张德昌[1]1989年在《二磷酸核苷酸激酶与跨细胞膜信息传递》文中研究表明近年来大量的研究表明，乌嘌呤核营酸调节蛋白质(Guanine Nucleotide Regulatory Proteins，G-proteins)在跨膜信息传递的多种机制中起着重要的调节作用。根据它们对腺苷酸环化酶的影响，可以发现有Gs和Gi两种不同的G—蛋白质。Gs介导受体对腺苷酸环化酶的激活作用，Gi则介导受体对腺苷酸环化酶的抑制作用。此外，在脑组织中还大量存在一种目前功能尚未明了的G—蛋白质(Go)，但有证据表明这种G—蛋白质能与M—胆硷受体，GABA受体及α_2—肾上腺素受体相互作用。G—蛋白质家族的第四个成员是Gt—蛋白质，它存在于视网膜。其生理功能是调节cGMP磷酸二酯酶的活性从而控制光对视紫红质(rhodopsin)的激活。 上述各种G—蛋白质在结构和作用方式上都有许多共同之处。它们都是由αβγ三个不同亚单位组成的三聚体。Gs和Gi的β亚单位在电泳上表现为35kd和36kd两条蛋白质带，而Gt的β亚单位分子量则是36kd。进一步的研究表明所有的β亚单位都有相同的电泳表现，一致的氨基酸组成和水解后的肽片段组成。同时，Gs和Gi的γ亚单位也是相同的，分子量大约8kd。 各种G-蛋白质的α亚单位却有着明显的不同。Gs_α的分子量是45kd，Gi。是41kd而Gt_α和Go_α则分别是40kd及39kd。此外，Gs_α能在霍乱毒素的催化下被ADP-核苷化，而Gi_α和Go_α则能在百日咳毒素的催化下被ADP-核苷化；Gt既能被霍乱毒素也能被百日咳毒素催化ADP-核苷化。 做为G—蛋白质家族的成员，各种α亚单位又有基本的共同点，即它们都具有与乌嘌呤核苷酸结合的高亲和力位点，同时具有GTP酶活性，可以水解GTP。 人们早已熟知G—蛋白质可以介导受体对腺苷酸环化酶的激活或抑制作用。进年来大量实验证据表明，G-蛋白质还参与其它很多种调节过程。例如，G-蛋白质调节膜上磷脂酶C(Phospholipase C)的活性而影响磷酯酰肌醇的代谢，后者是很重要的信息物质，影响细胞内Ca浓度的调节。G-蛋白质也影响磷酯酶A_2的调节，从而作用于前列腺素类物质的代谢。其它诸如K~+-通道、C_a~(2+)-通道等都可能受G-蛋白质的调节。
刘伟[2]2008年在《固氮斯氏假单胞菌A1501电子传递复合体基因簇（rnf）的功能研究》文中进行了进一步梳理生物固氮是个高耗能的过程,每还原一分子的N2消耗16分子的ATP。斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501是一株分离自我国南方水稻根际土壤的联合固氮菌,在无铵和微好氧的条件下能将空气中氮气固定为植物可吸收利用的铵,该菌全基因组已完成序列分析和功能注释。本研究采用生物信息学和分子生物学等技术手段,对A1501编码电子传递复合体的rnf基因簇进行功能鉴定以及表达调控的研究,为探讨和进一步阐明联合生物固氮的分子机制奠定理论基础。本研究根据A1501菌基因组的功能注释,对该菌的中心代谢、能量合成及环境适应性等方面进行了生物信息学分析,结果显示A1501菌具有代谢途径的多样性,除糖酵解(EMP)代谢途径不完整外,包含几乎全部编码Entner-Doudorff途径(ED)、磷酸戊糖途径(HMP)、三羧酸循环(TCA)以及乙醛酸途径中所需酶的基因,这些代谢途径为该菌生长和生物固氮提供所需的能量和还原力。固氮菌的能量产生与电子传递密切相关。序列分析表明,在A1501菌基因组存在三套紧密排列成簇的编码电子传递复合体(1个Nqr和2个Rnf复合体)的基因。其中rnf1基因簇包含7个基因(rnfABCDGEH),rnf2基因簇包含6个基因(rnfABCDEG),nqr基因簇包含6个基因(nqrABCDEF)。我们利用pK18mob自杀性载体,通过三亲接合,分别构建了nqr、rnf1和rnf2三个基因簇的极性突变株,生理生化测定的结果表明各基因簇的缺失并不影响细胞的正常生长,但rnf1基因的缺失造成了固氮酶活的显著下降,其突变株的固氮酶活仅为野生型菌株的10%以下;而rnf2,nqr基因簇的极性突变对固氮酶活没有造成任何影响。由于rnf1基因簇位于固氮岛之内,编码的复合体可能负责电子向固氮酶的传递;rnf2,nqr基因簇位于固氮岛之外,编码的复合体则可能与氧化应激反应有关,以适应外界不良环境的刺激。固氮岛内还存在nifF基因,其产物为电子传递中间体,该基因的突变导致细胞的固氮酶活降低到野生型的46.9%,表明在固氮岛内还存在其它未知电子传递补偿途径。为了研究rnf1基因簇的功能,我们分别构建了rnf1基因簇内7个基因的非极性突变株。固氮酶活测定表明任何一个基因的突变均造成了固氮酶活的显著性降低,为野生型菌株的3.4-14.9%,结果表明该基因簇编码一个完整的电子传递体,任何一个基因的缺失都造成rnf1电子传递体结构的破坏,使之不能正确行使电子的传递,从而影响该菌的固氮功能。对rnf基因簇的末端编码蛋白基因rnfH基因进行序列分析,发现其下游基因nifY2,PST1323与rnfH基因的转录方向一致。通过RT-PCR分析表明,rnfH与nifY2,PST1323为同一个转录单元,位于同一个操纵子。斯氏假单胞菌A1501中生物固氮与电子传递密切相关,其rnf1基因簇可能受固氮正调控因子NifA调控。本研究采用细菌单杂技术进一步分析了NifA蛋白与rnf1基因簇启动子的相互作用,结果显示斯氏假单胞菌A1501中NifA蛋白与rnf1基因簇启动子之间存在着相互作用,表明固氮正调控因子NifA调控rnf1基因簇的表达。同时体外凝胶阻滞实验表明NifA蛋白和rnf1基因簇启动子之间存在特异性结合。上述研究结果推断电子传递体Rnfl主要提供了生物固氮过程中所需的能量,编码电子传递体rnf1基因簇的表达是受固氮正调控蛋白所激活的。
