1.佛山市第二人民医院口腔科 广东佛山 528000 2.昆明医学院口腔医院正畸科 云南昆明 650000 3.第四军医大学口腔医学院正畸科 陕西西安 710032
[摘要] 目的：利用激光共聚焦扫描显微镜（LCSM）技术观察静磁场作用下骨骼肌细胞胞浆内Ca2+浓度的变化。方法：采用原代培养的大鼠面颌骨骼肌细胞，利用LCSM测定180mT、280mT、360mT磁场分别作用12h、36h、60h后，大鼠面颌骨骼肌细胞内游离Ca2+浓度的变化。结果：12h组各磁场强度的骨骼肌细胞内游离Ca2+浓度无明显变化。36h组细胞内Ca2+浓度均有增加，且随着磁场强度的增加细胞内Ca2+浓度增加明显。60h组细胞内Ca2+浓度增加均非常明显，各磁场强度组相互之间无统计学意义。结论：静磁场促使大鼠面颌骨骼肌细胞胞浆内Ca2+浓度增加，与时间呈正相关关系。
关键词：静磁场；大鼠面颌骨骼肌细胞；LCSM；Ca2+浓度
[Abstract] Ojective: To observe the change of intracellular calcium concentration with LCSM after static magnetic fields exposed. Methods: Rat skeletal muscle cells were cultured and exposed in the static magnetic fields of 180mT、280mT、and 360mT, for 24h，48h and 72h，respectively, LCSM was used to measure the concentration of intracellular calcium ion. Results: In the 12h group, intracellular calcium concentration has no significantly change; Intracellular calcium concentration has more and more increased with intensity of static magnetic fields in 36h group. After 60h, Intracellular calcium concentration of 180mT、280mT、and 360mT group hasn’t different. Conclusion: Certain intensity of static magnetic fields can increase intracellular calcium concentration which is related with exposed time.
[Key words]: Static magnetic fields; Skeleal muscle cells; LCSM; Intracellular calcium concentration
磁性材料作为一种新型、持久、方便和价格低廉的力学来源已经广泛应用于临床医学治疗中[1]。口腔临床利用磁场间的吸引力或排斥力来进行各种治疗也已经成为一种趋势，如修复科的磁性附着体[2]、正畸科磁力功能矫治器[3]。其中磁力功能矫治器所用的磁块暴露明显又无屏蔽，所以正畸医生和患者都对磁块是否对口腔组织健康不利存有疑问。
口腔正畸磁力功能矫形治疗除了使神经、颌骨改建之外，咀嚼肌张力的重建成为矫治成功与否的关键因素。因此，磁块对咀嚼肌是否有影响需要我们进行深入的研究。但是，目前关于磁场对骨骼肌细胞影响方面的研究很少，磁场产生的磁力对骨骼肌细胞的影响方面的研究国内外均未见报道。
骨骼肌细胞胞浆内Ca2+稳态是细胞许多信息正常传递的基础，对维持骨骼肌正常肌功能有重要意义。细胞的任何损伤性刺激必将引起细胞内Ca2+浓度的变化[4]。本实验通过激光共聚焦显微镜观察静磁场对面颌骨骼肌细胞胞浆内游离Ca2+浓度的影响，了解磁场对骨骼肌细胞的作用机理，从而探讨静磁场磁力功能矫治器临床应用的安全性。
1 材料和方法
1.1 细胞选择：新生2～3天龄SD大鼠的颌面部咬肌中分离肌组织进行原代培养。当原代培养的SD大鼠面颌肌细胞生长形成单层，铺满培养瓶80％以上时，超静工作台无菌条件下传代。
选第四代传代培养的SD大鼠面颌骨骼肌细胞按1×104/ml的密度传代至25ml的培养瓶中，放入37℃、5﹪的CO2含量、饱和湿度的恒温培养箱中培养。
1.2 主要仪器和试剂：Fluo4 AM(Molecular Probe，美国)，激光共聚焦专用培养皿，低温高速离心机，激光共聚焦显微镜（Carl Zeiss/Zxiovert 100M），静磁场加载装置。
1.3 实验分组：
分别于实验前将传代培养3天的骨骼肌细胞离心后，以1 ×104个/ml密度,接种于12个已消毒的共聚焦专用培养皿中。
实验组：9个培养皿中的细胞分别放入磁场强度180mT、280mT、360mT的加磁装置中，恒温培养箱中分别孵育12h、36h、60h；
对照组：3个培养皿中的细胞不加磁，在培养箱中分别孵育12h、36h、60h。
1.4 磁场作用的肌细胞培养系统的建立：
磁性材料为第三代高磁能稀土永磁体钕铁硼（NdFeB）N33 ，将两块钕铁硼磁块的N极与S极对置，分别固定于特制的木箱相对的内侧面，培养瓶位于磁极中间，使磁力线垂直通过培养板，磁块的大小为10×50×100mm，作用力面（50×100mm）与培养瓶的大小基本一致，以保证培养板上的细胞均匀受到磁场的作用（图1）。
1.5 磁场强度的计算
我们根据正畸临床常用的500g力为计算标准，通过以上公式计算得出, 磁块的充磁强度为282mT, 也根据这个计算结果，设磁场的主要研究值为280 mT，同时分别各设360mT和180 mT的磁场强度值各一个.
