张建伟[1]2001年在《糖基化终产物对内皮细胞RAGE基因转录调控的影响及其信号转导的探讨》文中研究指明糖尿病是临床上的一种常见病和多发病，其血管并发症是糖尿病的主要致残和致死原因。流行病学调查资料表明，糖尿病患者发生动脉粥样硬化及危及生命的心血管并发症的危险性较常人增加3～4倍，有70％～80％的糖尿病病人死于心血管并发症。但是在糖尿病状态下，血管内皮细胞的功能紊乱和损伤是如何启始和发展的，是倍受人们关注的问题。高级糖基化终产物(advanced glycation end-products，AGEs)是在长期的高血糖环境下葡萄糖与蛋白质和脂质发生的非酶糖基化而形成的不可逆的毒性产物；糖基化产物在组织内过量堆积不但直接引起组织结构以及功能的改变，而且还可通过与其受体(receptor for AGEs，RAGE)相互作用引起细胞的功能紊乱和损伤。近年来研究发现，AGEs和RAGE往往同时出现在糖尿病动脉粥样硬化的斑块中和阻塞性血管局部。RAGE存在于血管内皮细胞、平滑肌细胞和单核吞噬细胞等细胞表面，属于免疫球蛋白超家族成员，在介导AGEs引起的细胞功能紊乱和损伤中起重要的作用。目前人们对RAGE表达调控的分子机制了解甚少，AGEs是通过何种信号转导通路诱导内皮细胞RAGE基因表达的；何种顺式调控元件和反式作用因子在AGEs诱导的内皮细胞RAGE基因转录调控中起作用，尚不明了。为了深入了解糖尿病AGEs对RAGE的诱导表达，以及它们的相互作用对血管内皮细胞损伤的分子机制，并为寻找阻断和减弱AGEs-RAGE的作用途径的新措施提供实验依据。本研究进行了以下几方面的研究工作： 一、糖基化终产物与内皮细胞RAGE基因转录表达的关系 1．糖尿病大鼠心血管组织糖基化终产物的形成与其受体表达的关系： 本实验探讨了AGEs在糖尿病大鼠心血管组织内的形成量与RAGE基因和细胞间
游捷[2]2006年在《晚期糖化终产物受体在炎症性血管损伤中的作用》文中研究指明已有研究资料表明炎症性血管损伤是动脉粥样硬化性心血管疾病(CVD)和2型糖尿病的共同病理过程,但是炎症性血管损伤的机制至今仍不十分清楚。近年研究发现晚期糖化终产物受体(RAGE)与炎症性血管损伤有关,本研究应用反义RNA和基因芯片等技术进一步探讨RAGE在炎症性血管损伤中的作用及其机制,寻找与RAGE作用相关的基因,为防治炎症性血管损伤提供理论依据和实验基础。一、糖尿病人外周血单核细胞RAGE的表达及其与血清炎症因子的关系应用流式细胞术(FCM)检测糖尿病患者外周血单核细胞RAGE蛋白的表达,分析RAGE水平与血清炎症因子的关系。结果显示2型糖尿病患者外周血单核细胞RAGE的蛋白表达率为54.7%±8.9%,较正常对照组明显增加( P<0.05 )。直线相关分析显示RAGE蛋白表达率与TNF-α(r=0.43, P<0.01)和IL-6(r=0.30, P<0.05)呈正相关。多元逐步回归分析示TNF-α(P =0.025)和糖基化血红蛋白(P =0.0078)为影响RAGE蛋白表达率的显着因素。二、RAGE、PDGF-β在SD大鼠颈动脉球囊损伤后内膜中的表达建立SD大鼠颈动脉球囊损伤模型,检测RAGE、PDGF-β在颈动脉球囊损伤后内膜中的表达,并应用腺相关病毒介导的大鼠RAGE反义RNA局部处理观察RAGE在炎症性血管损伤中的作用。结果显示大鼠颈动脉球囊损伤后14 d后新生内膜组织中RAGE、PDGF-β表达明显增强(P<0.01 )。成功构建了大鼠RAGE反义RNA腺相关病毒表达载体,并获得8.7×10~7个病毒颗粒/ mL的病毒原液。应用体外动脉环培养,发现在感染RAGE反义RNA腺相关病毒的颈动脉球囊损伤后内膜中RAGE的表达下降,同时PDGF-β的表达也下降( P<0.05 )。叁、RAGE的表达水平对ECV304细胞分泌炎症因子功能的影响应用FCM和RT-PCR检测晚期糖化终产物(AGEs)对ECV304细胞RAGE表达的影响,结果显示不同浓度的AGEs作用ECV304细胞24 h,RAGE的mRNA和蛋白表达较未刺激前明显增加(P<0.05-0.01)。应用基因重组技术构建人RAGE反义RNA真核表达载体,脂质体介导转染入ECV304细胞,经抗性基因筛选阳性克隆,FCM鉴定,建立低表达RAGE的ECV304细胞克隆。结果显示转染RAGE反义RNA的细胞克隆中RAGE表达被抑制58.2%±7.1%。RAGE反义RNA减轻AGEs刺激ECV304细胞分泌TNF-α、IL-6( P<0.05 )。四、转染RAGE反义RNA对ECV304细胞基因表达谱的影响应用Affymetrix公司生产的人类基因表达谱芯片检测转染RAGE反义RNA对ECV304细胞基因表达谱的影响,并验证部分基因芯片结果。结果显示在RAGE高表达的细胞中表达上调达2倍的有245个基因,表达下调达2倍的有186个基因。结合生物学功能分析显示RAGE的下游基因中与炎症反应相关的基因如整合素β1(ITGB1)、基质金属蛋白酶3(MMP3)、凝血酶敏感蛋白-1(THBS1)、前列腺素G/H合成酶即环氧化酶(PTGS2)等明显上调。信号转导有关的信号分子,如磷脂酶Cβ1( PLCβ1)、磷脂酶Cβ4(PLCβ4)、钙调素依赖性蛋白激酶IV(CAMK IV )等基因明显上调。基因芯片结果显示多种转录因子基因表达上调及许多变化显着的未知功能基因、表达序列标签(EST)。五、磷脂酶C、钙调素依赖性蛋白激酶Ⅳ在RAGE胞内信号转导途径中的作用在基因芯片研究基础上,利用磷脂酶C(PLC)抑制剂研究PLC在AGEs-RAGE通路引起ECV304细胞胞浆游离钙浓度改变中的作用,结果显示PLC抑制剂抑制RAGE介导的细胞内游离Ca2+增加( P<0.05 )。构建显性负突变的CAMK IV(DN- CaMK IV)载体,利用NF-κB荧光素酶报告基因研究CaMK IV在RAGE激活NF-κB胞内信号转导途径中的作用,结果显示高表达CAMK IV增强RAGE诱导的NF-κB的活化,DN-CAMK IV部分抑制RAGE诱导的NF-κB的活化( P<0.05 )。本研究结果证实RAGE可能通过诱导炎症相关因子的分泌而在炎症性血管损伤中发挥重要作用,并首次发现PLC、CAMK IV是RAGE胞内信号转导途径的重要分子。
马丽[3]2007年在《葡萄籽原花青素对内皮细胞直接作用及对糖基化损伤内皮细胞的影响》文中指出第一部分葡萄籽原花青素对内皮细胞的直接作用背景：动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是危害人体生命健康最严重的疾病之一，会造成血管舒缩性降低、管腔变窄甚至阻塞以及血栓形成等病理改变，导致各种急性心血管事件的发生。血管内皮损伤和功能障碍与动脉硬化的发生发展关系密切，它是动脉粥样硬化的始动环节，是多种心血管疾病产生和恶化的基础。葡萄籽原花青素(grape seed procyanidin，GPC)是从葡萄籽中提取出来的一类多酚化合物，它具有极强的抗氧化等活性，因此被称为天然的抗氧化剂。但有研究报道，许多抗氧化剂同时也表现为促氧化作用，从而损伤机体。我们的研究通过不同浓度GPC作用体外培养的人脐静脉内皮细胞株(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)不同时间，观察GPC对HUVEC的作用，旨在探讨GPC对内皮细胞造成损伤的浓度范围以及时间范围，为临床的应用提供实验依据。目的：不同浓度GPC作用HUVEC不同时间，观察(1)四甲基偶氮唑盐法(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)检测GPC对HUVEC增殖活力的影响；(2)ELISA法测定培养液中内皮细胞损伤标志物血管性假血友病因子(Von Willebrand factor，vWF)的生成量，研究高浓度GPC对HUVEC的损伤作用；(3)硝酸还原酶法测定培养液中一氧化氮(nitric oxide，NO)的含量。方法：采用体外培养人脐静脉内皮细胞株(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)，以不同浓度的GPC(10mg/l、50mg/l、100mg/l、200mg/l、400mg/l、800mg/l)培养细胞。分别于12h、24h、48h末用MTT法(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)检测内皮细胞的增殖活力，ELISA法测定培养液中内皮细胞损伤标志物血管性假血友病因子(Von Willebrand factor，vWF)及硝酸还原酶法测定培养液中一氧化氮(nitric oxide，NO)的含量。