朱煜明[3]2008年在《新型K_（ATP）开放剂埃他卡林对人肺动脉收缩与肺动脉平滑肌细胞增殖的影响》文中研究指明缺氧性肺动脉高压(Hypoxic pulmonary hypertension,HPH)作为一类严重危害人类健康的疾病,是慢性阻塞性肺病(Chronicobstructive pulmonary disease,COPD)的重要病理生理过程,也是发展为慢性肺源性心脏病(Chronic cor pulmonale)的关键环节。尽管在过去的十多年中,应用前列环素类药物、磷酸二酯酶-5抑制剂、内皮素受体拮抗剂治疗肺动脉高压已经取得了一定的进展,但由于对HPH的病因和发病机制尚未完全阐明,因而这些治疗并未从根本上治疗肺动脉高压。因此,对缺氧性肺动脉高压形成机制的研究并研发有效的针对致病靶标的防治药物显得尤为必要。近年来,国内外学者已经认识到肺血管平滑肌细胞钾通道在肺动脉高压发生发展中的作用。钾通道功能下降,细胞内K~+外流减少,细胞膜去极化,电压依赖性钙通道开放,细胞外Ca~(2+)内流,肌浆网内Ca~(2+)释放,细胞内游离Ca~(2+)浓度增加,肺血管平滑肌细胞收缩、增殖,肺动脉压增高;另一方面肺动脉平滑肌细胞钾通道功能下降,细胞内K~+增多,细胞凋亡减少,进一步加重肺血管重构。有鉴于此,钾通道开放剂对肺动脉高压的防治成为近年来国内外研究的热点和焦点。肺血管平滑肌细胞至少存在三种类型钾通道:(1)电压依赖性钾(K_v)通道,(2)Ca~(2+)激活性钾(Kca)通道,(3)ATP敏感性钾(K_(ATP))通道。细胞膜K_(ATP)通道是目前已知的唯一的可在机体缺血、缺氧等病理生理情况下代偿性开放的钾通道,是机体对抗缺血缺氧的重要自身保护机制,已经成为研发新型治疗肺动脉高压药物的重要靶标。由于K_(ATP)通道调控人类肺动脉平滑肌细胞收缩、增殖的细胞信号及分子机制尚不明确,本文从器官、细胞和分子水平探讨K_(ATP)通道调控人肺动脉平滑肌细胞收缩、增殖的细胞和分子生物学机制,系统评价我国学者自行研制的新型K_(ATP)开放剂埃他卡林(Iptakalim,IPT)对人肺动脉平滑肌细胞收缩和增殖的影响,为研究开发新型治疗肺动脉高压的药物提供理论依据。本文主要围绕如下三个部分开展工作:第一部分新型K_(ATP)开放剂埃他卡林对ET-1诱导的离体人肺动脉环收缩的影响目的:研究IPT对内皮素-1(ET-1)诱导的人离体肺动脉环收缩的影响及其机制。方法:分离正常离体人肺动脉条,置于含饱和混合氧(95%O_2和5%CO_2混合气)和Krebs-Henseleit(K-H)液(含mol·L~(-1):NaCl 119,KCl 4.7,MgSO_4 0.6,NaHCO_3 25,KH_2PO_4 1.2,CaCl_2 2.5和葡萄糖11.1,PH 7.4)的培养皿内,剪取3 mm长的血管环固定于含K-H液的浴槽内,持续小流量通入混合氧,静息张力下稳定60 min后,通过张力换能器与十六道生理记录仪相连,记录血管环的张力变化。按累积法给予7个浓度ET-1(0.05～50 nmol·L~(-1)),观察ET-1收缩血管作用的量效关系,求出EC_(50);观察ET-1在EC_(50)浓度的时效曲线。在此基础上,以ET-1的EC_(50)浓度使肺动脉环达到最大收缩幅度时,按累积法加入IPT10~(-13)～10~(-3)mol·L~(-1)或Pin10~(-13)～10~(-3)mol·L~(-1),以等容量溶剂做阴性对照,记录肺血管环收缩张力的变化,并以ET-1最大收缩幅度为100%,计算IPT和Pin的舒张率。结果:在0.05～50nmol·L~(-1)浓度范围内,ET-1呈浓度依赖性地诱导离体人肺动脉环收缩,其EC_(50)±L_(95)为10.19±1.26 nmol·L~(-1),b±S_b为0.905±0.186,r=0.91。在10~(-13)～10~(-3)nmol·L~(-1)浓度时,IPT呈浓度依赖地拮抗ET-1诱导的离体人肺动脉环收缩,其IC_(50)为27.11 nmol·L~(-1);Pin同样也呈浓度依赖性拮抗ET-1 10nmol·L~(-1)诱导的动脉收缩,与IPT组比较,二者无显著性差异(P＞0.05)。结论:IPT可拮抗ET-1诱导的人肺动脉环收缩,其机制可能在于开放肺动脉平滑肌细胞上的K_(ATP)通道。IPT可以有效舒张人肺动脉,表明其是一个富有潜力的治疗肺动脉高压的候选药物。第二部分新型K_(ATP)开放剂埃他卡林对ET-1诱导的原代培养人肺动脉平滑肌细胞增殖的影响目的:研究IPT对ET-1诱导的原代培养的人肺动脉平滑肌细胞增殖的影响及其机制。方法:以原代培养的人肺动脉平滑肌细胞为研究对象,用ET-1诱导人肺动脉平滑肌细胞增殖,~3H-胸腺嘧啶核苷([~3H]-TdR)掺入法检测脱氧核糖核苷酸(DNA)合成;流式细胞仪技术检测人肺动脉平滑肌细胞细胞周期。