1.6 细胞内钙离子浓度的测定：
细胞加磁12h时，将培养皿中细胞用PBS清洗2次，20﹪多聚甲醛固定20分钟。PBS液再次清洗，加入荧光标记物Fluo-4-Fura-red AM (Molecular Probes)（浓度0.125℅），37℃培养箱中孵育1小时。PBS液清洗2次, 洗掉多余的荧光标记物, 缓冲甘油封片。然后置于激光共聚焦扫描显微镜载物台上,以波长488 nm的激光进行观察，照相，并进行统计学分析。对照组和加磁36h、60h时间组细胞同上。
2 结果
激光共聚焦扫描显微镜检测发现，加磁前实验组与对照组的细胞无明显差异。12h加磁组，与对照组相比，荧光强度变化不明显，组间变化也无统计学意义。加磁36h组，与对照组比较，骨骼肌细胞内钙离子的荧光强度变化明显：细胞内荧光强度高，细胞光亮，轮廓清晰，但对照组细胞染色变浅，背景逐渐模糊。随着磁场强度的增加,骨骼肌细胞内钙离子的荧光强度逐渐增强，组间差异有统计学意义（P<0.05）(见表一)。60h加磁组，与对照组比较，骨骼肌细胞胞浆内荧光强度增加，与36h组360mT基本一致，各磁场强度组间无明显区别,。
3 讨论
3.1磁力间力的计算：以往国内外关于磁场对细胞的影响方面的研究，都是将细胞置于一定强度的磁场中照射，研究的是细胞受磁场影响后的变化[6]。本研究中是将两块高强度的磁块异极相吸力对放，通过调整两块钕铁硼永磁体之间的间隙大小来获得不同的磁力，培养皿位于钕铁硼永磁铁中央，磁力线分布均匀。通过公式能够清楚地计算出细胞所受磁力的大小，该公式刚好适用于永磁体结合面之间并非是零间隙状态时的情况[5]。和以往研究相比，磁场加载模型设计更加合理，它更加适合正畸临床关于磁力的应用。
3.2 荧光探针：以往所用的荧光探针多使用Fluo-2 或者Fluo-3，有时加F-127促进荧光标记探针的负载。这两种探针因其价格便宜、效果尚可，而被研究者们广泛接受。在本研究中，我们采用Fluo-4 AM (Molecular Probes)是一种新型的高度特异性的钙离子荧光探针, Fluo-4 AM是Fluo 4的一种乙酸甲酯衍生物，其非常容易通过孵育导入细胞中，Fluo-4若以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但是当它与钙离子结合后荧光会增加60至80倍。因此, 细胞内游离钙离子浓度的变化可通过细胞内荧光强度的高低灵敏地反映出来。
3.3 磁场照射后细胞的变化：细胞内钙以结合Ca2+和游离Ca2+两种形式存在, 通常情况下细胞内钙99.9%以上为结合钙, 主要分布在细胞核、线粒体、内质网(肌浆网)和质膜, 细胞在非激活状态时细胞内Ca2+浓度非常低，其浓度发生变化是细胞生理功能的关键环节[7]。本研究中，细胞在受到磁场照射后，在12h内各磁场强度组均未检测到Ca2+ 浓度的变化，表明细胞处于未激活状态；在36h时钙离子浓度均有增加，并随着磁场强度增加而增高，应该与当细胞受外界刺激后通过膜将信息传入胞内,细胞内钙Ca2+通道开放有关，但是细胞本身生长状态良好，表明细胞内Ca2+浓度的增加在细胞可代偿和自身调节的范围内[4]；在60h时细胞内Ca2+浓度与36h组360mT基本一致，但细胞坏死严重，各强度磁场组之间变化无统计学意义。这种情况应该是磁力长时间作用细胞后，受调节的磷脂酶、蛋白酶及核酸内切酶等被激活，导致磷脂分解和细胞骨架破坏，最终造成细胞的损伤[8]。说明磁场对细胞的影响具有时间依赖性，此研究和仇丽鸿等研究结果一致[9]。
参考文献
[1] 詹平,戴闽. 提高永磁材料磁性能在医学中的应用及展望.生物骨科材料与临床研究,2017, 4(5):18-20
[2] 马楚凡.磁性附着体在种植体支持式覆盖义齿中的临床应用.见：前田芳信，主编.新型磁性附着体固位的种植义齿. 北京. 人民军医出版社, 2016
[3] 徐芸，胡江天.双阻板磁力矫治器矫治早期AngleⅢ类错合[J].中华口腔医学杂志, 2014, 34(3):148-150
[4] RizzutoR, Pinton P, FerrariD, et a.l. Calcium and apoptosis: facts and hypotheses[J]. Oncogene, 2013, 22(53): 8619-8627
[5]赵凤桐，王淑文.永磁体间力的测.。吉林工学院学报, 2016，1: 9-13
[6]杨凌,巢永烈，杜莉.磁性附着体模拟静磁场对人牙周膜成纤维细胞的生物学效应研究.华西口腔医学杂志，2017,25（4）：316-319
[7] Bers DM. Cardiac excitation-contraction coupling [ J]. Nature , 2016, 415(6868): 198-205.
[8] Cheng H, Wang SQ. Calcium signaling between sarcolemmal calcium channels and ryanodine
receptors inheart cells[J]. FrontBiosci ,2015;1(7):d1867-78
[9] 仇丽鸿，秦科，钟鸣，等．静磁场对牙周炎大鼠牙周膜组织中骨形成蛋白-2影响的实验
研究[J]．华西口腔医学杂志，2015，23(4)：319-321
论文作者:王丽艳1 许艳华2 林珠3
论文发表刊物:《临床医学教育》2018年7期
论文发表时间:2018/8/14
标签：细胞论文; 磁场论文; 浓度论文; 骨骼肌论文; 细胞内论文; 磁场强度论文; 荧光论文; 《临床医学教育》2018年7期论文;