结果：1．GPC作用12h时，随着GPC浓度增大，细胞增殖力逐渐增加，在浓度为200mg/l时增殖作用最强，增殖率为162.47％。400mg/l和800mg/l浓度组的增殖率有所下降，但仍然显着高于空白对照组。各浓度组的vWF生成量均小于空白对照组，差异有显着性(P＜0.01)。各干预组的NO生成量也均较空白对照组增多，除10mg/l组外，其余各组差异均有显着性(P＜0.01)。2．作用24h时，10mg/l～100mg/l浓度范围内的GPC对内皮细胞的增殖活性具有促进作用，GPC浓度为100mg/l时增殖活力最强，为1.39±0.03。10mg/l～100mg/l亚组vWF生成量较空白对照组明显降低，而200mg/l～800mg/l亚组vWF量增加。100mg/lGPC组NO生成量达到最大量，200mg/l、400mg/l组随着GPC浓度的增大NO逐渐减少，但仍高于空白对照组，800mg/l组NO量低于空白对照组，差别无显着性(P＞0.05)。3．作用48h时，GPC为10mg/l时细胞生存活力为1.38±0.03，以后随着GPC浓度增加存活力逐渐降低。10mg/l组vWF含量低于空白对照组，而50mg/l～800mg/l五组培养液中vWF含量均较空白对照组明显增多。NO生成量在10mg/l组为40.24±4.54，以后随着GPC浓度的增大，NO量逐渐减少，均低于空白对照组(p＜0.05)。结论：GPC在一定浓度范围、一定作用时间内可以促进内皮细胞增殖；高浓度的GPC抑制内皮细胞生长，对内皮细胞有损伤作用，使内皮细胞NO生成减少。第二部分葡萄籽原花青素对糖基化损伤内皮细胞保护作用及其可能分子学机制背景：糖尿病是一种慢性终身性疾病，并累及多数脏器，已成为仅次于脑血管和肿瘤之后的第叁位常见病、多发病。随着对糖尿病研究的不断深入，人们已逐渐认识到糖尿病的本质是血管病变。1999年，美国心脏学会提出，糖尿病是一种心血管疾病。目前，大血管病变是糖尿病患者死亡的主要原因。糖尿病死亡的病因，占第1位的是AS为主体的病变。糖尿病患者的AS的发生率是非糖尿病患者的2-3倍。与非糖尿病患者相比，糖尿病患者的动脉硬化发病较早、发展较快、病情较重、病死率高。糖尿病高血糖状态下，体内蛋白质非酶糖基化通路被激活，产生的大量糖基化终产物(advanced glycation end products，AGEs)可导致内皮细胞损伤，使内皮细胞功能发生紊乱，进而引起许多病理生理学改变。AGEs可以通过与特异性受体—糖基化终产物受体(Receptor for advanced glycation end products，RAGE)相互作用形成AGE-RAGE系统在糖尿病血管并发症的发生、发展过程中起着重要作用。原花青素(proanthocyanidin或procyanidin，PC)是植物中广泛存在的具有抗氧化作用的一大类多酚化合物的总称，属于生物类黄酮大家族中的一员。在美国1995年末的自由投票选举中，原花青素被认为是最受美国公众青睐、并风靡美国草药市场的植物药。四十多年来人们对从众多不同植物中提取出的PC进行了大量的研究。其中又因葡萄籽中原花青素(GPC)的含量极高而得到了最为深入和广泛的关注。血管内皮损伤、功能障碍是AS发生的始动环节。因此，保护血管内皮细胞是防治糖尿病动脉粥样硬化的基础环节。我们已证实GPC能够抑制糖尿病大鼠体内非酶糖基化反应，减少肾皮质AGEs。但GPC对糖基化损伤内皮细胞是否有保护作用，国内外未见相关报道。本研究采用体外培养人脐静脉内皮细胞方法，测定细胞增殖活性、细胞损伤标志物vWF生成量及RAGE、PPARγ蛋白表达情况，了解GPC对AGEs损伤内皮细胞的作用，探讨其可能的分子学机制。目的：不同浓度葡萄籽原花青素(GPC)和糖基化终产物(advanced glycation end products，AGEs)同时作用HUVEC，观察(1)MTT法检测HUVEC增殖活力；(2)ELISA法测定培养液中vWF的生成量，研究GPC对HUVEC糖基化损伤的保护作用；(3)western blot法检测内皮细胞糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products，RAGE)的表达；(4)western blot法检测过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptorγ，PPARγ)蛋白表达水平。方法：体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，糖孵育法制备糖基化终产物修饰牛血清白蛋白(AGEs-BSA)。实验分为六组：①正常对照组(control)：无血清培养基培养24h；②试验对照组(BSA组)：200mg/l BSA培养24h；③AGEs组：200mg/l AGEs作用24h；④GPC(低剂量)+AGEs组：10mg/l GPC预处理细胞4h后，加入200mg/l AGEs培养24h；⑤GPC(中剂量)+AGEs组：50mg/l GPC预处理细胞4h后，加入200mg/l AGEs培养24h；⑥GPC(高剂量)+AGEs组：100mg/l GPC预处理细胞4h后，加入200mg/l AGEs培养24h。采用MTT比色法检测细胞生存活力；ELISA法测定培养液中vWF；western blot法检测内皮细胞糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products，RAGE)和过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptorγ，PPARγ)蛋白表达水平。结果：AGEs抑制HUVEC生存活力，细胞增殖活力下降为正常组的90.53％，不同浓度GPC预处理组的细胞生存活力逐渐增加，分别为正常组的0.95倍，1.12倍，1.23倍；AGEs组的vWF生成量较正常对照组明显增加(p＜0.01)，GPC预孵育可显着降低vWF水平；AGEs减少PPARγ的表达，增加RAGE的蛋白表达。GPC预处理组的PPARγ受体表达水平增加，而RAGE的表达逐渐减少。结论：AGEs会损伤内皮细胞，GPC可抑制AGEs对内皮细胞的损伤作用，并呈浓度依赖性。GPC保护内皮细胞免受糖基化损伤的作用可能通过减少RAGE表达，上调PPARγ蛋白表达这一信号转导途径来实现的。
相田园[4]2016年在《中药有效组分配伍调控p38MAPK通路改善糖尿病心肌病的机理研究》文中研究说明糖尿病心肌病(Diabetic Cardiomyopathy, DCM)是一种独立的心肌疾病,每年约有2%-3%的糖尿病患者并发心血管病变。调查研究显示：65-74岁老年组的糖尿病患者,每年因并发心肌病而致死的男性、女性分别为4.9%、3.2%,而非糖尿病患者分别为1.9%、0.9%,两组存在显着的差异。随着DCM病程的进展,患者发生心衰和再梗死的风险增高,预后也很差,高患病率、致残率、病死率等也导致患者身心健康受到严重的损害,为个人和社会带来沉重的负担。据WHO报道,2010年全世界防治糖尿病的医疗卫生费用高达11.6%,2005-2015年中国用于糖尿病及相关血管疾病防治的费用达到5577亿美元。DCM发病机制复杂,涉及晚期糖基化终末产物途径、氧化应激损伤、脂质代谢紊乱、炎症反应、心肌细胞代谢障碍、心肌微血.管病变、自主神经病变等多个方面。目前缺乏明确的诊断标准,医师需要结合患者的临床症状、实验室检测、影像学检查、心肌活检等方法,在排除冠状动脉粥样硬化性心脏病、心脏瓣膜病、高血压及其它心肌病的基础上做出综合判断。其临床特征,早期主要以心脏舒张功能不全为主、易发生充血性心力衰竭；后期出现心脏收缩功能不全、心律失常、心肌广泛性坏死灶,最终进展为心源性休克、心力衰竭,重症患者甚至猝死。病理切片显示：内皮及内皮下纤维增生、基膜增厚、弥漫性心肌壁内微血管病变、毛细血管密度降低、心肌肥厚等。鉴于DCM对于患者和社会造成的巨大危害,探索其发病机制,找到有效的治疗方法成为科研工作者亟待解决的问题。西医治疗主要是对症治疗为主,辅以纠正代谢紊乱,延缓心律失常、心肌梗死、心衰及其他心血管并发症的发生。治疗方面,一是强化控制血糖的治疗；二是调脂治疗,改善脂质代谢紊乱。叁是RASS拮抗剂的应用,如ACEI、ARB及利尿剂在不同的位点阻断RASS系统,不但起到了抑制心肌重构的作用,而且在改善心肌纤维化方面也有重要的意义。四是应用蛋白非酶糖基化的阻滞剂；五是改善心功能不全、心律失常、心衰等症状的药物和非药物治疗。中医理论认为本病气阴不足为本,瘀血阻络为标,各医家临床辨证论治依此为基础,思路见仁见智,或辨证结合辨病；或辨病论治,以一方为主,随证加减；或以其中一种治法为主,随证加减用药。