[摘要] 目的：对沙门菌检测方法作改进，使之更适用于突发公共卫生事件检测。方法：在分离培养方法中加入RT-PCR检测方法，两种方法结合使用。结果：改进后方法与分离培养法结果完全符合，检测限800cfu/mL，纯培养物RT-PCR检测比混合样本效果好，避免假阳性。结论：改进后的方法在突发公共卫生事件检测中能较快速区分沙门菌，节约检测时间，节省人力，对菌的鉴定有针对性。
[关键词] 沙门菌 突发公共卫生事件 RT-PCR
沙门菌是一种重要的食源性致病菌，引起的突发公共卫生事件常有报道，据资料统计，在我国细菌性食物中毒中，70%～80%是由沙门菌引起。沙门菌菌型繁多，迄今已发现有2500多种血清型，至2007年，我国检出的血清型至少在322个以上[1]，而其中的伤寒、副伤寒沙门菌已成为全国重点关注的病原菌。
时至今日，沙门菌的检测方法多种多样，主要有传统的分离培养方法，分子鉴定方法，免疫学检测法等，各有其优缺点[2]，在不同的实际情况下需选择合适的检测方法以达到预期目的。笔者在去年的伤寒突发公共卫生事件中对沙门菌检测方法略作改进，收到了满意的效果，报告如下。
1 材料与方法
1.1 样本来源：突发公共卫生事件中采集的水，食品，蔬菜，病例、疑似病例及接触人群的粪便或肛拭。
1.2 主要培养基及试剂：亚硒酸盐增菌液（SC），沙门菌显色培养基（科玛嘉），双糖铁琼脂（KIA），沙门菌诊断血清（宁波天润），沙门菌志贺菌荧光PCR联检试剂（硕世生物）。所有试剂及培养基均在有效期内使用。
1.3 检测方法
1.3.1 环境固体样本参照GB 4789.4-2010中沙门氏菌检验方法[3]，25g样本加至225mL BPW，均质，36±1℃培养18h，取1 mL转种SC，于36±1℃培养18～24h，划种沙门菌显色培养基，36±1℃培养18～24h，挑取可疑菌落接种KIA。可疑培养物用实时荧光PCR（RT-PCR）检测，阳性者按照分离培养程序检测。
1.3.2 水样：500 mL抽滤，取滤膜加入适量SC 36±1℃培养18～24h，划种沙门菌显色培养基，36±1℃培养18～24h，挑取可疑菌落接种KIA。可疑培养物用实时荧光PCR（RT-PCR）检测，阳性者按照分离培养程序检测。
1.3.3 粪便或肛拭样本参照文献[4]方法，取适量样本于3 mL SC中36±1℃培养18～24h，划种沙门菌显色培养基，36±1℃培养18～24h，挑取可疑菌落接种KIA。可疑培养物用实时荧光PCR（RT-PCR）检测，阳性者按照分离培养程序检测。
1.3.4 裂解方法。取KIA上培养物用生理盐水悬浮至浊度0.5Mc左右，12000rpm离心3min，弃上清，加入50?L裂解液混匀，于金属浴100℃10min，12000rpm离心3min，上清即模板。
1.3.5 RT-PCR按试剂盒说明书操作。反应体系25?L，40循环，FAM通道收集荧光信号，Threshold值38。
1.3.6 菌落计数方法按GB 4789.2-2010中菌落总数测定方法检测[5]。1 mL样液加入营养琼脂36±1℃培养18～24h，计数菌落。
2 结果
2.1 取沙门菌纯培养物用生理盐水悬浮至浊度0.5Mc，10倍倍比稀释，得10-1～10-8稀释菌液，各稀释度菌液计数结果见表1。
表1 各稀释度菌液计数结果
2.3 将10个未知SC培养物各取2滴混合成一个样本用RT-PCR检测，结果见图1。
图2 纯培养物RT-PCR检测结果
3 讨论
3.1 突发公共卫生事件中对样本检测的要求较高，样本量大，要求检测速度快，需要大量的专业技术人员，以便及时为流行病预防、控制提供依据。传统的分离培养法耗时长，筛选目标菌困难，对专业技术人员要求高，造成工作量的成倍增加。因为RT-PCR的敏感性较高，在中途引入RT-PCR检测方法能较快速区分是否沙门菌，节约检测时间，节省人力，对菌的鉴定更有针对性。
3.2 有报道[4]提出将20份样本混合作一份样本用RT-PCR检测，以提高检测速度。笔者认为该方法对于健康性检查较适用，但不适用于突发公共卫生事件检测，原因有二。一、20份样本混合后，理论上每份样本均被稀释了20倍，如果考虑了加样误差，有些样本的稀释度会更高，对于含菌量较少的样本会造成漏检（假阴性结果）。RT-PCR方法的敏感性高，但也有限度。由结果2.1、2.2可知，沙门菌用RT-PCR方法检测，检出限在800cfu/mL左右，样本中菌量低于该值时用RT-PCR难以检出。二、混合后的样本对增菌液的要求较高，其中不能含有荧光物质，增菌液培养物经富集后易产生假阳性，见结果2.3，其机理尚不清楚。分离到纯培养及鉴定至种仍然是沙门菌检测的金标准[6]。在突发公共卫生事件的检测中首先获得纯培养，再由RT-PCR快速区分，可以避免假阳性，见结果2.4，与分离鉴定的结果完全符合。
3.3 对于疾病预防控制机构来说，沙门菌的检测已形成了完整的体系。随着新方法、新技术的开发、应用，更快速、更准确的方法不断更新，并逐渐应用于实践。有报道用等温扩增的方法检测沙门菌[7]，具有速度快、特异性好、灵敏度高、操作简便、成本低等优点，其优势甚至超过PCR或RT-PCR，但目前未普及，假以时日，亦可同理引入突发公共卫生事件的检测，更好的为保障人民群众的健康服务。
参考文献
[1] 朱超，许学斌. 沙门菌属血清型诊断. 上海：同济大学出版社. 2009：140.
[2] 王杰，陈颖钰，彭清洁等. 沙门菌检测方法研究进展. 动物医学进展，2016；37（4）：94-98
[3] GB 4789.4-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验.
[4] 韩毅，孙燕萍，周虹等. 实时荧光定量PCR法与分离培养法检测食品从业人员沙门菌和志贺菌的比较研究. 中国食品卫生杂志，2015；27（2）：132-135.
[5] GB 4789.2-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定.
[6] ISO 6579：2007. Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection of Salmonella spp.
[7] 吴家林，沙丹，马广源等. 沙门氏菌LAMP检测方法的建立. 中国病原生物学杂志，2015；10（7）：611-614.
论文作者:张宏宾,,刘晓骏,,高海英
论文发表刊物:《医师在线》2017年11月上第21期
论文发表时间:2018/2/4
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