结果:ET-1(10 nM)使原代培养的人肺动脉平滑肌细胞[~3H]-TdR掺入量增加,促进细胞由静止期(G_0/G_1期)进入DNA合成期(S期)和有丝分裂期(G_2/M期);IPT呈浓度依赖性抑制ET-1诱导的[~3H]-TdR掺入量增多,阻止人肺动脉平滑肌细胞由静止期(G_0/G_1期)进入DNA合成期(S期)和有丝分裂期(G_2/M期);Pin同样抑制ET-1诱导的[~3H]-TdR掺入量增多和细胞周期的改变,且与IPT比较二者无显著差异;格列本脲呈浓度依赖性地逆转IPT与Pin对细胞增殖的抑制作用。结论:IPT作为一种新型的K_(ATP)开放剂,可以抑制人肺动脉平滑肌细胞的增殖,是一种治疗肺动脉高压的侯选药物。第三部分新型K_(ATP)开放剂埃他卡林对ET-1诱导的原代培养人肺动脉平滑肌细胞内[Ca~(2+)]_(cyt)及ERK1/2磷酸化的影响目的:研究IPT对ET-1诱导的原代培养人肺动脉平滑肌细胞内游离钙浓度([Ca~(2+)]_(cyt)及细胞外信号调节激酶1和2(ERK1/2)磷酸化的影响及其机制。方法:以原代培养的人肺动脉平滑肌细胞为研究对象,分别用ET-1与IPT处理人肺动脉平滑肌细胞后,应用激光扫描共聚焦显微镜测定细胞内[Ca~(2+)]_(cyt)变化;使用Western blot检测ERK1/2磷酸化水平的改变。结果:ET-1诱导人肺动脉平滑肌细胞内游离Ca~(2+)显著增加,IPT(10μM)拮抗ET-1诱导的人肺动脉平滑肌细胞内[Ca~(2+)]_(cyt)升高;ET-1促使人肺动脉平滑肌细胞的ERK1/2磷酸化,且磷酸化ERK1/2水平在加入ET-1后10 min达高峰,IPT呈浓度依赖性抑制ET-1诱导的肺动脉平滑肌细胞的ERK1/2磷酸化。结论:IPT作为一种特异性K_(ATP)开放剂,可能通过增强K_(ATP)通道的功能与通道蛋白的表达,使细胞内游离Ca~(2+)减少,进而抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的活化,最终导致肺动脉平滑肌舒张并抑制平滑肌细胞的增殖。综合本文三个部分的研究结果,获得如下结论:1.IPT通过开放肺动脉平滑肌细胞上的K_(ATP)通道,拮抗ET-1诱导的人肺动脉环收缩,有效舒张人肺血管;2.IPT抑制细胞DNA合成,阻止细胞由静止期(G_0/G_1期)进入DNA合成期(S期)和有丝分裂期(G_2/M期),抑制人肺动脉平滑肌细胞的增殖;3.IPT通过增强K_(ATP)通道的表达,使细胞内游离Ca~(2+)减少,进而抑制ERK1/2的磷酸化。4.总之,新型K_(ATP)开放剂IPT在整体、细胞、分子水平抑制人肺动脉环的收缩与肺动脉平滑肌细胞增殖,是一个富有潜力的防治肺动脉高压的候选药物。
顾悦[4]2017年在《环境胁迫及酵母菌对乳酸菌LuxS/AI-2群体感应系统的影响》文中指出乳酸菌不仅是人体肠道中具有重要生理功能的菌群,同时也是食品工业中占据重要地位的微生物之一。LuxS/AI-2群体感应(Quorum Sensing,QS)系统广泛存在于乳酸菌中,可产生信号分子AI-2并参与调控菌体的多种生理功能。本研究旨在探究信号分子AI-2对乳酸菌生理性状的调控,通过对调控途径的研究深入了解环境胁迫、与酵母菌及其无细胞发酵上清液(Cell-free fermentation supernatant,CFS)共培养时对乳酸菌Lux S/AI-2群体感应系统产生的影响。(1)对环境胁迫条件下屎肠球菌8-3(Enterococcus faecium)和发酵乳杆菌2-1(Lactobacillus fermentum)的Lux S/AI-2群体感应系统进行研究,结果表明,酸胁迫可以诱导菌体分泌信号分子AI-2,同时,促进S-核糖高半胱氨酸裂解酶(S-ribosylhomocysteine lyase,LuxS)和S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(S-adenosylhomocysteine nucleosidase,Pfs)基因的转录,碱性环境对不同菌株信号分子AI-2的分泌既有促进作用又有抑制作用;低温胁迫抑制试验菌株信号分子AI-2的分泌,高温促进L.fermentum2-1信号分子AI-2的分泌,但低温和高温下均对相关基因的转录均起促进作用;轻度渗透压胁迫时信号分子AI-2活性降低,但随培养时间的延长其信号分子AI-2活性增强;重度渗透压胁迫时,菌株信号分子AI-2活性显著降低且不随培养时间的延长而增高,但是,Lux S和Pfs基因转录水平均与渗透压呈正相关;环境营养物质缺乏会诱导菌体分泌更多的信号分子AI-2及Lux S基因的高表达,且与受营养胁迫程度呈正相关。以上结果说明环境胁迫会影响E.faecium 8-3和L.fermentum 2-1的Lux S/AI-2 QS系统在菌株抗逆的过程发挥作用。(2)对酵母菌及其CFS与乳酸菌共培养过程中的Lux S/AI-2群体感应系统进行研究,结果表明,酿酒酵母YE4(Saccharomyces cerevisiae)的CFS会不同程度的抑制E.faecium 8-3和L.fermentum 2-1的生长、产酸能力以及生物膜的形成,但是,却在不同程度上促进了试验菌株信号分子AI-2的分泌,并对Lux S和Pfs基因的转录产生显著影响;S.cerevisiae YE4与试验菌株共培养时,对试验菌株活菌数、产酸的影响均小于其CFS,但是共培养过程也引起信号分子AI-2活性以及LuxS和Pfs基因转录水平的变化。