近年逐渐进行深入的临床和基础研究,如中药验方、复方制剂、单味中药及其提取物、天然药物研发等,逐步改善患者的症状并提高生存质量,综合治疗仍然是基本原则。中药有效组分配伍(简称中药组分)具有多靶效应、便于定量分析、整体治疗的优势,为有效治疗DCM提供了新的思路。目的 本研究在既往研究中药组分(40%麦冬多糖、30%黄连生物碱、30%叁七总皂苷)能够干预蛋白非酶糖基化的基础上,进一步观察其对DCM兔血糖相关指标：GIU、FBG、GHB、GSP、INS、IRI、FRA、AR;血脂相关指标TC、TG、HDL-C、 LDL-C;肝肾功能指标：ALT、AST、Sci、BUN;氧化应激相关指标：AGEs、NO、 MDA、SOD、GSH-Px;炎症反应相关指标：hs-CRP、IL-6、TNF-α、TGF-β1、bFGF、 PDGF、ICAM-1、VCAM-1、PAI-1、ET;凋亡相关指标：Caspase-3、bcl-2、AI;以及TGF-β1-p38MAPK-CREB信号转导通路的蛋白表达的影响；从而探讨中药组分对p38MAPK信号转导通路调控下心肌组织细胞增殖、分化、凋亡的影响,为其治疗糖尿病心肌病的可能作用机制及新靶点提供依据。方法实验用兔70只,按随机数字表选取10只作为空白对照组,喂养普通饲料,第4周末,耳缘静脉推注0.9%氯化钠注射液5ml,再普通饲料喂养8周。其余60只大兔喂养含2%胆固醇、0.5%胆酸和5%猪油的高脂饲料30g/(kg·d),第4周末禁食8小时,造模前称取体重,按照100mg/kgBW剂量,耳缘静脉推注0.9%氯化钠注射液配制的5%四氧嘧啶。第8周测空腹血糖(FBG),选取叁次均在16.7mmol/L-23.5mmol/L大兔,不符合上述FBG标准者剔除,继续高脂饲料喂养4周。第12周末,随机选取空白对照组大兔1只,造模组大兔2只麻醉后取材,观察心肌病理组织显示：与空白组比较,造模组大兔心肌细胞肿胀变性,水肿明显,细胞质内形成大量的空泡,心肌间质纤维结构紊乱,细胞间界限不清,间隙增宽,血管周围基质增多,间质出现炎性细胞浸润、核裂解、固缩以及核丢失现象,表明糖尿病心肌病模型已经建立。造模成功50只大兔,按照空腹血糖水平、体重均衡原则分组为：①模型对照组10只②中药组分高剂量组10只③中药组分中剂量组10只④中药组分低剂量组10只⑤辛伐他汀对照组10只。第13周实验各组开始灌胃,用开口器撑开兔口,插入小儿胃管,检测进入胃部。具体剂量为：中药组分高剂量组450mg/(kg·d)、中药组分中剂量组150mg/(kg·d)、中药组分低剂量组50mg/(kg·d);辛伐他汀组0.8mg/(kg·d);空白对照组及模型对照组以10ml/(kg·d)生理盐水灌胃；2/日,连续上述药物灌胃8周。第20周末,取材前禁食不禁水12小时,5%戊巴比妥钠3ml/kg麻醉后取材。抽取腹主动脉血3-5ml,以Fresco离心机离心标本,3000r/m,15min,分离血清；摘取心脏,取部分左心室组织,用10%中性甲醛溶液固定,乙醇脱水,石蜡包埋,常规的切片操作,厚度为4um；剩余左心室组织,生理盐水冲洗,锡纸包裹,放入液氮速冻3min,放入-70℃冰箱备用。应用比色法测定血清中GLU、FBG、GHB、GSP、NO、NOS、MDA、SOD、 GSH-Px、TC、TG、HDL-C、LDL-C、FRA含量；放射免疫法测定INS含量；ELISA法测定血清中AGEs、ET、hs-CRP、IL-6、TNF-α、TGF-β1、bFGF、PDGF、PAI-1、 AR、ICAM-1、VCAM-1及心肌组织中Caspase-3、bcl-2含量。Western blotting法测心肌组织中TGF-β1-p38MAPK-CREB信号转导通路中相关蛋白的表达。HE染色后光镜下观察心肌细胞组织形态学、病理学改变。TUNEL法检测心肌组织细胞凋亡并进行凝胶图像。结果(1)四氧嘧啶静脉注射配合高脂饲料喂养诱导的大兔,第4周造模,第8周时空腹血糖平均为18.0mmol/L,显着高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.01),表明糖尿病模型建立。造模后继续配合高脂饲料喂养,第12周时造模组大兔心肌组织病理切片显示,细胞质内有大量的空泡形成,细胞肿胀,炎性细胞浸润、核裂解、固缩以及丢失,心肌间质纤维结构紊乱,基底膜增厚等,表明糖尿病心肌病模型已经建立。(2)中药组分对血糖相关指标的影响：第8周时造模组FBG显着升高,与空白对照组比较有显着差异(P<0.01)。灌胃给药后,第16周时高剂量组对DCM模型兔的FBG有降低作用,显着低于模型组(P<0.01)；第20周时,高、中、低剂量组对FBG均有降低作用,显着低于模型组(P<0.05)；而辛伐他汀组对DCM模型兔的FBG没有明显降低作用(P>0.05)。第20周进行糖负荷实验,以25%的葡萄糖(5g/kg)灌胃,分别检测0min、30mim、60min、120min、180min的血糖值,高、中剂量组对于灌胃糖负荷后30mim、60min、120min、180min血糖值均有降低作用,与模型组比较有显着的统计学差异(P<0.01);低剂量组对糖负荷后30min血糖有降低作用,与模型组比较有显着的统计学差异(P<0.05)。此外,高、中剂量组可明显降低GSP、AR、FRA、IRI、INS含量,与模型组比较,差异显着有统计学意义(P<0.05)。(3)中药组分对血脂相关指标的影响：造模后,模型组TC、TG、LDL-C均高于空白组,HDL-C低于于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。灌胃给药后,第20周时高、中剂量组及辛伐他汀组对TC、TG、 LDL-C均有降低作用,对HDL-C有升高作用,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；低剂量组降低了TC、LDL-C,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。(4)中药组分对氧化应激指标的影响：模型组AGEs、MDA、NO、NOS均高于空白组,SOD、GSH-Px低于空白组,差异有统计学意义(P<0.01)。灌胃给药后,第20周时高、中剂量组、辛伐他汀组对MDA、NO、NOS有降低作用,对SOD、GSH-Px有升高作用；此外高、中剂量组对AGEs有抑制作用,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)；低剂量组对NOS、AGEs有降低作用,对GSH-Px有升高作用,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。(5)中药组分对炎症反应相关指标的影响：模型组hs-CRP、IL-6、ET、PDGF、 ICAM-1、VCAM-1、PAI-1均高于空白组,bFGF低于空白组,差异有统计学意义(P<0.01)。灌胃给药后,第20周时高、中剂量组、辛伐他汀组对hs-CRP、IL-6、 ET、PDGF、ICAM-1、VCAM-1、PAI-1有降低作用,对bFGF有升高作用；此外高剂量组对TGF-β1、TNF-α有降低作用,而辛伐他汀组对TNF-α有降低作用,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；低剂量组对hs-CRP、VCAM-1、PAI-1有降低作用,对bFGF有升高作用,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。(6)中药组分对心肌组织TGF-β1、p-p38MAPK、p-CREB蛋白表达的影响：模型组TGF-β1、p-p38MAPK、p-CREB蛋白表达均高于空白对照组,有显着统计学差异(P<0.01)。灌胃给药后,第20周时中药组分高、中剂量组及辛伐他汀组对TGF-β1、p-p38MAPK、p-CREB蛋白表达均有抑制作用,与模型组比较,有显着统计学差异(P<0.01),其中对p-CREB蛋白表达抑制最为明显,治疗后与空白组比较,没有显着统计学差异((P>0.05)。低剂量组对p-p38MAPK、p-CREB蛋白表达有抑制作用,与模型组比较,有显着统计学差异(P<0.01),其中对p-CREB蛋白表达抑制更为明显,与空白组比较,没有显着统计学差异(P>0.05)。(7)中药组分对心肌组织病理的影响：模型组LVW、HW、H/W、LVWI均高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。