李苓[1]2000年在《清脑益智方对神经细胞缺氧及谷氨酸损伤保护作用的实验研究》文中研究表明目的：探讨清脑益智方血清对脑缺血损伤后神经细胞的保护作用。 方法：应用体外细胞培养技术，培养原代鼠胚脑神经细胞，根据缺血时脑损伤机理制成缺氧及谷氨酸损伤模型。应用细胞凋亡原位检测技术（即TUNEL法）观察中药清脑益智方血清在谷氨酸损伤条件下对细胞凋亡的影响。应用逆转录-多聚合酶链式反应（RT-PCR）技术检测缺氧及谷氨酸损伤后脑神经细胞白介素-6（IL-6）在中药血清作用下的基因表达的变化。并与已知具有神经保护作用的牛磺酸进行比较研究。结果经计算机图像处理软件进行分析。通过相差显微镜及扫描电镜对细胞超微结构进行观察。 结果：200μM谷氨酸与神经细胞共同培养10min可以代表谷氨酸的神经兴奋毒性。此方法诱导的细胞凋亡以再培养3-6小时为最显著。清脑益智方血清可显著降低由谷氨酸损伤所诱导的细胞凋亡率。谷氨酸损伤组为47.28％，中药组为24.76％（p＜0.05）。并能调节损伤情况下IL-6基因的表达，使之恢复到正常免疫水平。预防组效果优于治疗组。中药在这两方面作用皆优于牛磺酸。 结论：对谷氨酸损伤模型致细胞凋亡的动态观察，提示缺血性卒中“治疗时间窗”即最佳时限应在6小时内。清脑益智方可通过对IL-6基因表达水平的调节，从而在免疫应答中保护脑神经细胞免受缺氧及谷氨酸损伤，抑制细胞凋亡，提高细胞存活率，起到保护脑神经细胞的作用。证明了预防性神经保护对阻断缺血性级联反应的 摘翌 重要作用。本研究为防治中风病的神经细胞损伤和血管性痴呆的发 生、发展的机理研究提供了试验依据。
田元祥[2]2004年在《醒脑启智胶囊及药物血清对反复脑缺血再灌注小鼠及嗜铬细胞瘤PC12细胞的影响》文中进行了进一步梳理目的：验证醒脑启智胶囊(以下简称XNQZ，由川芎、石菖蒲、橘络、枸杞子组成)临床疗效的有效性，并运用血清药理学方法，探讨XNQZ的可能作用机制。方法：第一部分 反复脑缺血再灌注小鼠行为学、病理形态学健康♂昆明小鼠随机分为假手术组和模型组，分离小鼠双侧颈总动脉，以阻断血流和再灌注两次加尾部放血法复制模型。假手术组只行过程，不阻断血流，尾部不放血。于术后7天、15天、30天进行行为学检测，然后以4℃4%多聚甲醛心脏灌注固定脑组织。取视交叉至乳头体组织，石蜡包埋，冠状切片，HE、硫堇染色，光学显微镜下观察。第二部分 XNQZ对反复脑缺血再灌注小鼠行为学、病理形态学的影响将健康♂昆明小鼠随机分为假手术组、模型组、XNQZ高剂量组、XNQZ低剂量组、银杏叶对照组、尼莫地平对照组6组。术后第2天分别灌胃0.5%羧甲基纤维素钠液或相应药物，术后7天、15天、30天进行行为学检测，治疗结束脑部取材观察病理形态。方法同第一部分。第三部分 XNQZ药物血清对PC12细胞损伤的保护作用选取健康♂SD大鼠，随机分成5组，对照血清组和药物血清组（4个剂量组）。每日分2次灌胃给药，间隔12h，连续给药3天，末次灌胃后1h取血，制备药物血清。将PC12细胞复苏，长满培养瓶底后，弃培养液，D-Hank′s液荡洗，胰蛋白酶液消化，1640培养液终止消化，吹打，使细胞分散，倒置相差显微镜下计数，然后用1640培养液将细胞稀释为5×105个/ml的细胞悬液，接种于24孔培养板，待细胞长满单层，弃培养液，用D-Hank′s液洗涤，分别加入5%不同灌胃剂量的XNQZ药物血清1640液平衡一定时间，再分别加入各种不同的损伤液（缺糖损伤液、缺氧损伤液、自由基损伤液、<WP=5>Caf损伤液、GLU损伤液、NO损伤液），达到各自不同的浓度，作用相应的时间后。