因此,试验菌株与S.cerevisiae YE4及其CFS共培养时,会影响乳酸菌的Lux S/AI-2群体感应系统进而影响其共培养过程。(3)信号分子AI-2的体外合成及其对乳酸菌生理功能的调控。利用E.faecium8-3的LuxS和Pfs基因成功构建重组质粒,并对重组质粒表达重组蛋白的条件进行优化,得到最佳表达条件为以SOC培养基作为诱导培养基,当菌体密度OD_(595nm)达到0.3-0.7之间时加入终浓度为0.1mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-thiogalactopyranoside,IPTG),在37℃下诱导表达12h。最佳诱导条件下重组蛋白有可溶性表达,经纯化浓缩后的重组蛋白与S-腺苷甲硫氨酸反应后合成了具有高生物活性的信号分子AI-2。合成的信号分子AI-2随孵育时间的延长其活性会不断减弱并在10h后基本保持不变,同时,其在碱性环境中活性减弱的速度较快,相反,酸性条件下其活性下降速度较慢,活性保留时间较长。将体外合成的信号分子AI-2添加至E.faecium 8-3和L.fermentum 2-1的培养基中,对E.faecium 8-3和L.fermentum 2-1生长的促进作用与添加信号分子AI-2的浓度呈正相关,对E.faecium 8-3的促进作用主要出现在对数期以及稳定期,对L.fermentum 2-1的促进作用主要在对数期;当外源信号分子AI-2的浓度为60μmol/L时,对试验菌株生物膜的形成没有显著影响,但对E.faecium 8-3的耐酸及耐弱碱性有促进作用,对耐强碱性没有影响;对L.fermentum 2-1耐酸性没有影响,但可以提高其耐弱碱性,降低其耐强碱性,表明信号分子AI-2参与调控菌株的生理功能并在其耐环境胁迫的过程中发挥作用。(4)从蛋白质组学角度对信号分子AI-2调控乳酸菌生理功能及和酵母菌的共培养过程进行深入探究。结果显示,在外源信号分子AI-2的作用下,菌株共有15个蛋白差异表达,涉及的代谢通路包括半胱氨酸和甲硫氨酸、氨基酸合成、RNA转运等。同时,添加外源信号分子AI-2处理后,半胱氨酸和甲硫氨酸代谢途径中的差异蛋白表达量有显著增加,其中主要是信号分子AI-2合成过程中所涉及的Pfs蛋白。添加S.cerevisiae YE4 CFS后,菌株共有82个蛋白差异表达,涉及的代谢通路包括QS系统、ABC转运体、生物素代谢、肽聚糖合成、蛋白运输、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢等。其中,添加S.cerevisiae YE4 CFS处理后,QS代谢通路中的差异蛋白表达量均有显著增加。与S.cerevisiae YE4共培养后,菌株共有50个蛋白差异表达,涉及的代谢通路包括QS系统、蛋白转运、氨基酸的生物合成代谢通路等,差异蛋白在QS代谢通路中的表达均下调。其中,与S.cerevisiae YE4共培养后QS代谢通路中的差异表达的蛋白与其CFS共培养引起差异表达的蛋白有所不同,说明酵母菌及其CFS对乳酸菌的QS系统的影响存在差异。
顾杰[5]2008年在《拟南芥G蛋白信号转导调节蛋白（AtRGS1蛋白）的定位及在葡萄糖信号转导中的功能研究》文中研究说明本研究以拟南芥野生型Col-0、突变体rgs1-2、gpa1-4、aba3和abi1、过表达35S:RGS1为材料,通过转基因细胞系构建、差异显示分析和双突变体构建分析等技术,用分子生物学、生物化学、分子遗传学等方法研究了AtRGS1蛋白在拟南芥葡萄糖信号转导途径中的作用。取得了以下主要研究结果:1、建立了拟南芥悬浮培养细胞体系,并对AtRGS1蛋白及相关结构域进行了细胞定位根据AtRGS1蛋白的特有结构,将编码AtRGS1的两个结构域分别进行克隆表达,结合RGS1-GFP融合蛋白表达技术证明:AtRGS1蛋白定位于细胞膜,AtRGS1-N端结构域和AtRGS1-C端结构域分别定位于质膜和细胞核。D-葡萄糖和ABA处理可以改变AtRGS1全蛋白的亚细胞定位,而AtRGS1-N端结构域定位未发生改变。2、筛选了AtRGS1蛋白介导的葡萄糖信号转导途径中特异表达的基因以拟南芥野生型Col-0和突变体rgs1-2为材料,运用差异显示技术筛选AtRGS1蛋白介导的葡萄糖信号转导途径中特异表达的基因。经反向Northern验证,得到四个差异表达蛋白,分别是拟南芥UDP葡萄糖苷转移酶(UGTs)、拟南芥γ谷氨酰水解酶、拟南芥苏氨酸内切酶、拟南芥ADP-核糖基化因子(ARF)。它们很可能是AtRGS1蛋白介导的葡萄糖信号转导途径中重要的作用因子。其中ADP-核糖基化因子(ARF)可能和AtRGS1-C端结构域具有相互作用,参与了AtRGS1-C端结构域的迁移,而且可能将处于游离状态的AtRGS1的C端结构域通过胞内运输转运至细胞膜,使其和跨膜结构域重新融合。UDP葡萄糖苷转移酶(UGTs)是催化拟南芥内源脱落酸(ABA)糖基化的一种酶,在外源高浓度葡萄糖处理后,其表达量降低,这就表明,外源高浓度葡萄糖处理导致内源ABA分解的速度降低,从而促进ABA抑制的种子萌发。