灌胃给药后,第20周时高、中剂量组及辛伐他汀组对LVW、HW、H/W、LVWI有降低作用,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。模型组Caspase-3、AI均高于空白组,bcl-2低于空白组,差异有统计学意义(P<0.01)。中药组分高、中剂量组及辛伐他汀组对Caspase-3、AI有抑制作用,对bcl-2上调作用；低剂量组仅对bcl-2上调作用,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。(8)中药组分对体重的影响：造模成功后,第12周时分组,各组之间体重无明显差异(P>0.05),表明分组均衡；而与空白对照组比较体重下降,有显着差异(P<0.05)。灌胃给药后,第16周时高剂量组与模型组比较,体重上升,差异有统计学意义(P<0.05)。第20周时高、中剂量组及辛伐他汀组与模型组比较,体重明显上升,差异显着有统计学意义(P<0.01)。(9)中药组分对肝肾功相关指标影响：造模后,模型组ALT、AST、BUN、Scr均高于空白对照组(P<0.01)。灌胃给药后,第20周时高、中剂量组对ALT、AST、 BUN、Scr均有降低作用,显着低于模型组(P<0.01)；辛伐他汀组对BUN、Scr均有降低作用,与模型组比较有明显统计学差异(P<0.01)。结论(1)四氧嘧啶静脉注射配合高脂喂养诱导的大兔模型,造模后,第8周时造模组空腹血糖平均为18.0mmol/L,表明糖尿病模型建立。造模后继续配合高脂饲料喂养,第12周糖尿病心肌病模型建立。(2)中药配伍组分可明显降低FBG、GHB、GSP、AR、FRA含量,降低空腹血糖,改善糖耐量异常；降低IRI、INS含量,改善胰岛素抵抗。(3)中药配伍组分可降低TC、TG、LDL-C、升高HDL-C,调整血脂紊乱。(4)中药配伍组分可降低AGEs、MDA、NO、NOS、升高SOD、GSH-Px含量,改善氧化应激损伤。(5)中药配伍组分可降低降低hs-CRP、IL-6、TNF-α、ET、TGF-β1、PDGF、ICAM-1、VCAM-1、PAI-1,升高bFGF,缓解炎症反应。(6)中药组分通过调控p38MAPK/Caspase-3、bcl-2途径,有效抑制了心肌细胞凋亡；通过调控TGF-β1-p38MAPK-CREB信号转导通路,抑制了心肌组织异常细胞增殖、分化等的生物学效应,有效地缓解了心肌肥大、间质纤维化等病变的进程。(7)中药配伍组分减轻DCM兔全心重及左心室重量,可降低左心室重量指数及心体比。(8)中药配伍组分可明显增加DCM兔体重。(9)中药组分对ALT、AST、BUN、Scr均有降低作用。
王瑞青[5]2008年在《DM大鼠甲状腺组织超微结构和功能相关mRNA表达的变化及干预研究》文中指出目的：糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种由多因素引起的以慢性高血糖为特征的全身性代谢疾病,同时存在着胰岛素以外的多种内分泌异常。近年流行病学研究发现2型糖尿病患者甲状腺形态及功能异常发生率比正常人群高。终末糖基化产物(AGEs)-终末糖基化产物受体(RAGE)系统与慢性高血糖引起的多种并发症密切相关,但其与DM中甲状腺组织损伤的关系研究较少。氨基胍(aminoguanidine,AG)和胰岛素(insulin,INS)可以通过不同的途径阻断AGEs-RAGE系统的作用。本实验通过观察不同时期DM大鼠未干预组(DM)、DM大鼠AG干预组(DA)、DM大鼠胰岛素干预组(DI)及对照组(N)的甲状腺超微结构改变,检测甲状腺组织中糖毒性相关因子RAGEmRNA,以及甲状腺重要功能相关因子TSHR、NIS、TG、TPOmRNA的表达情况,探讨DM大鼠甲状腺组织结构和功能变化以及AG, INS的干预作用。方法：成年雄性wistar大鼠(210-255g)112只,随机分为两组：N组(25只)和T2DM实验组(87只)。N组给予普通饲料喂养,T2DM实验组给予高脂饲料喂养8周后以30mg/kg链脲佐菌鼠尾静脉注射造模。N组鼠尾静脉注射同等剂量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。72小时后实验组大鼠血糖均大于16.65mmol/L,造模成功。成模后将实验组大鼠随机分为DM组27只,DA组28只,DI组32只。DA组以50mg/kg.d的AG灌胃。DI组以6U/kg.d皮下注射精蛋白锌胰岛素。分别于成模后12周和20周处死各组大鼠,留取甲状腺组织①2.5%戊二醛1%锇酸溶液进行双重固定,以JEM100CXⅡ透射电镜摄片,观察甲状腺组织的超微病理结构。②液氮固定后采用半定量逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测甲状腺组织中RAGE、TSHR、NIS、TG、TPOmRNA的表达。结果：①实验结束时,DM组体重低于DA、DI、N叁组(p<0.01),后叁组间无统计学差异。DM、DA、DI叁组血糖均高于N组(p<0.01),DM组和DA组无统计学差异,二者均高于DI组(p<0.01)。②超微结构：DM组大鼠甲状腺组织表现为滤泡上皮细胞损伤。血管内皮细胞损伤,基底膜增厚,炎细胞浸润,纤维增生,损伤程度随病程延长而加重；DA组和DI组甲状腺组织超微结构较DM组有所改善；且DI组治疗效果好于DA组。③RT-PCR检测mRNA相对表达量：RAGE:DM组高于DI组、DA组、N组(p<0.01)；DA组低于DI组(12周p<0.05,20周p<0.01),与N组无统计学差异；DI组高于N组(p<0.01)。TSHR:12周：DM组高于DA组(p<0.01)、DI组(p<0.01)、N组(p<0.05)；DA组低于DI组(p=0.894),高于N组(p=0.239)；DI组高于N组(p=0.197)。NIS:DM组低于DA组(12周p<0.01,20周p=0.075)、DI组(12周p<0.01,20周p=0.969)、N组(12及20周p<0.01)；DA组低于DI组(12周及20周p=1.000)、N组(12周p=1.000,20周p=0.002)；DI组低于N组(12周p=1.000,20周p=0.155)。TG:20周：DM组低于DA组、DI组、N组(均p<0.01)；DA组高于DI组(p=0.751),低于N组(p=0.675),DI组低于N组(p=0.426)。TPO:DM组低于DA组(12周p<0.01,20周p=0.505)、DI组(p<0.01)、N组(p<0.01)；DA组低于DI组、N组(p<0.01)；DI组低于N组(p<0.01)。结论：①短期高脂饲料喂养配合一次尾静脉注射小剂量STZ可以成功制备T2DM大鼠模型。②DM组甲状腺超微结构损伤,显示功能低下。RAGEmRNA、TSHRmRNA表达增高,NISmRNA、TPOmRNA、TGmRNA表达均有所降低。提示RAGE表达增加可能与甲状腺受损有关。③DA组与DM组比较,甲状腺组织超微结构损伤减轻,甲状腺功能相关因子mRNA表达改善,RAGEmRNA表达减少,提示AG可以减少RAGE表达,减轻糖毒性导致的甲状腺组织损伤。④DI组与DM组比较,血糖明显降低,甲状腺组织超微结构受损减轻,功能相关因子mRNA表达改善,RAGEmRNA表达减少,提示补充胰岛素可以降低血糖,减少RAGE表达和活化,对糖毒性导致的甲状腺损伤具有保护作用。⑤DI组治疗效果较DA组好,而DI组RAGEmRNA表达较DA组高,显示胰岛素可能除存在抑制RAGEmRNA表达机制以外,还存在其他机制对糖尿病大鼠甲状腺产生保护。