倒置相差显微镜下观察PC12细胞生长及形态的变化，比色法测定上清液LDH活性，MTT法测定细胞活力。并计算各自的损伤抑制率。以上实验均同时设模型组（空白药物血清）及对照组（空白药物血清，但不加损伤条件，其它条件同实验组）。第四部分 XNQZ药物血清对缺氧诱导的PC12细胞凋亡及凋亡基因的影响1 TUNEL法检测药物血清制备、PC12细胞培养、缺氧损伤诱导方法同前。收集贴壁细胞，PBS液洗涤，涂于预先用多聚赖氨酸处理的载玻片上，吹干，4%多聚甲醛溶液固定，阻断剂室温孵育，通透液冰浴中孵育，滴加TUNEL反应混合液湿盒孵育，转化剂-POD湿盒孵育，DAB显色，封片。同时做阳性对照和阴性对照。光镜观察，病理图象分析计算凋亡指数（AI）。2 FCM检测药物血清制备、PC12细胞培养、缺氧损伤诱导方法同前，收集贴壁细胞，洗涤，吹散，离心，70%乙醇固定，细胞DNA染色、制作bcl-2、bax蛋白免疫荧光样品，流式细胞仪检测细胞增殖与凋亡及相关基因bcl-2、bax的情况，计算增殖指数（PI）。所有数据均采用SPSS for Windows10.0统计软件进行统计分析。结果：第一部分 反复脑缺血再灌注小鼠行为学、病理形态学1 不同时段2组小鼠水迷宫实验结果术后7天、15天、30天学习成绩与记忆成绩结果相似，模型组的游全程时间显著延长，错误次数明显增加，与假手术组比较差异有显著性（P<0.01）。2 不同时段2组小鼠跳台实验结果术后7天、15天、30天学习成绩与记忆成绩结果相似，模型组较假手术组反应时间显著延长，记忆潜伏时间缩短，错误次数明显增加，学习与记忆成绩下降。3 不同时段2组小鼠海马细胞形态学观察结果<WP=6>术后7天，模型组海马CA1区细胞脱失，随时间推移逐渐加重，至术后30天，海马CA1区细胞几乎完全脱失，CA2、CA3区细胞也严重脱失，胶质细胞大量增生，形成结节，呈现海马硬化。第二部分 XNQZ对反复脑缺血再灌注小鼠行为学、病理形态学的影响1 不同时段各组小鼠水迷宫实验结果术后不同时段，学习成绩与记忆成绩结果相似，治疗组与模型组比较，有显著性提高（P<0.05或P<0.01），并以XNQZ高剂量为优。2 不同时段各组小鼠跳台实验结果术后不同时段，学习成绩与记忆成绩结果相似，治疗组与模型组比较，有显著性提高（P<0.05或P<0.01），并以XNQZ高剂量为优。3 小鼠海马细胞形态学观察结果模型组海马CA1区细胞几乎完全脱失，CA2、CA3区细胞也严重脱失。XNQZ高剂量组海马CA1区细胞脱失少，有少数细胞核固缩，海马CA3区锥体细胞脱失，部分细胞核固缩。其余治疗组海马CA1区细胞脱失较多，海马CA3区锥体细胞脱失，细胞核固缩较多。第三部分 XNQZ药物血清对PC12细胞损伤的保护作用1 XNQZ药物血清对PC12细胞缺糖、缺氧及自由基、caf、NO神经毒性、GLU神经毒性损伤模型的形态学观察倒置相差显微镜下PC12细胞形状呈圆形，为贴壁细胞，折光性较强，生长速度较快，培养3d后细胞生长成簇。在缺糖、缺氧及自由基、Caf、NO神经毒性损伤作用下，损伤特征比较相似，细胞肿胀圆缩，折光性下降，贴壁功能下降，部分细胞裂解成碎片。GLU损伤细胞还可见细胞聚集现象明显。XNQZ药物血清能明显减轻缺糖、缺氧及自由基、Caf、NO神经毒性损伤，表现为细胞折光性较好，细胞碎片形成减少。能使GLU损伤细胞聚集减少。2 XNQZ药物?
