含量降低，病理学损伤减轻。进一步使用锌预处理MT-/-小鼠和MT+/+小鼠，发现MT+/+小鼠的铀含量明显降低，且肾脏损伤明显减轻，抗氧化能力增强；但锌预处理对MT-/-小鼠却没有明显的DU解毒效果。外源性MT的不同基因型(MT1和MT2)对DU解毒效果的研究发现，MT1和MT2均可降低MT-/-小鼠肾脏的铀含量，且MT-1可使肾脏的病理损伤明显减轻，抗氧化能力增强，而MT2的保护效果却并不明显。因此，锌的解毒作用与诱导MT的合成有关，一方面，MT可促进DU的排出；另一方面，MT可增强体内的抗氧化能力，拮抗DU对组织的损伤，并且MT1的作用更加明显。5. MT-/-小鼠和MT+/+小鼠暴露于DU后，利用蛋白组学方法对小鼠肾脏组织蛋白的改变进行研究，发现有13个差异表达蛋白，它们的主要功能集中在糖和脂肪酸的代谢、电子传递呼吸链以及抗氧化防御系统等方面。进一步分析发现，超氧化物歧化酶(SOD)、氨基酰化酶-3(ACY-3)在暴露于DU后明显降低，且MT-/-小鼠降低更为明显，提示了这些蛋白可能参与了DU引起的肾脏中毒过程。采用免疫印迹技术对典型的差异蛋白SOD和ACY-3的表达量进行验证，所得结果与蛋白组学研究结果相吻合，再次验证了贫铀肾毒性的机制之一是引起氧化应激，并且ACY-3可能是DU发挥肾毒性的新的靶点，而MT可通过调节它们的含量在一定程度上减轻肾脏损伤。
参考文献：
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