郑锦花[6]2011年在《天然抗氧化物拮抗胰岛素抵抗的分子靶点筛选》文中研究表明糖尿病分子发病机理的进展涉及了近百种基因的转录与翻译水平表达及其生物学作用的异常,尤其值得注意的是氧化侵袭作为糖尿病及其合并症发生发展的核心机制一直是近年来糖尿病研究领域关注的前沿问题之一。糖尿病是由遗传因素与环境因素共同作用引起的慢性退行性疾病,从胰岛β细胞受损至糖尿病发作经过较长时间的潜临床状态。针对糖尿病发病的核心机制筛查抗氧化胰岛β细胞保护作用分子靶标,在糖尿病原始病因不清、发病率攀升不降的条件下可能对糖尿病的分子水平防治起关键作用。2型糖尿病占糖尿病的绝大多数,胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要环节。越来越多的资料证明,氧化应激产生的ROS作为一种信号分子一方面能激活胰岛β细胞内一系列应激信号通路,使胰岛β细胞发生氧化应激反应,从而导致胰岛β细胞损伤,胰岛素分泌减少;另一方面能损伤胰岛素信号转导通路,导致胰岛素抵抗。氧化应激引起的胰岛素抵抗信号转导通路:(1)氧化应激激活JNK、PKC和IKK,均可通过增加IRS307丝氨酸磷酸化,抑制该位点正常的酪氨酸磷酸化,导致胰岛素传导受阻;(2)IRS1的酪氨酸磷酸化被抑制后,PI3K-AKT通路受阻,胰岛素分泌减少,同时使胰岛素刺激的GLUT2从胞浆向胞膜转位减少,导致胰岛素抵抗。(3)氧化应激激活IKK,使NFκB获得活性进入胞核后,加重胰岛素抵抗,引起细胞凋亡。天然抗氧化物(NA)主要是指在体内具有清除自由基,防止氧化侵袭的多种微量元素、维生素和食物中的其它抗氧化物质。研究表明,NA对拮抗氧化侵袭、防治糖尿病有重要的作用。近年来有关NA抗氧化侵袭及防治糖尿病的研究取得了进展,已筛选出多种NA,如Se、VE、VC、硫辛酸、烟酰胺、大豆异黄酮等。目前认为其抗糖尿病机制有:(1)类胰岛素样作用或促进胰岛素释放;(2)清除自由基,抑制脂质过氧化,预防胰岛β细胞氧化损伤;(3)提高胰岛素的敏感性;(4)减少DNA损害或促进DNA修复,主要有烟酰胺和大豆异黄酮等,烟酰胺可以直接补充体内NAD池,促进DNA修复,可保证叁羧酸循环的正常进行,从而避免细胞死亡;大豆异黄酮有保护DNA免受氧化攻击的作用。目前国内外对天然抗氧化物胰岛β细胞保护作用以及拮抗胰岛素抵抗分子作用靶点尚不明确。本研究经过文献循证及课题长期研究的积累,优选出五种天然抗氧化物,即硒、维生素E、硫辛酸、烟酰胺和大豆异黄酮,重点观察其拮抗胰岛素抵抗作用的分子靶点、作用特点、生物学效应及分子机制。通过观察胰岛素抵抗信号转导通路相关转录因子和基因的转录与翻译水平的表达,阐述NA拮抗胰岛素抵抗的分子机制,提出其作用的分子靶点,本研究分叁部分。第一部分,进行大鼠胰岛β细胞株(INS1)氧化应激模型的改良研究和人HepG2细胞胰岛素抵抗模型的建立:用不同浓度H2O2在不同作用时间下诱导大鼠胰岛β细胞氧化应激,用流式细胞术等方法检测细胞增殖,ROS和MDA含量, SOD和GSH-PX活力;在氧化应激模型基础上,对硒、维生素E、硫辛酸、烟酰胺和大豆异黄酮的剂量和作用时间优化研究;通过转染人抵抗素基因(pcDNA3.1-human resistin)的HepG2细胞制备胰岛素抵抗肝细胞模型,是用以观察NA拮抗胰岛素抵抗分子机理的高水平细胞模型。第二部分,NA对氧化应激胰岛β细胞的细胞周期和凋亡影响的研究:用流式细胞术检测大鼠胰岛β细胞的细胞周期,观察其凋亡,用以说明NA是否有抗氧化胰岛β细胞保护作用,直接拮抗糖尿病关键中间环节即胰岛素相对或绝对不足。第叁部分,NA对胰岛素抵抗信号转导通路相关基因表达的影响:用半定量RT-PCR方法、实时定量PCR方法检测大鼠胰岛β细胞FOXO1、PDX1、MafA、insulin2、IRS1、GLUT2和AKT2基因的mRNA表达;用实时定量PCR方法检测人HepG2细胞JNK1、IRS1、PKC、PI3K、GLUT2基因的mRNA表达;用免疫细胞化学染色方法和Westernblot方法检测大鼠胰岛β细胞FOXO1、PDX1、NFκB、insulin2、IRS1、JNK1和AKT2基因的蛋白表达;用免疫细胞化学染色方法和Westernblot方法检测人HepG2细胞IRS1和JNK1基因的蛋白表达,阐述五种NA对上述基因表达的作用水平及作用靶点。本研究取得如下结果:1.成功地进行INS1细胞株氧化应激模型的改良及NA添加剂量与作用时间的优化研究。本研究证实了加入H2O2剂量为500μmol/L,作用时间为3h是诱导INS1细胞最佳氧化应激模型,抗氧化酶活力及自由基水平检测等方法均是提示该细胞模型成功的标志。在该氧化应激模型基础上,对联合应用抗氧化物的剂量和时间进行优化研究,筛选出0.1mg/L亚硒酸钠、5mg/L维生素E、10mg/L硫辛酸、122mg/L烟酰胺和0.432mg/L大豆异黄酮为NA的最佳剂量,作用时间为24h,可明显提高抗氧化生物学标志物,降低自由基生成。2.成功构建了pcDNA3.1-human resistin转染的HepG2细胞制备胰岛素抵抗模型。为了进一步证实NA对胰岛素抵抗信号转导通路的拮抗作用,我们根据国内外最近研究进展,应用重组基因工程技术,构建了pcDNA3.1-human resistin真核表达载体,脂质体介导转入HepG2细胞,率先建立了基于resistin基因转染的胰岛素抵抗细胞模型,葡萄糖摄取实验及糖原染色实验均证明该胰岛素抵抗细胞模型的成功,该模型为进一步研究NA对外周组织胰岛素抵抗的拮抗作用机制提供了先进的细胞模型。3.国内外率先在pcDNA3.1-human resistin转染的胰岛素抵抗细胞模型上,证实了NA可以拮抗resistin基因转染导致的胰岛素抵抗。其表现特点为,转染resistin的HepG2细胞葡萄糖摄取率明显降低,糖原合成显着下降;而添加不同种类的NA,可明显提高转染resistin的HepG2细胞的葡萄糖摄取率及糖原合成,显着逆转了resistin引起的胰岛素抵抗效应,由于resistin与胰岛素抵抗是新近关注的糖尿病研究领域热点问题之一,而且resistin引起胰岛素抵抗的主要环节通过胰岛素受体起作用,我们的结果首次证实了NA可能通过拮抗resistin作用的关键环节发挥作用,为提出NA拮抗胰岛素抵抗的关键靶点提供实验依据。4.证实了NA具有抗胰岛β细胞凋亡,促进胰岛β细胞增殖的保护作用。通过流式细胞术检测细胞周期结果表明,联合应用亚硒酸钠、维生素E、硫辛酸、烟酰胺和大豆异黄酮可使S期细胞显着增多,而G_0/G_1期细胞明显减少;流式细胞术检测细胞凋亡结果表明,联合应用NA可以使早期凋亡、晚期凋亡以及死亡细胞数目明显减少,提示NA有抗氧化胰岛β细胞保护作用,可以拮抗糖尿病关键中间环节。5.阐述了NA拮抗胰岛素抵抗信号转导通路的多分子靶点。在胰岛β细胞株氧化应激模型的基础上发现NA对胰岛素抵抗信号转导通路的主要转录因子和基因的表达具有调控作用。包括下调FOXO1的mRNA表达,可以上调PDX1、IRS1、insulin2、MafA、GLUT2以及AKT2的mRNA表达;可以下调FOXO1、NFκB和JNK1的蛋白表达,可以上调PDX1、IRS1、insulin2和AKT2的蛋白表达,证实了NA可以调控胰岛β细胞的胰岛素抵抗相关多分子靶点转录水平和翻译水平的表达,初步筛选出NA保护胰岛β细胞和拮抗胰岛素抵抗的分子靶点。6.进一步在转染人抵抗素基因HepG2细胞上阐述了NA拮抗胰岛素抵抗信号转导通路的多分子靶点。在氧化应激胰岛素抵抗信号转导通路的基础上,研究NA对该通路相关基因表达的影响。结果表明,NA可以下调JNK1和PKC的mRNA表达,可以上调IRS1、GLUT2的mRNA表达;可以下调JNK1的蛋白表达,可以上调IRS1的蛋白表达,进一步证实了NA可以调控外周组织的胰岛素抵抗相关分子靶点转录和翻译水平的表达,初步筛选出NA拮抗外周组织胰岛素抵抗的分子靶点。本研究通过探讨NA调控胰岛素抵抗信号转导通路相关转录因子和基因的表达以及改善胰岛β细胞胰岛素抵抗并保护胰岛β细胞分子作用机制,初步筛选出胰岛β细胞的FOXO1、NFκB、JNK1、PDX1、IRS1、insulin2、MafA、GLUT2和AKT2基因可能是NA保护胰岛β细胞、拮抗胰岛素抵抗的分子靶点,而在外周组织中NFκB、JNK1、PKC、GLUT2基因可能是NA拮抗胰岛素抵抗的分子靶点,上述靶点的发现为改善胰岛素抵抗以及营养学领域开展糖尿病的Ⅱ级人群预防提出分子靶标。