张伯礼, 周志焕[3]2007年在《中药对神经元缺血损伤保护作用机制研究》文中研究说明脑血管病是严重威胁人类生命健康的三大主要死亡原因之一,有着相当高的发病率、致残率和病死率。但其缺乏有效的治疗方法,寻找新的治疗方法已经成为当今神经学科领域的热点。神经元是组成神经系统的基本功能单位,其正常代谢活动的维持高度依赖于持续和稳定的血液供应。任何全身或局部因素使脑组织血流量降低至一定阈值时均可导致神经元损害。神经元保护治疗旨在提高神经元对任何原因
张綦慧[4]2006年在《清脑滴丸对缺血海马、皮层MARCKS磷酸化及其基因表达动态变化的影响》文中进行了进一步梳理脑血管病是中老年人的常见病、多发病,其发病率高、致残率高、死亡率高,脑血管病在大多数国家死因顺位居前三位,幸存者75%以上留有不同程度的后遗症,当前对脑血管的预防、治疗效果虽有一定的提高,但无突破性进展,一个重要原因是对其发病机理认识不清。近20年来,人们从分子生物学、病理学、生理学、生物化学、药理学等角度对于脑缺血的发病机制、病理过程进行研究,认为脑缺血损害涉及到自由基损伤、能量耗竭、钙超载等问题,与兴奋性氨基酸、一氧化氮、内皮素等关系密切。随着研究的不断深入,发现许多分子介导、参与了脑缺血损害过程,其中对细胞跨膜信息传递的研究认识到不仅在神经系统乃至整个生命活动中都起着极为基本和重要的作用。许多疾病的发生和发展与细胞信号转导异常都有直接或间接的关系。缺血性脑血管病最核心的问题是神经细胞损害引起的神经功能障碍,因此,治疗缺血性脑血管病的最重要任务是保护和恢复神经细胞功能,神经保护药物可以增强神经细胞对缺血的耐受性而最终促进功能恢复,研制临床行之有效的神经保护药物仍是当今神经学科领域的重点。许多神经保护剂虽然在Ⅱ、Ⅲ期临床研究中看到希望,但因药效/毒性、副作用等原因使其进一步的研究受到限制。中药复方具有多组分、多环节、多靶点的治疗优势,有可能成为今后神经保护剂的突破点,将神经分子生物学等现代理念引入中医药的发展进程中,这样更有利于弄清疾病发生、发展以及中药治疗的分子机制。本课题观察急性缺血后海马、皮层MARCKS磷酸化及其基因表达的动态变化,探讨这些变化与缺血损害的关系,从蛋白、基因水平探讨与证实中药对脑缺血损害的保护作用及可能的机制,并进一步探讨脑缺血损害毒损脑络的理论观点。具体包括以下4部分内容及相关实验:1急性脑缺血大鼠神经功能缺损表现采用同种系体外微栓子注入法(改良Kaneko法)复制急性多发脑梗死大鼠模型,根据Bederson评分标准,对模型组大鼠进行神经系统症状观察,发现造模后大鼠有不同程度的神经功能缺损表现。2急性缺血海马、皮层MARCKS磷酸化及其基因表达动态变化应用光学显微镜(HE染色)和透射电子显微镜观察急性脑缺血大鼠脑组织形态学改变,发现造模后大鼠组织形态学发生了明显的缺血损害,脑缺血易损区海马、皮层急性缺血损害的发生、发展基本同步;应用免疫组织化学方法和western blot法检测急性缺血后各时点大鼠海马、皮层MARCKS、p-MARCKS蛋白表达变化,在海马和皮层神经细胞胞浆、胞膜中均观察MARCKS、p-MARCKS的表达,MARCKS、p-MARCKS蛋白在患侧海马、皮层的表达均为过高表达,缺血24h均变化最显著(P均<0.05);应用半定量PCR法检测缺血各时点患侧海马、皮层MARCKS mRNA表达水平,发现MARCKS mRNA在海马、皮层缺
佚名[5]2001年在《2000年度天津市科学技术奖励评审结果》文中指出经天津市科学技术奖评审委员会评审 ,市科委审定 ,我院 2 0 0 0年度有 11项科研成果获奖 ,其中一等奖 1项 ,二等奖 3项 ,三等奖 7项 ,占天津市获奖项目 2 6 4 (总数比去年减少 33项 )的 4 .2 %。这是继去年我院获 11项科
谭涛[6]2003年在《化合物9714对血管性痴呆的防治作用及作用机理》文中研究说明血管性痴呆(vascular dementia，VD)是由于缺血或出血性脑血管病及全脑缺血、缺氧而引起的认知障碍，以记忆减退、表情淡漠、呆滞或人格改变为主要临床表现。VD的发生率因研究人群、筛查方法、诊断标准和时间周期的不同而异，欧美国家VD占老年痴呆的10％～20％，而在高脑卒中率的亚洲国家VD的发病率较高，我国VD发病率占痴呆的60％～70％，并随着社会的老龄化呈增长趋势。VD严重影响老年患者的生活质量，给社会和家庭带来沉重的负担，因此近年来得到广泛关注，对其的研究也日益广泛和深入。 祖国传统医学是一个巨大的宝库，近年来大力开展中医中药对该病的防治作用，无论是对中药复方还是单味中药有效部位和单体的研究都取得了显著的成果。