而且,UDP葡萄糖苷转移酶很可能是AtRGS1介导的葡萄糖信号转导途径中下游的效应分子。3、明确了拟南芥种子萌发对葡萄糖信号响应过程中AtRGS1的作用及其与ABA的关系(1)以拟南芥野生型Col-0为遗传背景的突变体为材料,研究了AtRGS1蛋白在葡萄糖介导的种子萌发过程中的作用。结果显示,与Col相比,AtRGS1过表达的35S:RGS1和Gα缺失突变体gpa1-4的种子萌发对D-葡萄糖的抑制作用表现为超敏感,而AtRGS1缺失突变体rgs1-2表现为低敏感。35S:RGS1、rgs1-2和Col-0种子萌发对葡萄糖类似物甘露糖的响应无明显差异。己糖激酶抑制剂NAG处理对葡萄糖抑制种子萌发的效应不明显,但显著降低了甘露糖对种子萌发的抑制作用。表明在种子萌发过程中,AtRGS1参与的葡萄糖信号转导途径是一特殊途径,且该途径不依赖于己糖激酶。(2)以AtRGS1缺失突变体rgs1-2、ABA合成突变体aba3、ABA响应不敏感突变体abi1和双突变体aba3rgs1-2、abi1rgs1-2,以及野生型Col-0为材料,研究了葡萄糖介导的拟南芥种子萌发过程中AtRGS1与ABA3和ABI1的相互关系。结果表明:双突变体aba3rgs1-2表现出比单突变体对高浓度葡萄糖的抑制作用更加不敏感。说明AtRGS1和ABA3都参与了拟南芥种子萌发过程的葡萄糖信号的转导。双突变体abi1rgs1-2表现出和单突变体rgs1-2相似的对高浓度葡萄糖的抑制作用不敏感,而单突变体abi1和野生型Col均表现为敏感。
王菊荣[6]2004年在《血小板L-arg/NO通路在妊娠高血压综合征的变化及意义》文中进行了进一步梳理目的：自从80年代Furchogott发现缓激肽可以诱导内皮细胞产生一种介质引起血管松弛，他将这种物质命名为内皮源血管舒张因子（EDRF），并于1986年和Ignarro分别独立提出EDRF即一氧化氮（NO）以后，其生物学作用引起众多学者关注。体内多种细胞有L-arg/NO通路，NO合成的基本底物是L-arg和氧，在NOS作用下生成NO，发挥其生物学效应。研究发现血小板内存在左旋精氨酸/一氧化氮（L-arg/NO）通路，血小板表达的一氧化氮合酶（NOS）调节着血小板内NO的合成。血小板L-arg主要通过高亲和力非Na+的Y+蛋白氨基酸载体转运入细胞，在分子氧和血小板内NOS作用下生成NO，此反应过程由还原型辅酶Ⅱ（NADPH）作为辅助因子提供电子，由黄素单核苷酸（FMN）、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），四氢生物蝶呤（BH4）和铁传递电子，生成中间体对羟基L-精氨酸（N-OH-L-Arg）， 最终生成NO和左旋胍氨酸（L-cit）。细胞合成的NO迅速扩展至邻近细胞，激活细胞内鸟苷酸环化酶（GS），使细胞内环磷酸鸟苷（cGMP）大量增多，cGMP作为第二信使发挥其生物学效应。血小板内合成的NO抑制血小板的粘附与聚集功能，抑制血小板活化，减少血液凝固。血小板自身的NOS在调节血小板聚集中更为重要。特别在内皮功能受损、血小板过度激活时这种意义更大。即血小板L-arg/NO通路<WP=4>在调节血小板聚集中更为重要。妊娠高血压综合征是妊娠期特有的症状群，是在妊娠20周后出现水肿、高血压和蛋白尿，严重者有头痛、头晕、眼花等自觉症状，甚至出现抽搐及昏迷。妊高征是孕产妇死亡的主要原因之一，严重危害母、儿性命。妊高征主要病理生理为全身小动脉痉挛，官腔狭窄，部分病人存在血液浓缩，血液粘稠度增加，使血流减慢，微循环灌注不足，导致各脏器缺血缺氧。血管因缺氧使内皮细胞受损，基底膜暴露而致血小板黏附，微血栓形成，心、脑、肾及胎盘等重要脏器功能损害。重症患者消耗凝血因子，血小板减少，甚至有出血倾向，出现弥漫性血管内凝血（DIC）。已证实弥漫性血管内凝血是妊高征的一个特征，重度妊高征处于慢性DIC状态，凝血及纤溶系统出现明显异常，外周血小板活化、聚集和破坏增多，使血小板数减少，粘着指数及平均体积（MPV）明显增大，血小板活化、聚集增强，其机制复杂，本文研究的目的即观察血小板L-arg/NO通路在妊高征中的变化及意义。方法1采用乐杰主编第五版《妇产科学》中的妊高征分类诊断标准,选择正常妊娠晚期患者（对照组）12例，重度妊高征患者12例（观察组），各组病例均无妊高征以外的合并症及并发症。一般情况如年龄、身高、体重、孕龄等无明显差异。2采用放射性核素3H-L-arg标记法测定血小板L-arg转运。3采用放射性核素3H-L-arg标记法测定血小板内NOS的<WP=5>活性，用液闪记数仪记数3H-L-胍氨酸，以L-胍氨酸的形成表示NOS活性。4采用放射免疫法测定血小板内cGMP含量。5采用比色法测定血小板内NO2- 及 NO3-含量，用荧光分光光度仪分别在波长540 nm 测不同样本相对荧光强度，以硝酸钠为标准测定硝酸盐浓度。结果1血小板对L-arg的转运呈高亲和力的载体转运方式，随着L-arg浓度的增加，血小板对L-arg的转运能力逐渐增强。在不同的L-arg浓度，妊高征的转运速率均比正常晚期妇女患者减低。2重度妊高征血小板NOS活性为5.36±1.45 pmol/108pt·min-1，较正常对照组6.73±1.27 pmol/108pt·min-1降低有显著性差异（P<0.05）。