武胜勇
第二军医大学 200433
【摘 要】目的：筛选肝纤维化相关microRNA，并试分析其功能。方法：制备模型大鼠与正常大鼠，取肝活组织，提取RNA，进行RNA筛选与表达量分析，并测定行CoL-1、CTGF、TIMP-1 水平，并进行相关性分析。结果：正常大鼠239 个MicroRNA 片段，肝纤维化模型大鼠250 个，相交片段212 个，其中9 个存在较大变化，microRNA-138 上调表达差异倍数达3.843123；正常组与模型组MicroRNA-138 表达量与CoL-1、CTGF、TIMP-1 水平差异具有统计学意义（P＜0.0），且存在相关性。结论：microRNA-138 可能具有抑制肝纤维化作用。
【关键词】肝纤维化；microRNA；调控
【中图分类号】R331.3+6【文献标识码】A【文章编号】1276-7808（2015）-06-499-01
肝纤维化是指各类损伤因素反复刺激性发生的肝脏病理改变，是各类肝病常见临床表现，具有不可逆性，可进展为肝硬化、肝癌。MicroRNA 是一类小分子非编码RNA，参与调控各类细胞生长、分化、凋亡等，研究证实其在肝纤维化发生、进展过程中发挥重要作用。本次研究试筛选肝纤维化相关microRNA，并探讨其在肝纤维化中发挥的功能，以供借鉴。
1 资料及方法
1.1 研究对象
取健康清洁级雄性大鼠40 只，3～4 周、体重（150±10）g，常规试验，正常食水。
1.2 仪器与试剂
猪血清、10%水合氯醛、4%多聚甲醛、无水乙醇、中性树胶、TRIzolR RNA 提取试剂盒，CR 型高速冷冻离心机、制冰机、4℃冰箱、低温冰箱、酶标仪、台式离心机、石蜡切片机、PV 扫描仪、，PCR 扩增仪IHi-Seq2000 高通量测序仪、超净工作台等。
1.3 方法
1.3.1 实验一
参照陈述所给出方法，制备肝纤维化模型大鼠。分别取5 份正常大鼠肝组织、5 份模型大鼠肝组织，提取RNA。主要步骤：①-80℃冰箱留存，分批取出；②液氮处理，碾碎，预称重，定量组织100mg，置入离心管；③加入1.5mlTRIZOL，摇匀，室温放置5min，加入0.3ml氯仿，混匀15s，留置2-3min，12000r/min 离心，15min，取上清液0.8m；④加入0.7ml 异丙醇，室温静置10min，10000r/min，持续10min，弃上企业，加入75%乙醇1.4ml，7000r/min，5min，弃上清液，干燥5min，100mlDEPC 灭菌处理，-70℃保存，留用。RNA 纯度分析：以infinite 酶标仪测定标本，进行样品完整性检测、纯度分析，最后进行表达差异检测。表达定量分析采用去PCR 技术检测，77℃-60min 接着85℃-5min 反应条件逆转录，所得产物以灭菌水稀释后-20℃保存，以SDS RQ 7500 software V2.0 软件计算样本Ct。
1.3.2 实验二
取正常大鼠40 只、肝纤维化模型大鼠40 只的肝组织，参照实验一测定表达差异最大的MicroRNA-138 表达量，并进行CoL-1、CTGF、TIMP-1 水平，并进行相关性分析。
1.4 统计学处理
数据资料以SPSS18.0 软件处理。计量资料以均数±标准差（ x ±s）表示，若服从正太分布，组间比较采用t 检验，若不服从正太分布，组间比较采用非参数检验，相关性分析采用单因素相关性分析，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 MicroRNA 数目差异与表达差异
修剪低质量片段后，正常大鼠肝组织共获得704821 个片段，肝纤维化模型大鼠共获得795643 个片段，参考SOAP 比对程序，结果显示正常大鼠肝组织中3805343 个片段存在，肝纤维化模型大鼠中有3705440 个片段真实存在。再次对比寻找，正常大鼠肝样本中有239个MicroRNA 片段，肝纤维化模型大鼠中有250 个MicroRNA 片段，相交片段212 个，占前者88.70%，占后者84.80%。进行高通量检测，结果显示212 个相交MicroRNA 片段，有9 个存在较大变化，正常大鼠与肝纤维化模型大鼠表达量差异倍数＞2 倍，分别是-1、-30b-5p、-144、-451、-674-3p、-27a、-138、-146b、-342-5p，前5 个位下调表达，后5 个为上调表达，其中-138 上调表达十分显著，差异倍数为3.843123。
2.2 细胞因子表达
研究显示，正常组与模型组MicroRNA-138 表达量与CoL-1、CTGF、TIMP-1 水平差异具有统计学意义（P＜0.05）（见表1）。相关性分析，MicroRNA-138 表达量与CoL-1、CTGF、TIMP-1 水平均有相关性，r 分别为0.818、0.912、0.843、0.82，且P＜0.01，具有统计学意义（P＜0.05）。
3 讨论
研究显示，MicroRNA 可能为肝纤维化有关，相交片段212 个，中有9 个表达量差异倍数在2 倍以上，占4.25%，其中MicroRNA-138差异最为显著，其与人I 型胶原（CoL-1）、结缔组织生长因子（CTGF）、基质金属蛋白酶的组织抑制剂（ TIMP-1 ） 密切相关， 提示MicroRNA-138 上调，可能通过以上三种物质抑制肝纤维化，但具体作用机制尚有待深入研究。
参考文献：
[1]王晓军，张荣珍，胡苑笙，等.我国病毒性肝炎流行现状研究[J].疾病监测2004，19（8）：290-292.
[2]陈超.肝纤维化化相关microRNA 的筛选及其功能研究[D].上海：第二军医大学，2012.
论文作者:武胜勇
论文发表刊物:《世界复合医学》2015年第6期供稿
论文发表时间:2015/7/24
标签：大鼠论文; 肝纤维化论文; 片段论文; 差异论文; 模型论文; 相关性论文; 组织论文; 《世界复合医学》2015年第6期供稿论文;