化合物9714是军事医学科学院放射医学研究所提供的知母皂苷的一种单体化合物，临床拟用于血管性痴呆，经初步研究发现该药具有良好的抗脑缺血，改善脑血流量，抑制血小板聚集，改善模型动物学习和记忆障碍等药理作用。 本研究在前期研究的基础上继续探讨化合物9714对拟VD模型动物的防治作用，进一步研究该药防治血管性痴呆的药理作用及作用机制，主要实验结果如下： 1 化合物9714对D-半乳糖诱导脑功能衰退小鼠学习记忆的改善作用和抗脑组织自由基损伤的作用 D-半乳糖(100mg／kg)颈背部皮下注射42～44天，可以造成小鼠学习记忆功能障碍，表现为模型动物在水迷宫测试中各点学习记忆的时间和错误次数增加，化合物9714不同剂量组(15mg／kg、30mg／kg、60mg／kg)可以改善此种学习记忆障碍，表现为水迷宫测试中，缩短各点训练和测试的时间，减少错误次数，与模型组相比具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。 长期大剂量注射D-半乳糖可以造成自由基损伤，我们观察到颈背部皮下注射D-半乳糖47天可以造成模型小鼠脑组织自由基损伤，表现为脑组织中SOD活力降低，MDA含量升高，GSH含量下降，与空白组相比具有统计学意义，给予化合物9714不同剂量组的动物则显示此种自由基损伤得到不同程度的改善，表现为SOD活力有一定提高，MDA含量降低，GSH含量增加，与模型组相比结果有统计学意义(P＜0.01)。4 化合物9714对血管性痴呆的防治作用及作用机理2化合物9714对双侧颈总动脉结扎致脑缺血模型大鼠学习记忆能力的影响 本实验采用双侧颈总动脉永久性结扎致血管性痴呆大鼠模型，连续给药45天后，进行Moms水迷宫学习记忆检测，分析比较各组动物在定位航行试验和空间搜索试验中的学习记忆获得及巩固能力。结果表明，与模型组相比，化合物 9714（10ms／ks、20。s／ks、40。s／ks）各剂量组均能增强模型动物的学习记忆能力、缩短定位航行试验中第二天及第三天的逃避潜伏期（k0．05或k0．01），提高在空问搜索试验中的原平台象限游泳距离占总距离的百分比（P＜0．05＊该实验提示，化合物9714可以增强双侧颈总动脉结扎大鼠的空问学习记忆能力。3化合物9714对双侧颈总动脉结扎致脑缺血模型大鼠脑组织血管通透性的影响 采用结扎大鼠双侧颈总动脉制备急性全脑缺血模型，结扎6小时后大鼠脑组织血管通透性明显增加，脑组织中伊文思蓝（Evans blue，EB）含量增加，与空白对照组比有统计学意义，给予化合物 9n4不同剂量组门0mg八g、20mg儿g、40mg乃g），可以使脑组织血管通透性的增加得到改善，表现为使脑组织中伊文思蓝含量降低，与模型组相比有统计学意义（P硼．05或P叩．01）。4化合物9714对由滴加5叫T引起的大鼠大脑皮层血管血流量下降的影响 采用 Biopac MP100激光多普勒血流分析系统描记麻醉大鼠大脑皮层血管血流电压值，观察到在大鼠大脑皮层血管滴加5－HT后能引起血流电压值的降低，表明血流量有所下降，作用迅速，给化合物9714不同时间后（给药lh，24h，3d）的各组，表现出在滴加 5－HT后，smin，10min，20min三个时段均具有一定的对抗血流量下降的作用，与模型组相比，同等时段的血流电压值下降百分率有所降低（P＜0．05或P＜0．01）。5化合物9714对大鼠离体胸主动脉血管环的舒张作用 采用大鼠离体胸主动脉血管环实验观察到化合物9714对该离体的血管平滑肌有一定的直接舒张作用门0－’mol儿－10刁mol儿L对由终浓度为 10－’m八的 NE和终浓度为 8 onuno 1／L的 KC引起的血管环预收缩有不同程度的对抗作用，表现为与给药前相比，血管环收缩的张力值下降，结果显示有统计学意义（P＜0．05或P＜0．01）。 上述实验结果显示，作为主治血管性痴呆的药物，化合物9714具有改善学习记忆功能和抗脑缺血性损伤的作用。其抗自由基损伤，保护缺血时的血脑屏障，降低血管通透性，增加脑血流量以及因血管收缩所致的脑血流速度降低，一定程度的舒张血管平滑肌作用有可能是该药对血管性痴呆脑保护作用的机制之一。中文摘要5关键词：化合物9714;脑血流量;脑缺血;血管性痴呆;血脑屏障;学习记忆;自由基损伤