3重度妊高征时血小板内cGMP水平为0.26±0.09 nmol/108 pt，较正常对照组0.36±0.12 nmol/108 pt降低有显著性差异（P<0.05）。4重度妊高征血小板NO水平为0.18±0.02 nmol/108 pt，较正常对照组0.24±0.07 nmol/108pt降低有显著性差异（P<0.01）。结论1重度妊高征时血小板L-arg转运降低，随着L-arg浓度的增加，血小板对L-arg的转运能力逐渐增强。在不同的L-arg浓度，重度妊高征的转运速率均比正常孕晚期妇女患者减低。2重度妊高征时血小板内NOS的活性降低。<WP=6>3重度妊高征时血小板内cGMP水平降低。4重度妊高征时血小板内NO水平降低。5重度妊高征血小板L-arg/ NOS /cGMP/NO通路明显损伤。
张超[7]2010年在《高胆红素血症对大鼠海马突触可塑性影响实验研究》文中研究指明摘要目的探讨高胆红素血症对大鼠海马突触可塑性的影响,揭示高胆红素血症对大鼠学习记忆损伤机制,为防治儿童学习记忆障碍提供实验依据。方法①模型建立:1周龄健康SD大鼠随机分成对照组(CG)和实验组1(TG1)、实验组2(TG2)、实验组3(TG3)。各实验组大鼠腹腔内分别注射不同浓度胆红素溶液以建立高胆红素血症动物模型;②观察各组大鼠神经行为活动并随机抽取各组部分大鼠并采用分光光度计测定血及海马脑组织胆红素浓度,同时光镜观察脑片确定模型是否建立成功;③神经电生理学:模型动物生长到60～90天,均用在位场电位记录方法记录海马DG区,输入/输出曲线(I/O曲线)、双脉冲反应(PPF)以及长时程增强(LTP)和去增强(DP)的兴奋性突触后电位(EPSP)和群峰电位(PS);④形态学检测:在每次记录实验结束后,分离动物海马组织用福尔马林固定,光镜观察胆红素颗粒在脑组织的沉积。结果①通过神经行为活动、脑标本大体和镜下观察及血清和脑组织胆红素浓度等指标鉴定模型建立成功;②和对照组相比,模型组I/O的EPSP幅度显著降低(P<0.05), PS幅度亦显著降低(P<0.05);③模型组双脉冲易化的峰值为146.16±16.97,小于对照组的195.89±12.01(F=12.12 ,p<0.01);④对照组的LTP幅值为137.2±3﹪(EPSP)和219.7±13.5﹪(PS),与对照组相比模型组的LTP幅值有明显的降低,分别是:119.8±2.1﹪(EPSP)和131.3±6.2﹪(PS)(EPSP: F=80.811,p= 0.000<0.01;PS: F=34.2975,p= 0.000<0.01);⑤模型组与对照组相比DP幅值相接近,差别不大,无统计学意义。结论高胆红素血症可抑制新生大鼠海马DG区颗粒细胞的基础突触传递效能,而影响颗粒细胞的同步发放、损伤双脉冲易化和大鼠海马DG区的LTP诱导,损伤了大鼠海马的突触可塑性。
王业东[8]2018年在《生长发育过程中特定ADME基因表达变化对伊马替尼及SU-1113处置影响的研究》文中研究指明药物代谢酶和转运体是参与体内药物处置和药物毒副作用的关键因素。代谢酶参与药物在机体的代谢和清除;转运体(外排或摄取)则是药物分布(跨膜转运)于细胞、组织和器官的载体,起着维持细胞内药物浓度梯度的作用。药物的血药浓度是诠释药物疗效及毒副作用的重要依据,而药物代谢酶及转运体则是影响药物血药浓度(或暴露量)的关键机制。越来越多的研究表明,药物代谢酶(CYP、UGT等)、外排转运体(P-gp、BCRP等)及摄取转运体(OCT、OATP等)直接或间接影响药物的药效或毒副作用。阐明药物的代谢转运机制及其与药效、毒副作用的关系有益于制定安全有效的用药方案。在疾病治疗过程中,儿童面临的最大风险是用药不当(作用机制、药物剂量、用药频率等)导致的毒副作用,儿童是一个特殊的用药群体,并非“缩小”的成人。正处在生长发育阶段的儿童,具有独特的生理特点,各器官功能、体内的各酶系统发育尚不完善。药物代谢酶及转运体在生长发育过程中的表达与活性势必影响药物的吸收、分布、代谢与排泄,是儿童用药安全的重要考量因素。生长发育过程中Mdr1基因表达变化与伊马替尼脑分布及骨骼毒性伊马替尼是迄今为止获得美国FDA批准的治疗儿童费城染色体阳性CML和ALL的蛋白激酶抑制剂药物。尽管临床用药过程中患者对伊马替尼表现出较好的耐受性,但长期服用伊马替尼对儿童患者骨骼长度生长以及骨骼代谢产生了一定的损伤。研究表明,儿童骨代谢和生长具有多层次且复杂的调控机制,并且与中枢神经系统的调节紧密相关。除神经递质、神经荷尔蒙的调节作用外,中枢神经系统和骨骼生长主要通过交感神经系统进行信号传导。伊马替尼的副作用与治疗时产生脱靶效应相关,尤其是对幼儿患者骨骼代谢的损伤。由于中枢神经系统参与了骨骼代谢和重建过程,因此我们提出了一个非常有意义的问题即伊马替尼在大脑中的浓度与骨骼生长参数是否有关?本研究以幼年大鼠为模型,考察了伊马替尼在不同日龄大鼠体内药动学,探讨生长发育过程中脑组织中Mdr1基因的表达及其对伊马替尼脑分布的影响,明确伊马替尼脑分布与骨骼毒性的关系。新型抗病毒药物SU-1113临床前成药性研究母婴传播(Mothor-to-child transmission,MTCT)是艾滋病传播的途径之一,也是儿童感染艾滋病的主要途径。2015年统计数据显示,全球携带HIV病毒的儿童约有320万人。