罗翊芝[7]2009年在《C-反应蛋白诱导晚期糖基化终产物受体表达的信号途径及其干预研究》文中研究表明【背景】:糖尿病是一种高花费、高致残、高死亡的疾病。其并发症已成为主要和日益严重的健康问题。心血管疾病是糖尿病患者致残、致死,并造成经济损失的主要原因。因心血管疾病而死亡的糖尿病患者中,冠心病约占一半。糖尿病动脉内皮细胞功能障碍、动脉内皮损伤,继之对血管损伤的反应提早发生和加速性动脉粥样硬化(accelerated atherosclerosis)是增加冠心病事件及导致死亡的重要原因。晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products, RAGE)在内皮功能紊乱中发挥重要作用,诱导多种黏附分子、炎症因子如细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)、E-选择素、单核细胞趋化蛋白-1 (monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)、内皮素-1(Endothelin-1, ET-1)表达升高。RAGE与配体结合后促使炎症细胞聚集、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)增殖、活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)生成增多,在加速性动脉粥样硬化发生、发展中起重要作用。在糖尿病相关模型的动脉粥样斑块中,晚期糖基化终产物(advanced glycation end products , AGEs)的沉积增高及RAGE表达升高。给予可溶性晚期糖基化终产物受体(soluble receptor for advanced glycation end products, sRAGE)后,斑块面积和复杂性下降,斑块变稳定。我们的前期研究发现炎症反应标记物C反应蛋白(C-reactive protein, CRP)诱导内皮细胞在mRNA及蛋白水平表达RAGE并促进MCP-1的过度生成,在加速性动脉粥样硬化的发生发展中起关键作用。在生理状态下,核转录因子κB (nuclear factor kappa B, NF-κB)与其抑制蛋白IκB结合以无活性的叁聚体形式存在于胞浆中。当细胞受到刺激IκB被降解然后解除对NF-κB的抑制作用,NF-κB迅速活化进入胞核孔体内发挥基因转录的调控作用。人RAGE基因启动子含2个NF-κB元件,RAGE下游信号包括NF-κB,提示RAGE本身存在一个自我调控的正反馈回路,当RAGE与其配体结合后激活NF-κB促发后效应同时,RAGE表达可以自我上调。CRP可以通过降解IκB-α使NF-κB活化,故本实验推测CRP通过激活NF-κB诱导RAGE的生成,并予以证明。过氧化物酶体增殖物激活受体α( peroxisome proliferator-activated receptor-α, PPARα)是核受体超家族成员之一,通过结合配体活化转录因子进而调控基因表达。PPARα激动剂是临床常用治疗脂质紊乱药物,具有抗动脉粥样硬化作用。PPARα激动剂可以抑制动脉粥样硬化斑块的形成,通过降低E-选择素,VCAM-1的表达、抑制ET-1表达、减少ROS的表达、增加内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)的表达量从而发挥其抗动脉粥样作用。WY14643也称为匹立尼酸,属于PPARα配体。研究报道WY14643可以抑制CRP诱导的内皮细胞MCP-1的过度表达。根据PPAα激动剂WY14643的抗炎抗动脉粥样硬化作用,我们推测WY14643可能可以抑制CRP诱导内皮细胞生成RAGE和MCP-1。因此目前研究主要目的为探讨CRP-RAGE-MCP-1轴的作用机制及WY14643的干预作用。【方法】:1.人脐静脉内皮细胞的体外原代培养及传代培养;2.利用流式细胞技术检测WY14643对内皮细胞表达RAGE蛋白的影响;3.利用RT-PCR检测WY14643对内皮细胞表达RAGE mRNA的影响;4.利用ELISA法检测CRP上调内皮细胞RAGE的表达是否通过NF-κB途径及WY14643对其影响;5.利用流式细胞技术检测CRP上调内皮细胞RAGE蛋白表达是非通过NF-κB途径及WY14643对其影响;6.利用RT-PCR检测CRP上调内皮细胞RAGE mRNA表达是非通过NF-κB途径及WY14643对其影响;7.利用ELISA方法检测CRP上调内皮细胞表达MCP-1是非通过NF-κB途径及WY14643对其影响。【结果】:1. WY14643对内皮细胞表达RAGE蛋白的影响(流式细胞技术)1)不同浓度WY14643作用内皮细胞24小时对RAGE蛋白表达的影响与对照组相比,加入WY14643 10μM即可见RAGE蛋白表达量下降(P<0.05),在WY14643 100μM时RAGE蛋白表达抑制更为明显(P<0.01),WY14643浓度为250μM时RAGE蛋白表达量最低(P<0.01)。2) 250μM WY14643作用内皮细胞不同时间对RAGE蛋白表达的影响WY14643组RAGE蛋白的量均低于对照组(P<0.01)。RAGE蛋白表达量在培养6小时即有下降,并在24小时达到最小值。2. WY14643对内皮细胞表达RAGE mRNA的影响(RT-PCR法)1)不同浓度WY14643作用内皮细胞24小时对RAGE mRNA表达的影响加入WY14643 10μM即可见RAGE mRNA表达量有所下降(P<0.05),WY14643 100μM对RAGE mRNA表达抑制更加明显(P<0.05),WY14643浓度为250μM时抑制RAGE mRNA表达最明显(P<0.05)。2) 250μM WY14643作用内皮细胞不同时间对RAGE mRNA表达的影响将250μM WY14643加入内皮细胞培养不同时间(6、12、24小时),发现WY14643组中目标基因PCR产量均低于对照组(P<0.05)。RAGE mRNA表达量在培养6小时即有下降,并在24小时达到最低值。3. CRP通过激活NF-κB诱导内皮细胞表达RAGE,并可被WY14643抑制(流式细胞技术,RT-PCR法,ELISA法)1)流式细胞技术检测RAGE蛋白表达与对照组相比,CRP组RAGE蛋白表达升高(P<0.05)。提前1小时加入NF-κB拮抗剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(1-Pyrrolidinecarbodithioic Acid, PDTC)阻断NF-κB途径再加CRP作用内皮细胞发现RAGE蛋白表达较CRP组下降(P<0.05)。CRP和WY14643共作用组RAGE蛋白表达较CRP组下降(P<0.05)。2) RT-PCR检测RAGE mRNA表达与对照组相比,CRP组RAGE mRNA表达升高(P<0.01)。CRP与PDTC共作用组RAGE mRNA表达较CRP组明显下降(P<0.01)。CRP与WY14643共作用组RAGE mRNA表达较CRP组明显下降(P<0.01)。3) ELISA检测磷酸化NF-κB p65水平与对照组比较,CRP组磷酸化NF-κB p65水平升高(P<0.05)。CRP与PDTC共作用组及CRP与WY14643共作用组磷酸化NF-κB p65水平较CRP组明显下降(P<0.05)。4.CRP通过激活NF-κB诱导内皮细胞表达MCP-1,并可被WY14643抑制(ELISA法)ELISA检测MCP-1表达:与对照组比较,CRP组MCP-1水平明显升高(P<0.01)。CRP与PDTC共作用组或与WY14643共作用组MCP-1水平较CRP组明显下降(P<0.01)。【结论】:本实验结果提示CRP通过激活NF-κB途径诱导内皮细胞RAGE和MCP-1的表达。WY 14643可以从蛋白和mRNA水平抑制内皮细胞RAGE的表达,在一定程度内呈浓度-时间效应;并抑制CRP诱导内皮细胞RAGE和MCP-1的表达,从而阻断CRP-RAGE-MCP-1轴。为治疗加速动脉粥样硬化提供可能的途径。
王亚南[8]2016年在《糖肾清2号抑制糖尿病肾病免疫炎性损伤机制的探讨及临床疗效分析》文中研究指明目的：实验研究部分通过细胞培养及建立动物模型方法,深入探讨中药复方糖肾清2号调控AMPK信号通路抑制DN免疫炎性损伤的分子机制；临床研究部分评价糖肾清2号对肾阴亏虚、痰瘀热毒证DN患者的临床疗效及安全性。方法：体内实验研究部分：采用SPF级雄性KK-Ay小鼠,经高脂饲料诱导模型3周后,检测空腹血糖及24h尿蛋白水平,DN模型诱导成功标准为：空腹血糖≥13.9mmol/L,24h尿蛋白高于正常组。将30只模型成功KK-Ay小鼠随机分为模型组,阳性药组,糖肾清2号大、中、小剂量组,每组各6只,以6只雄性C57BL/6J小鼠设为正常对照组。中药各组按照所含生药量,分别予糖肾清2号40.66g . kg-1 . d、20.33g. kg-1.d、 10.17g.kg-1.d剂量灌胃,阳性药组予缬沙坦13.33mg . kg-1 . d剂量灌胃,空白对照组及模型组去离子水0.1ml/10g.d灌胃。各组小鼠每日灌胃1次,连续12周。治疗结束后,留取各组小鼠血清及肾组织标本。以RT-PCR技术检测肾组织AMPKα1、ADPN、NF-κB p65、iNOS、MCP-1、TNF-α、IL-6 mRNA转录水平；Western Blot技术检测肾组织AMPKα1、 ADPN、NF-κB p65、iNOS蛋白表达水平；ELISA技术检测IL-6、MCP-1、TNF-α蛋白表达水平；免疫组化技术检测肾组织AMPKα1、ADPN、NF-κB p65、iNOS蛋白表达水平。体外实验研究部分：采用小鼠肾小球系膜细胞株SV40 MES 13,在5%C02,37-C恒温培养箱常规培养。