伍大华[7]2013年在《基于脑髓理论分阴阳论治的补肾活血法干预血管性痴呆的疗效及作用机制研究》文中认为目的：在中医脑髓理论的指导下,通过随机对照的研究方法,观察温肾活血、滋肾活血两种不同的补肾活血法治疗(Vascular dementia, VaD)的临床疗效,并评价两法对VaD患者胆碱能系统神经递质及血管内皮功能活性物质的影响,以探讨作用机制；另外,通过对肾阳虚血瘀证、肾阴虚血瘀证VaD患者智能障碍结构差异、胆碱能神经递质失衡和血管内皮功能活性物质变化的不同特点及对应治法干预效果的分析,验证补肾活血法治疗VaD分阴阳论治的优越性,提出“脑髓阴阳论”的假说。方法：采用完全随机、对照的原则,用随机数字表法按照1：1的比例将符合肾阳虚血瘀证VaD诊断标准的50例肾阳虚血瘀证患者,随机分为温肾活血组25例和对照1组(奥拉西坦胶囊)25例；将符合肾阴虚血瘀证VaD诊断标准的50例肾阴虚血瘀证患者随机分为滋肾活血组25例和对照2组(奥拉西坦胶囊)25例。温肾活血组给予温肾活血方治疗,滋肾活血组给予滋肾活血方治疗,对照1组和对照2组均给予奥拉西坦胶囊治疗。从简易精神状态量表(MMSE)、日常生活活动能力量表(ADL)、中医证候、中枢胆碱能神经递质、血管内皮活性物质等方面进行研究,观察温肾活血方和滋肾活血方治疗VaD的临床疗效,并探讨其生化机制。另外,从临床表现特点、智能障碍构成、胆碱能神经递质失衡、血管内皮活性物质变化等方面,比较肾阳虚血瘀证和肾阴虚血瘀证VaD的差异,寻找脑髓分阴阳的临床与物质依据。结果：共收集患者100例,包括肾阳虚血瘀证患者50例、肾阴虚血瘀证50例。其中剔除、脱落病例5例,最终纳入统计的病例为95例,其中肾阳虚血瘀患者47例(包括温肾活血组24例、对照1组23例),肾阴虚血瘀患者48例(包括滋肾活血组24例、对照2组24例)。温肾活血组、滋肾活血组、对照1组、对照2组的MMSE评分、ADL评分、中医证候积分等观察指标均明显改善(与治疗前比较,P<0.01或P<0.05),而且温肾活血组、滋肾活血组的疗效均明显优于奥拉西坦胶囊(治疗后组间比较,P<0.05或P<0.01))；温肾活血组、滋肾活血组的神经功能缺损评分(NIHSS)均明显改善(与治疗前比较,P<0.05),对照1组、对照2组均不明显(与治疗前比较,P>0.05)。MMSE项目增分上,四组的记忆积分、计算积分均明显改善(与治疗前比较,均P<0.05),温肾活血组与对照1组比较无显著性差异(P>0.05),滋肾活血组与对照2组比较无显著性差异(P>0.05)。温肾活血组的语言积分、滋肾活血组的视空间执行能力积分均得到明显改善(与治疗前比较,P<0.05),对照1组的语言积分、对照2组的视空间执行能力积分均改善不明显(与治疗前比较,P>0.05)。温肾活血组与对照1组的定向力积分、视空间执行能力积分均无明显改善(与治疗前比较,均P>0.05)。滋肾活血组与对照2组的定向力积分、语言积分均无明显改善(与治疗前比较,均P>0.05)；肾阳虚血瘀组与肾阴虚血瘀组MMSE构成因子比较：记忆力、计算力、定向力均无显著性差异(P>0.05)。语言有极显著性差异(P<0.01),提示肾阳虚血瘀VaD的语言损害重于肾阴虚血瘀证VaD。视空间执行能力有显著性差异(P<0.05),提示肾阴虚血瘀证VaD的视空间执行能力损害重于肾阳虚血瘀证VaD.肾阳虚血瘀证与肾阴虚血瘀证两组VaD患者的胆碱能神经递质和血管内皮活性物质比较：Ach有极显著性差异(P<0.01),说明肾阳虚血瘀VaD患者的Ach含量较肾阴虚血瘀更低;AchE有极显著性差异(P<0.01),说明肾阴虚血瘀VaD患者的AchE活性较肾阳虚血瘀增加更明显；ET有极显著性差异(P<0.01),说明肾阴虚血瘀VaD患者的血浆ET含量较肾阳虚血瘀增加更明显；CGRP有极显著性差异(P<0.01),说明肾阳虚血瘀VaD患者的血清CGRP含量较肾阴虚血瘀降低更明显。四组的Ach含量提高、AchE活性抑制、ET含量降低、CGRP含量增加均明显(与治疗前比较,P<0.01或P<0.05),而且温肾活血组治疗后的Ach含量提高较对照1组明显(P<0.05)、滋肾活血组治疗后的AchE活性抑制较对照2组明显(P<0.05),两中药组治疗降低ET含量、增加CGRP含量作用均优于对照组(P<0.01)。结论：1.温肾活血方和滋肾活血方均为VaD临床有效的治疗组方,体现了中医辨证论治的优越性。2.温肾活血方和滋肾活血方的临床疗效及对认知障碍因子构成改善的针对性可能是分阴阳论治肾虚血瘀证VaD的优势体现。3.调节胆碱能神经递质失衡及调节血管内皮活性物质失调、改善血管内皮功能可能是温肾活血方和滋肾活血方干预VaD的疗效机制之一。4.脑髓亦有阴阳之分,肾阳虚血瘀证和肾阴虚血瘀证VaD在痴呆临床表现、认知能力构成、胆碱能神经递质失衡、血管内皮活性物质变化等方面存在的差异,可能是脑髓阴阳论的临床和物质基础。