治疗儿童艾滋病患者的主要治疗方案包括单独服用齐多夫定、奈韦拉平以及齐多夫定与拉米夫定或奈韦拉平的联合用药。儿童艾滋病患者治疗过程中主要面临的问题是药物耐药,以及长期用药引起的其他并发症。因此,研发新型的抗HIV病毒药物,并探索儿童患者用药方案具有重要研究意义。SU-1113是由上海泓博智源医药股份有限公司及辉瑞制药共同研发,用于抗HIV病毒治疗的蛋白酶抑制剂,目前正处于临床前研究阶段。本研究的目的在于明确SU-1113在体外系统中的代谢、转运机制,考察SU-1113在幼年及成年大鼠体内的药动学,并探索SU-1113与其他抗病毒药物联用方案。结论本文以幼年大鼠为实验模型,研究证实了生长发育过程中转运体及代谢酶表达发生变化,药物在体内的代谢、分布存在差异。本研究证实了随着日龄增长,代谢酶及Mdr1表达增加,伊马替尼在大鼠体内清除率增加,血浆暴露量(AUC)、半衰期(t_(1/2))、平均滞留时间(MRT)降低;伊马替尼脑分布减少。此外,伊马替尼脑分布与血清骨钙蛋白水平呈负相关,表明中枢神经系统可能参与了伊马替尼引起的骨代谢变化。综上,伊马替尼在处于生长期的大鼠脑组织分布与P-gp外排作用息息相关,伊马替尼可能通过局部和中枢神经调控作用影响骨骼代谢。本研究也证实SU-1113在体外体系中主要生成羧酸氧化产物(M5)和葡萄糖醛酸结合产物(M6),CYP3A4和UGT2B7是参与SU-1113代谢的主要代谢酶,并且SU-1113对CYP3A有较强的抑制作用,表明与其他药物联用时有期望成为药动学增强剂。细胞转运实验结果表明SU-1113有较好的跨膜渗透性,SU-1113不是外排转运体P-gp的底物而是抑制剂。动物体内实验表明,随着日龄增加SU-1113在大鼠体内清除率增加,血浆暴露量(AUC)、半衰期(t_(1/2))、平均滞留时间(MRT)降低。SU-1113与阿扎那韦联时可以作为药动学增强剂,使阿扎那韦血浆暴露量增加;同时利托那韦与SU-1113联用能使SU-1113血浆暴露量增加。本论文结果显示,随着个体生长发育,代谢酶及转运体表达发生变化,药物在体内的代谢、分布存在差异。因此无论是已经上市的儿童药物还是处于研发过程中的候选化合物,应当充分考虑这一因素,合理制定用药方案,避免儿童用药毒副反应的发生。
刘冬梅[9]2010年在《玻璃体切割术后并发性白内障发病机制的实验研究》文中进行了进一步梳理目的：通过检测玻璃体切割术后前房氧浓度和炎性因子的变化、晶状体纤维细胞凋亡情况以、caspase-8和DLAD基因表达的变化以及硅油填充术后晶状体基因表达谱的变化,探讨玻璃体切割术后并发性白内障的可能发病机制。方法：分五部分进行研究,第一部分：建立兔眼玻璃体切割术后并发性白内障的动物模型,术后裂隙灯观察晶状体混浊程度并照相。第二部分：于术后1天、3天、7天、1月、3月抽取前房房水检测氧浓度和IL-2、TNF-a的变化；第三部分：于术后1天、3天、7天、1月、3月取兔眼晶状体,病理学观察晶状体纤维细胞形态、原位末端核苷标记(TUNEL)法检测其凋亡并计算凋亡指数(AI)、免疫组化法测定Caspase-8的表达。第四部分：采用半定量RT-PCR技术测定术后1天、3天、7天、1月、3月晶状体上DLAD基因的表达情况。第五部分：应用DNA芯片技术对硅油填充术后晶状体的基因表达谱进行差异表达谱分析,并采用实时定量PCR进行验证。结果：成功建立了玻璃体切割术后并发性白内障的动物模型；玻璃体切割术后前房氧含量和炎性因子IL-2、TNF-a有不同程度的增加；玻璃体切割术后晶状体纤维细胞凋亡增加,细胞内Caspase-8明显表达；玻璃体切割术后晶状体的DLAD基因随时间延长表达逐渐减弱；芯片结果表明硅油填充术后晶状体变化的基因主要有氧化应激、炎症反应、细胞凋亡、信号传导、细胞分化粘附等相关基因。实时定量PCR与芯片检测结果具有相同的方向性,且数据非常接近。结论：玻璃体切割术后晶状体周围微环境的变化导致了某些调控机制的破坏,使晶状体纤维细胞凋亡增加,而细胞器的降解减少,这种动态平衡的破坏,从而导致了白内障的发生。硅油填充术后并发性白内障的发生发展涉及多基因改变；实时定量PCR进一步验证了基因芯片的可靠性。
韩小霞[10]2009年在《整合素连接激酶（ILK）在视网膜新生血管疾病中的作用研究》文中指出合并视网膜新生血管性的疾病是世界主要的致盲原因,包括糖尿病性视网膜病变(DRP)、视网膜静脉阻塞、早产儿视网膜病变和特发性视网膜血管炎(Eales病)等多种疾病。其基本病理过程是原发病造成的视网膜血管损伤和视网膜组织缺血,并可诱发视网膜新生血管生成。结构和功能不良的新生血管以及纤维血管增生膜随之引起黄斑水肿、视网膜和玻璃体内出血、对视网膜施加牵拉最终可形成视网膜脱离,损害患者的视力,甚至导致失明。在促血管生成因子中,血管内皮生长因子(VEGF)是已发现的作用最强的血管生成分子,在它的作用下,视网膜血管内皮细胞增生,形成新生血管。抗VEGF疗法(anti-VEGF,如Bevacizumab,商品名Avastin)的应用是继激光光凝和玻璃体手术后的一个治疗视网膜新生血管的新方法。但是它并不能完全抑制新生血管的发生。在视网膜血管生成中,各种促血管生成和抑制血管生成的因子的平衡是关键,众多的血管作用因子在视网膜新生血管生成中发挥作用。近年的研究显示整合素连接激酶(ILK)参与了肿瘤生长和新生血管生成过程。