实验分组：空白对照组(D-葡萄糖5.6mmol/L)、高糖组(D-葡萄糖30mmol/L).高糖+TSQ5μmol/L组,高糖+TSQ10μmol/L组,高糖+TSQ20μmol/L组,共同孵育12h、24h、36h进行指标检测。RT-PCR技术检测肾小球系膜细胞AMPKα1、IκBα、 TLR4mRNA转录水平；Western-blot技术检测肾小球系膜细胞株AMPKα1、IκBα、TLR4的蛋白表达水平。临床研究部分：预计收集DN Ⅲ、Ⅳ肾阴亏虚、痰瘀热毒证患者80例。符合设定的纳入标准、排除标准及剔除标准。入组前按1：1比例随机分为治疗组或对照组。治疗组口服糖肾清2号煎剂,每日一剂。对照组口服缬沙坦片,每日一次,每次80mg。疗程为3个月。治疗前需详细记录入组患者姓名、性别、年龄、身高、体重、DN病程、合并用药及合并症等信息。治疗前后需记录DN患者血脂、尿蛋白、血糖等临床检查指标、中医临床症状、舌象及脉象等变化情况。治疗结束后根据疗效评价标准,分析两组患者临床疗效性指标及中医临床症状积分变化情况,分析讨论糖肾清2号的临床疗效。结果：体内实验研究部分：RT-PCR检测结果：与正常组比较,模型组小鼠抑炎因子AMPKα1、ADPNmRNA转录水平明显下降,有显着统计学差异(P<0.01)。与模型组比较,阳性药组及中药大、中组AMPKα1mRNA表达上调,有显着统计学意义(P<0.01),阳性药组、中药中组ADPNmRNA表达水平上调,有统计学差异(P<0.01,P<0.05)。与正常组比较,模型组促炎因子NF-κBp65、IL-6、TNF-α、iNOS、MCP-1mRNA表达水平明显升高,有显着统计学差异(P<0.01)。与模型组比较,阳性药组及中药各.剂量组NF-κBp65、IL-6、TNF-α、MCP-1mRNA转录水平显着下调(P<0.01)；阳性药组、中药大组及中药中组iNOS mRNA转录水平下调(P<0.01, P<0.05)。Western Blot及ELISA检测结果：与正常对照组比较,模型组抑炎因子AMPKα1、ADPN蛋白表达水平明显下降,有显着统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,阳性药组及中药各组AMPKα1蛋白表达显着上调(P<0.01,P<0.05)；阳性药组ADPN蛋白表达水平显着上调(P<0.01),中药各组无统计学差异(P>0.05)。与正常组比较,模型组促炎因子NF-κB p65、iNOS、IL-6、MCP-1、TNF-α蛋白表达水平明显升高,有显着统计学差异(P<0.01)。与模型组比较,阳性药组及中药各剂量组NF-κBp65、IL-6、MCP-1、TNF-a蛋白表达水平下调,有统计学意义(P<0.01,P<0.05)；阳性药组及中药大组iNOS蛋白表达水平显着下调(P<0.01,P<0.05)。免疫组化结果：与正常组比较,模型组AMPKα1、 ADPN蛋白表达水平显着下降(P<0.01), NF-κBp65、 iNOS蛋白表达水平明显升高(P<0.01,P<0.05)。与模型组比较,各药物组AMPKα1蛋白表达显着上调(P<0.01)；阳性药组、中药大组、中药小组ADPN蛋白表达水平上调(P<0.01,P<0.05)；阳性药组、中药大组NF-κBp65蛋白表达水平下调(P<0.01)；阳性药组、中药大组、中药小组iNOS蛋白表达水平下调(P<0.05)。体外实验研究部分：RT-PCR检测结果：与正常组比较,高糖组AMPKal mRNA转录水平在12h、36h时下调(P<0.05), IκBα mRNA转录水平在12h、24h下调,有统计学意义(P<0.01, P<0.05), TLR4mRNA转录水平36h时显着上调(P<0.01)。与高糖组比较,TSQ 5μmol/L组AMPKα1 mRNA转录水平在12h、36h上调(P<0.01, P<0.05),IκBαmRNA转录水平在24h上调(P<0.05)；TSQ 20μmol/L组AMPKalmRNA转录水平在12h时显着上调(P<0.01), IκBαmRNA转录水平在12h时上调(P<0.05)。各治疗组TLR4mRNA转录水平在36h下调,有显着统计学差异(P<0.01)。Western Blot检测结果：与正常组比较,高糖组AMPKal蛋白表达水平在12h-36h时下调(P<0.01, P<0.05),IκBα蛋白表达水平在12h-36h显着下调(P<0.01), TLR4蛋白表达水平在12h、36h显着增高(P<0.01)。与高糖组比较,TSQ 5μmol/L组AMPKα1、IκBa蛋白表达水平在12h-36h时上调(P<0.01,P<0.05)。TSQ 10μmol/L组AMPKal蛋白表达水平在12h、36h上调(P<0.01, P<0.05);IκBa蛋白表达水平在12h-36h显着上调(P<0.01); TLR4蛋白表达水平在12h时下调(P<0.01). TSQ20μmol/L组AMPKal表达水平在12h-36h上调(P<0.05), IKBa蛋白表达水平在24h时上调(P<0.05), TLR4蛋白表达水平在12h及36h下调,有显着统计学差异(P<0.01)。临床研究部分：预计收集Ⅲ、Ⅳ期糖尿病肾病肾阴亏虚、痰瘀热毒证患者80例,实际67例患者完成本次临床观察。①患者一般资料：67例Ⅲ、Ⅳ期DN,随机分为糖肾清2号治疗组34例,缬沙坦对照组33例。治疗组中男性17例,女性17例,平均年龄55.88±7.61岁；对照组中男性18例,女性15例,平均年龄56.08±6.54岁。67例DN患者中符合DNⅢ诊断标准者31例,符合DNⅣ期诊断标准者36例。在DNⅢ期患者中,女性患者比例高于男性,DNⅣ期患者中男性患者比例高于女性。②舌质分布情况：DN Ⅲ、Ⅳ期患者舌质分布规律趋于一致,出现频率最高的是暗红舌,其次为红或淡红舌、紫暗舌,部分患者出现胖大舌,少津,提示在DN Ⅲ、Ⅳ期多见痰瘀证之暗红舌,阴虚之红舌,内有瘀热而出现少津表现。③舌苔分布规律：DN Ⅲ-Ⅳ期舌苔出现频率最高的是薄黄苔,其次为黄腻苔、白腻苔、薄白苔,并出现提示阴虚津少之少苔、花剥苔,表明在DN Ⅲ-Ⅳ期除阴虚之象,痰湿、湿热证候的舌象分布较为普遍。④脉象分布情况：DN ⅢⅣ期出现频率最高的脉象为弦滑脉,其次为沉滑脉,代表阴虚证候的细数脉也占一定比例,滑脉表现较为突出。⑤糖肾清2号临床疗效评价：与治疗前比较,糖肾清2号组Scr水平、24h尿蛋白及尿微量白蛋白水平下降,有统计学差异(P<0.05), TC、LDL水平明显下降(P<0.01,P<0.05)。与对照组治疗后比较,糖肾清2号组Scr、TC、TG、24h尿蛋白、尿微量白蛋白水平下降明显,有统计学差异(P<0.05),临床总有效率达73.53%。⑥糖肾清2号中医证候疗效评定：与治疗前比较,糖肾清2号组中医症状积分明显下降,有统计学差异(P<0.01),34例患者中显效1例,有效25例,总有效率达76.47%。治疗过程中两组患者空腹血糖、餐后2h血糖、糖化血红蛋白等指标监测均控制在合理水平,血、尿、便常规及肝功能等安全性指标无明显变化。治疗过程中,糖肾清2号组无不良事件发生。结论：糖肾清2号通过发挥AMPK激活剂作用,降低促炎因子表达水平,可有效减轻DN肾组织免疫炎性病理损伤；糖肾清2号针对DN病因病机,可明显改善DN患者临床症状,有效降低尿蛋白、保护肾功能。