杨田田[8]2018年在《三七总皂苷对MCAO大鼠和SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤后Lingo-1及EGFR/PI3K/AKT通路的调节作用》文中研究说明研究目的1探索三七总皂苷对MCAO大鼠术后7天的神经保护作用和对Lingo-1及EGFR/PI3K/AKT信号通路的调节作用。2探索三七总皂苷对SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤的保护作用和对Lingo-1及EGFR/PI3K/AKT信号通路的调节作用。研究方法1动物实验部分实验一:将大鼠随机分为假手术组和手术组。手术组采用改良Longa方法,制备大鼠大脑中动脉局灶梗死模型,约术后2h,进行EZ Longa评分,1-3分纳入,0分和4分剔除。将纳入大鼠随机分为模型组、PNS大剂量组、PNS小剂量组、尼莫地平组。假手术组大鼠仅切开颈正中皮肤,暴露颈总动脉、颈内动脉与颈外动脉,然后缝合皮肤。按照大鼠与人的体表面积等效剂量折算,给药剂量及给药方式为:PNS大剂量组为每日7.2mg/100g腹腔注射;PNS小剂量组每日3.6mg/100g腹腔注射;尼莫地平组每日1.44mg/100g灌胃;假手术组和模型组每日分别生理盐水1mL/100g腹腔注射。术后1-7天,每天进行大鼠神经功能评分,计算体重指数。实验二:通过Western Blot法检测梗死侧皮质SYN和PSD95蛋白表达量,探索PNS的神经保护作用。实验三:通过实时荧光PCR、免疫组化、Western Blot方法进一步探究三七总皂苷对MCAO大鼠术后7天大脑梗死侧皮质中Lingo-1及EGFR/PI3K/AKT信号通路的影响。2细胞实验部分实验四:SH-SY5Y细胞培养及缺氧时间摸索、药物浓度摸索。通过CCK8检测细胞存活率的方法确定细胞缺氧缺糖时间和PNS浓度。设置分组:正常组、模型组、PNS组、PNS+AG1478组、AG1478组。按照分组给予相应的药物处理和缺氧处理,CCK8法检测细胞存活率、AnnexinV-FITC/PI双染法测凋亡、微板法测定乳酸脱氢酶活性。实验五:通过实时荧光PCR方法和Western Blot方法探索三七总皂苷对缺氧缺糖SH-SY5Y细胞中Lingo-1及EGFR/PI3K/AKT信号通路的影响。研究结果1动物实验部分实验一:TTC染色:模型组大鼠大脑切片右侧可见连续白色梗死区,结果显示造模成功。体重指数评价:术后1天,假手术组大鼠体重指数略有升高,各手术组大鼠体重指数下降明显,模型组与假手术组相比,下降明显(P<0.01);术后第2、3天,各手术组大鼠体重指数持续下降;术后第4天,PNS小剂量组(P<0.05)、PNS大剂量组(P<0.01)、尼莫地平组(P<0.01)体重指数明显高于模型组,结果有统计学差异;术后第6天,PNS小剂量组体重指数与模型组相比具有显著差异(P<0.01);术后第7天,PNS大剂量组大鼠体重指数开始止降回升。mNSS神经功能评分评价:假手术组在1-7天内,没有出现神经功能缺失症状。术后1天,手术组大鼠均出现严重的神经功能缺失症状;术后1-3天,各手术组大鼠mNSS神经功能评分逐渐下降,用药各组与模型组相比未见差异(P>0.05);术后第4天,尼莫地平组(P<0.05)、PNS大剂量组(P<0.01)评分明显低于模型组;术后第5天,PNS小剂量组评分开始低于模型组(P<0.05);尼莫地平组评分明显低于模型组(P<0.01)。实验二:SD大鼠脑梗死7天,梗死侧皮质中SYN和PSD95蛋白表达量均明显下降;PNS小剂量组、PNS大剂量组、尼莫地平组大鼠梗死侧皮质SYN、PSD95蛋白表达量明显高于模型组,具有统计学差异(P<0.01)。实验三:qRT-PCR检测MCAO大鼠7天后梗死侧皮质Lingo-1、EGFR、PI3K、AKT mRNA的表达:SD大鼠MCAO术后7天,模型组大鼠Lingo-1的mRNA表达量明显高于假手术组,有统计学差异(P<0.01);PNS小剂量组、PNS大剂量组、尼莫地平组Lingo-1 mRNA的表达量较模型组显著下降,有统计学差异(P<0.01);SD大鼠MCAO术后7天,各手术组大鼠EGFR、PI3K、AKT mRNA表达量略有升高,但无统计学差异(P>0.05)。