视网膜色素上皮细胞(RPE)是一种有紧密连接、参与视网膜外屏障、保持视网膜功能的特化细胞,也已知通过分泌如缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、VEGF和色素上皮衍生因子(PEDF)参加许多病理过程,而这几种分子都是与视网膜新生血管有关的重要分子。ILK是细胞内的一种苏氨酸/丝氨酸(Thr/Ser)激酶,以它的COOH端与跨膜蛋白整合素的β1,β3结合,介导细胞外基质蛋白的信号传递。它是磷脂酰肌醇(-3)激酶(Pi3K)的作用底物,是蛋白激酶B(PKB/Akt)和糖原合成酶激酶3(GSK-3)重要的上游激酶。ILK连接整合素到肌动蛋白细胞骨架,转导从整合蛋白到细胞外基质和各种亚细胞成分的信号以及从细胞外环境到细胞内的信号。它与整合素和生长因子结合,参与了贴壁细胞的生长、增殖、移行,在肿瘤组织中高表达,抑制其活性能减弱肿瘤的侵袭和血管生成。然而在视网膜的新生血管发生过程中是不是同时也有ILK的参与,它和已知的血管生成因子之间的关系如何是我们感兴趣的问题。本实验的目的就是检测ILK在视网膜新生血管的表达,研究ILK在新生血管疾病中可能的作用,期望为治疗视网膜新生血管性疾病提供新的思路。目的1.检测增生性糖尿病视网膜病变(PDR)新生血管膜中的血管内皮细胞的数量以及HIF-1α、VEGF、ILK的表达,观察应用玻璃体内注射Avastin后对其的影响,以了解ILK是否参与了DRP的病理过程。2.检测高糖和缺氧条件下分别诱导的视网膜色素上皮细胞ILK和ICAM-1的表达,以了解RPE是否也能表达ILK和ICAM-1,并参与糖尿病性视网膜病变的病理过程。3.检测氧致视网膜新生血管的小鼠模型眼内ILK的表达,以了解ILK是否也是参与的分子之一。方法1.玻璃体切除术中取出的24例PDR患者的视网膜前新生血管膜,其中术前玻璃体内注射Avastin者12例,未使用Avastin治疗者12例;以10例增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的视网膜前增生膜作为对照。HE染色计数增殖膜内的血管内皮细胞数量,免疫组织化学染色检测新生血管膜内HIF-1α、VEGF和ILK的蛋白表达量。2.培养人RPE细胞,采用免疫荧光染色法、免疫细胞化学染色法和western-blot法检测在高糖条件下、有无曲安奈德(TA)作用时,RPE细胞ILK和ICAM-1的表达,实时荧光定量PCR(real time-PCR)检测两者的mRNA表达,免疫组化检测蛋白表达。3.建立氧致视网膜新生血管的小鼠模型,活体内荧光素眼底血管造影显示血管病变,如渗漏、血管迂曲和无灌注区形成;在病理切片计数进入玻璃体腔内血管内皮细胞数量;免疫组化法检测ILK、HIF-1、VEGF在视网膜新生血管中和侵入玻璃体的细胞团内的表达。结果1.免疫组化半定量检测显示,在所有的24个PDR增生膜中,都有ILK的表达,无论是否使用Avastin,其表达量没有显著性差异(P=0.346)。但在Avastin组,PDR新生血管增殖膜中的血管内皮细胞数明显减少,为21.5±3.94个(n=12),相比之下,未使用Avastin组的细胞数为41.33±7.44个(n=12),P=0.003,具有统计学显著性差异。PVR视网膜前膜中的细胞数为0。在未使用Avastin的PDR增殖膜中,血管内皮表达HIF-1α和VEGF的量明显高于Avastin组,具有统计学显著性差异(PHIF-1=0.023, PVEGF=0.000)。2.免疫组化、western-blot和免疫荧光染色都显示RPE细胞在高糖培养6 h高表达ILK、ICAM-1蛋白,而实时荧光PCR检测显示在2 h其mRNA表达量开始上调,在6 h下降。高糖对RPE表达ICAM-1的上调作用能被糖皮质激素TA抑制,而ILK的上调不受其抑制。3.在氧致视网膜新生血管小鼠模型,荧光素血管造影显示视网膜血管迂曲增粗,造影剂渗漏,有无灌注区形成。视网膜切片显示模型眼视网膜前的血管内皮细胞数量增加(23.47±8.43比对0.12±0.35, P<0.01),免疫组化染色显示其高表达HIF-1α、VEGF和ILK。结论1.人PDR增殖膜中的新生血管有ILK表达,提示ILK参与了视网膜新生血管的形成过程;玻璃体内注射Avastin治疗PDR,能够减少视网膜新生血管内皮细胞数量,下调HIF-1α、VEGF在增殖膜的表达,但不能下调ILK的表达。在视网膜新生血管发生中,ILK可能是HIF-1α、VEGF的上游因子。2.RPE细胞在高糖环境下能高表达ILK和ICAM-1,RPE细胞可能通过这两种因子的信号途径而参与DRP的病变。3.在氧致视网膜新生血管小鼠模型中,新生血管的内皮细胞高表达ILK,提示ILK参与了类似的病理改变。创新点1.首次在24例人PDR增生膜中检测到ILK的表达;首次证实抗VEGF疗法(Avastin玻璃体内注射)能明显减少PDR新生血管膜内的血管内皮细胞数量和下调HIF-1α、VEGF的表达,但不能下调ILK的表达。2.首次在氧致视网膜新生血管小鼠模型中检测到ILK的表达,提示ILK参与了视网膜新生血管的发生过程。
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