赵蓓[9]2009年在《辛伐他汀对糖基化终产物诱导心肌微血管内皮细胞表达MCP-１和ICAM-1的影响及机制探讨》文中研究说明实验背景及目的糖尿病引起的严重动脉粥样硬化已成为其高发病率及致死率的主要原因。糖尿病心肌病作为糖尿病心血管并发症,已公认是最为常见和最严重的糖尿病慢性并发症之一。心肌微血管内皮细胞(cardiac microvascular en-dothelial cells,CMECs)作为其发病的始动环节,具有不同于心脏血管内皮细胞的多种功能特异性,故CMECs的研究对诠释糖尿病心肌微血管病变的发病机制,及研究新的治疗方法和评价新的治疗药物都具有重要的价值。糖尿病是一种慢性免疫炎症反应。既往研究表明,体内长期高糖所致的蛋白质的非酶糖化反应产物,糖基化终产物(advanced glycation end pro-ducts,AGEs)是糖尿病并发症的重要致病因素。它与其特异性受体(receptorfor advanced glycation end products,RAGE)信号转导机制可导致持续的炎性反应。AGEs与RAGE结合,可激活多种细胞信号转导通路,导致大量促炎症因子的释放,诱发血管的炎性损伤。既往AGEs-RAGE作用系统的研究多集中在糖尿病大血管,但目前发现AGEs-RAGE轴效应同样作用于糖尿病微血管病变。故阻断AGEs-RAGE信号系统已公认为是未来治疗糖尿病慢性并发症的重要靶点。羟甲基戊二酰辅酶A(3-hydroxy-3-methylgutaryl coenzyme A,HMG-CoA)还原酶抑制剂他汀(Statins)已证实具有免疫调节及抗动脉硬化功能。近几年不少学者开始关注他汀对糖尿病血管炎性病变的治疗作用。结果发现他汀不仅在临床上明显降低了糖尿病患者心血管事件的发生率,也在细胞水平上发挥了调节和改善内皮功能的作用。最近还发现他汀可调节微血管内皮细胞AGEs-RAGE信号系统,但具体机制不是十分清楚。因此我们假设他汀是否可通过影响CMECs AGEs-RAGE信号系统来发挥抗心肌微血管动脉硬化的作用。本实验在体外培养CMECs的基础上,观察AGEs对CMECs表达单核细胞趋化因子-1(monocyte chemoattracta,nt protein-1,MCP-1)、细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)及RAGE的影响;观察羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂辛伐他汀(simvastatin)干预后,对AGEs诱导CMECs表达MCP-1、ICAM-1及RAGE的影响,并进一步探讨其可能机制。为他汀治疗糖尿病心肌微血管病变提供新的实验依据。实验方法第一部分:大鼠CMECs的体外培养、鉴定及AGEs的制备。1.无菌剪取大鼠心脏左心室,去除内、外膜,用酶消化法分离CMECs,并接种于铺有鼠尾胶的培养皿中培养5～7天(d)后消化传代。根据细胞形态,并通过Ⅷ因子的表达、DiI-Ac-LDL的摄取进行鉴定,并计算阳性率。2.将一定量牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、D-葡萄糖混合均匀,过滤除菌后封口密闭。同时设置无D-葡萄糖的BSA对照组。于37℃孵箱内避光孵育12周,获得棕色产物AGE-BSA。应用透析袋除去未结合蛋白的葡萄糖。根据AGEs特有的荧光特性,用荧光分光光度计,以激发波365nm,发射波长460nm测定其中所含的荧光单位。第二部分:AGEs对CMECs表达MCP-1和ICAM-1的影响及机制。取2代细胞,按实验要求分成若干组,分别加入不同浓度AGEs共培养72小时(h)后,用酶联免疫检测(enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA)法检测MCP-1的表达,流式细胞仪(flow cytometry,FCM)测定ICAM-1的表达,逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法测定RAGEmRNA的表达及Western-blot法检测RAGE蛋白表达。第叁部分:Simvastatin对AGEs诱导CMECs表达MCP-1和ICAM-1的影响及机制。取2代细胞,按实验要求分成若干组,先分别加入不同浓度Simvastatin预孵6h,再加AGEs共培养72h后,用ELISA法检测MCP-1的表达,FCM测定ICAM-1的表达,RT-PCR法测定RAGE mRNA的表达及Western-blot法检测RAGE蛋白表达。实验结果1.采用酶消化法成功分离出CMECs,并在培养的第2～3d可形成管样结构,5～7d融合呈典型的“铺路石”样形态。第Ⅷ因子阳性表达率是90.68%,DiI-Ac-LDL摄取阳性率为93.82%。在体外经非酶促反应制备的AGE-BSA经荧光分光光度计鉴定AGEs的含量为218U/mg蛋白,对照组白蛋白AGEs的含量为0.65U/mg蛋白。2.与BSA对照组比较,不同浓度的AGEs可显着增加CMECs MCP-1和ICAM-1的表达(P＜0.05),且在蛋白及mRNA水平均明显增加RAGE的表达(P＜0.05),呈浓度依赖性。3.与单纯AGEs作用组比较,小剂量Simvastatin(0.1μmol/L、1μmol/L)明显抑制AGEs诱导的CMECs表达ICAM-1、MCP-1的增加(P＜0.05),且在蛋白及mRNA水平均明显抑制RAGE的表达(P＜0.05)。结论1.AGEs可刺激CMECs过表达ICAM-1和MCP-1,从而加速心肌微血管炎症的发生。其机制可能是通过AGEs上调CMECs RAGE的表达。也进一步证实了AGEs-RAGE信号系统的起动是糖尿病心肌微血管病变发生发展一个重要原因。2.小剂量Simvastatin可抑制AGEs诱导CMECs表达MCP-1和ICAM-1。其可能机制是通过下调CMECs RAGE的表达,说明Simvastatin可通过调节AGEs-RAGE信号途径来发挥其对糖尿病心肌微血管病变的保护作用。
茅彩萍[10]2003年在《葛根素对糖尿病血管并发症的作用及其机制的实验研究》文中研究指明第一部分、葛根素对糖尿病血管并发症大鼠的作用及其机制研究目的：观察葛根素对糖尿病血管并发症(Diabetic vascular complications,DVC)大鼠血糖、胰岛素敏感性及ET、NO、ox-LDL、sICAM-1等细胞因子、主动脉AGEs含量及受体(RAGE)mRNA的表达以及形态学变化等的影响，探讨葛根素对DVC大鼠的作用及其机制。方法：一次性给大鼠ip.链脲菌素(STZ)60mg·kg~(-1)，造成糖尿病模型大鼠。72h后若血糖值≥16.7mM者则纳入糖尿病大鼠，造模大鼠按血糖值范围分为模型组、葛根素组(500，250，125mg·kg~(-1)，ig.)和氨基胍组(0.1g·kg~(-1)，ig.)，另设一正常对照组，连续灌胃给药12周。于给药后8周、12周，分别称取大鼠体重、葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖、放免法测定血清胰岛素并计算胰岛素敏感性指数，放免法测定血清果糖胺、尿微量白蛋白、血浆ET、ANF的水平、TNF-α的含量以及硝酸还原酶法测定血清NO、NOS，ELISA法测定sICAM-1、ox-LDL含量；荧光法测定主动脉内AGEs的含量，RT-PCR检测各组主动脉内RAGE mRNA的表达情况；光镜(HE及PAS染色)和透射电镜观察主动脉血管内皮细胞和肾组织形态的改变。结果：不同剂量葛根素均能明显改善糖尿病大鼠“叁多一少”症状，有效降低空腹血糖和血清胰岛素，改善胰岛素敏感性，减少果糖胺及尿微量白蛋白的形成，尤以大、中剂量作用更明显(P＜0.01)；葛根素和氨基胍组均能显着升高DVC大鼠血清NO、NOS的含量，有效降低ET和ANF的含量、血清sICAM-1、TNF-α、ox-LDL的含量；葛根素在减少AGEs在主动脉过度沉积的同时，还能显着抑制RAGEmRNA的过高表达(P＜0.01)；形态学结果显示：葛根素治疗后能明显减轻血管内皮细胞的肿胀程度，平滑肌细胞排列也较整齐，内皮细胞表面光滑等；肾小球毛细血管恢复成圈襻状或环形，肾小管大部分透明变消失，电镜下也观察到血管基底膜增厚不明显，足细胞似正常，足突融合少见(P＜0.01)。结论：葛根素通过降低DVC大鼠血糖、提高胰岛素敏感性、减少AGEs的沉积、改善细胞因子的表达等途径对糖尿病血管并发症所引起的结构和功能改变产生一定的防治作用。
参考文献：
[1]. 糖基化终产物对内皮细胞RAGE基因转录调控的影响及其信号转导的探讨[D]. 张建伟. 中国协和医科大学. 2001
[2]. 晚期糖化终产物受体在炎症性血管损伤中的作用[D]. 游捷. 福建医科大学. 2006
[3]. 葡萄籽原花青素对内皮细胞直接作用及对糖基化损伤内皮细胞的影响[D]. 马丽. 山东大学. 2007
[4]. 中药有效组分配伍调控p38MAPK通路改善糖尿病心肌病的机理研究[D]. 相田园. 中国中医科学院. 2016
[5]. DM大鼠甲状腺组织超微结构和功能相关mRNA表达的变化及干预研究[D]. 王瑞青. 天津医科大学. 2008
[6]. 天然抗氧化物拮抗胰岛素抵抗的分子靶点筛选[D]. 郑锦花. 吉林大学. 2011
[7]. C-反应蛋白诱导晚期糖基化终产物受体表达的信号途径及其干预研究[D]. 罗翊芝. 广州医学院. 2009
[8]. 糖肾清2号抑制糖尿病肾病免疫炎性损伤机制的探讨及临床疗效分析[D]. 王亚南. 北京中医药大学. 2016
[9]. 辛伐他汀对糖基化终产物诱导心肌微血管内皮细胞表达MCP-１和ICAM-1的影响及机制探讨[D]. 赵蓓. 第四军医大学. 2009
[10]. 葛根素对糖尿病血管并发症的作用及其机制的实验研究[D]. 茅彩萍. 苏州大学. 2003