Western Blot 法检测 MCAO 大鼠脑组织中 Lingo-1 及 p-EGFR/EGFR、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白的表达:SD大鼠MCAO术后7天,与假手术组相比,模型组Lingo-1蛋白表达明显升高,具有统计学差异(P<0.01);PNS小剂量组、PNS大剂量组、尼莫地平组Lingo-1蛋白表达较模型组明显降低。SD大鼠MCAO术后7天,模型组p-EGFR/EGFR蛋白比值与假手术组比明显升高,具有统计学差异(P<0.01);PNS小剂量组、PNS大剂量组、尼莫地平组p-EGFR/EGFR蛋白比值较模型组明显升高;PNS大剂量组、尼莫地平组p-EGFR/EGFR蛋白表比值均值大于PNS小剂量组。SD大鼠MCAO术后7天,模型组p-PI3K/PI3K蛋白比值与假手术组相比明显升高(P<0.01);PNS小剂量组、PNS大剂量组、尼莫地平组p-PI3K/PI3K蛋白比值较模型组明显升高;PNS大剂量组、尼莫地平组p-PI3K/PI3K蛋白比值均值大于PNS小剂量组。SD大鼠MCAO术后7天,模型组p-AKT/AKT蛋白比值与假手术组相比明显升高(P<0.01);PNS小剂量组、PNS大剂量组、尼莫地平组p-AKT/AKT蛋白比值较模型组明显升高;PNS大剂量组、尼莫地平组p-AKT/AKT蛋白比值均值大于PNS小剂量组。免疫组化法测MCAO大鼠术后7天脑组织中Lingo-1、p-EGFR、p-AKT、p-PI3K的表达:免疫阳性物质被染成深棕色颗粒,结果与Western Blot趋势一致。2细胞实验部分实验四:选取16h作为最佳缺氧时间,既可以造成缺氧缺糖损伤,又可以保证大部分细胞的存活率。采用PNS浓度为640mg/L为造模药物浓度,此时细胞存活率最高。设置实验分组:正常组、模型组、PNS组、PNS+AG1478组、AG1478组。CCK8结果:缺氧缺糖损伤对SH-SY5Y细胞造成了严重的损伤,PNS可提高存活率,与模型组相比,有统计学差异(P<0.01)。当PNS组细胞加入AG1478后,PNS的保护作用减弱。单用AG1478时,与模型组相比,细胞存活率显著降低(P<0.01)。PNS对SH-SY5Y细胞缺氧缺糖处理后细胞凋亡的影响:SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤后,凋亡率明显升高。PNS可明显降低细胞的凋亡率(P<0.01)。当PNS组细胞培养基中加入AG1478后,明显抑制PNS的抗凋亡作用。LDH活性检测结果:缺氧缺糖损伤对SH-SY5Y细胞造成了严重的损伤,使培养基中LDH活性明显增高(P<0.01)。PNS可有效保护SH-SY5Y细胞,降低LDH活性,与模型组相比,有统计学差异(P<0.01)。AG1478可减弱PNS对的保护作用。AG1478组与模型组相比,LDH活性明显增高,结果有统计学差异(P<0.01)。实验五:三七总皂苷对SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤Lingo-1及EGFR/PI3K/AKT mRNA表达的影响:SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤后,与正常组组相比,模型组Lingo-1 mRNA 表达明显升高(P<0.01);PNS 组和 PNS+AG1478 组 SH-SY5Y细胞 Lingo-1 mRNA表达水平较模型组明显降低(P<0.01)。AG1478组Lingo-1 mRNA表达与模型组无差异。SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤后,正常组、PNS组、PNS+AG1478组、AG1478组细胞EGFR、PI3K、AKTmRNA的表达与模型组之间无差异。三七总皂苷对SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤Lingo-1及p-EGFR/EGFR、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达的影响:SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤后,模型组Lingo-1蛋白的表达与正常组相比明显升高(P<0.01);PNS组SH-SY5Y细胞Lingo-1蛋白表达水平较模型组明显降低(P<0.01);PNS+AG1478组SH-SY5Y细胞Lingo-1蛋白表达水平较模型组降低,具有统计学差异(P<0.05);AG1478组Lingo-1蛋白表达与模型组无差异。SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤后,模型组p-EGFR蛋白与EGFR总蛋白比值与正常组相比明显升高,具有统计学差异(P<0.01);PNS组p-EGFR蛋白与EGFR总蛋白比值与模型组相比,比值升高明显,具有统计学差异(P<0.01);PNS+AG1478组p-EGFR蛋白与EGFR总蛋白比值与模型组无差异(P>0.05);AG1478组p-EGFR蛋白与EGFR总蛋白比值与模型组相比,比值降低明显(P<0.01)。SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤后,模型组p-PI3K蛋白与PI3K总蛋白比值与正常组相比明显升高,有统计学差异(P<0.01);PNS组p-PI3K蛋白与PI3K总蛋白比值与模型组相比明显升高,有统计学差异(P<0.01);PNS+AG1478组和AG1478组p-PI3K蛋白与PI3K总蛋白比值与模型组相比无统计学差异(P>0.05)。SH-SY5Y细胞缺氧缺糖损伤后,模型组p-AKT蛋白与AKT总蛋白比值与正常组相比明显升高(P<0.01);PNS组p-AKT蛋白与AKT总蛋白比值与模型组相比明显升高(P<0.05);PNS+AG1478组p-AKT蛋白与AKT总蛋白比值与模型组相比无统计学差异(P>0.05)。AG1478组p-AKT蛋白与AKT总蛋白比值与模型组相比明显降低(P<0.01)。研究结论三七总皂苷对MCAO大鼠和缺氧缺糖SH-SY5Y细胞起到神经保护的作用:三七总皂苷可以促进MCAO大鼠体重指数的增长、神经功能的恢复,提高梗死侧皮质SYN、PSD95蛋白的表达;可以提高缺氧缺糖SH-SY5Y细胞存活率、抑制细胞凋亡、降低乳酸脱氢酶活性。三七总皂苷可以通过降低神经系统受损后Lingo-1的高表达表达及促进EGFR/PI3K/AKT信号通路的激活发挥神经保护作用。
周志焕[9]2005年在《中药神经元保护作用研究集萃》文中进行了进一步梳理近年来大量的中药实验和临床研究从多方面阐明了中药神经保护的药理作用机制 ,现就其研究综述如下 :1 对神经细胞凋亡与基因表达的影响灯盏花可以防止脑缺血再灌注诱导的PKC激活 ,从而防止脑缺血再灌注诱导神经元凋亡[1 ] 。腹腔注射黄芪注射液后可抑制P5
梅建勋[10]2000年在《中药神经保护作用的离体实验研究——“中药脑脊液药理学”实验方法的提出》文中进行了进一步梳理目的 目前应用“血清药理学”方法对中药进行药理研究特别是药效研究倍受关注，但考虑到血脑屏障的存在，神经胶质细胞和神经元的微观生存环境和屏障以外的其它体细胞有很大差别，故本实验拟通过观察含有中药清脑益智方的血清和脑脊液（以下均简称中药血清和中药脑脊液）对于血脑屏障以内的细胞-经元和星形胶质细胞的影响，试图从中优选中药作用于中枢神经系统的最佳实验方法。方法 家兔在口服中药复方清脑益智方水煎液后，血清和脑脊液分别被收集，然后按5％、10％、20％浓度加入至体外培养鼠脑皮层星形胶质细胞和神经元培养液中，以台盼蓝染色、乳酸脱氢酶和MTT试验为指标观察正常血清、中药血清、正常脑脊液和中药脑脊液对于上述两种细胞的死亡率和细胞活性的影响。结果 1．星形胶质细胞：正常血清组和中药血清组与空白对照组比较，细胞死亡率明显升高、细胞孵育液中乳酸脱氢酶含量明显升高、MTT试验OD值明显下降，正常血清组与中药血清组之间比较没有明显差异，说明正常血清和中药血清对星形胶质细胞产生了明显的毒害作用，似乎这种毒性与血清本身有关，与中药的介入无关；而正常脑脊液和中药脑脊液与空白对照组比较，没有明显差异。2．皮层神经元：实验结果同上，正常血清和中药血清都对细胞产生了毒害作用，而正常脑脊液和中药脑脊液未见毒害作用。结论 本实验证明正常血清和中药血清都对细胞产生了一定毒害作用，说明“血清药理学”的方法不适合研究中药对上述两种细胞的影响，因为血清本身对于细胞的毒害作用将掩盖中药的药理作用。而参考“血清药理学”的思路，利用含药脑脊液来进行观察可能比较合理，姑且称这种方法为“脑脊液药理学”。
参考文献：
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[9]. 中药神经元保护作用研究集萃[J]. 周志焕. 中医药学刊. 2005
[10]. 中药神经保护作用的离体实验研究——“中药脑脊液药理学”实验方法的提出[D]. 梅建勋. 天津中医学院. 2000