（威海市立医院血液科；山东威海264200）
摘要：目的：对两种巢式聚合酶链反应（PCR）对骨髓移植后慢性白细胞血病（CML）微小残留病检测中的应用价值进行分析探讨。方法：以我院2013年1月～2016年12月收治的36例BMT后CML患者作为研究对象，对患者分别行一步法RT-PCR检测及二步法RT-PCR检测，对比两种检测方法的灵敏度。结果：一步法RT-PCR可检出0.1pg的K562细胞的总RNA中BCR-ABL融合基因。二步法RT-PCR可检出1pg的K562细胞的总RNA中BCR-ABL融合基因。结论：对骨髓移植后CML微小残留病采用一步法RT-PCR巢式检查法具有操作简便、灵敏度高等优点，值得临床应用推广。
关键词：巢式PCR；慢性粒细胞白血病；骨髓移植；微小残留病
骨髓移植（bone marrow transplantation, BMT为唯一可治愈慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia, CML）的方法。然而BMT后，因患者体内有白血病细胞残留，即微小残留病（minimal residual disease, MRD），容易引起白血病复发[1]。MRD检查与研究对于BMT复发的预防、监测及预后判断具有重要价值。临床常用的检测方法主要包括费城染色体分析、巢式PCR检测及荧光原位杂交法（fluorescence in situ hybridization, FISH）等。但是，染色体分析及FISH法因检测所需时间较长，灵敏度低等，限制了其在临床上的应用。为了进一步对CML患者BMT后MRD的检测方法进行分析探讨，笔者对我院2013年1月～2016年12月收治的36例BMT后CML患者的临床资料进行回顾性分析，现报道如下：
1资料与方法
1.1一般资料
以我院2013年1月～2016年12月收治的36例BMT后CML患者作为观察组，其中男21例，女15例；年龄为12～59岁，平均年龄为（33.6±4.1）岁。以同期在我院进行健康体检的50例志愿者作为对照组，其中男29例，女21例；年龄为19～61岁，平均年龄为（35.5±4.9）岁。两组患者的性别及年龄等基本资料均无明显差异（P>0.05）。
1.2方法
①标本采集与制备：抽取骨髓5mL，以淋巴细胞分离液将骨髓单个核细胞分离，洗涤两次之后，放于液氮保存。在检测时，将标本置于37℃水浴进行快速溶解，洗涤2次之后备用。以Trizol试剂对细胞总RNA进行提取，在对细胞匀浆之后，加入氯仿，离心处理15分钟，速度为13000r/min。获取RNA层，以异丙醇进行沉淀，以乙醇（75%）进行洗涤，使其溶解于无RNA酶水，放于冰上备用。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆在RNA浓度检测时，取RNA溶液，检测吸光度（A260nm）值。按照A260nm=1 RNA溶液的每毫升RNA含量为40μg可得RNA浓度。
②巢式PCR检测BCR-ABL融合基因：扩增BCR-ABL融合基因引物序列由Life Technologies 公司提供，具体见参考文献[2]。RT-PCR内参照为β-actin，其扩增产物为587bp。一步法RT-PCR巢式PCR：反应试剂盒为Roche公司生产，严格按照操作手册进行。50μL反应体系：总RNA为1μg，引物浓度0.4μmol/L；dNP为200μmol/L，DTT 5mmol/L ，RNA酶抑制剂0.1U/μL，酶混合物为1μL。置于循环加热器行PCR，热循环35个。之后，取1μL扩增产物行2次PCR。50μL反应体系：引物浓度1μmol/L，DNA聚合酶为0.025U/μL，dNTP200μmol/L。反应条件同第一次。取12μL的PCR产物放于琼脂糖凝胶内电泳，以凝胶分析仪分析。
两步法RT-PCR巢式PCR：以10μL cDNA 行PCR，条件同一步法相同。在反应之后，取1μL产物行2次PCR，条件同一步法的2次PCR的条件相同。取12μL的PCR产物放于琼脂糖凝胶内电泳，以凝胶分析仪分析。
③对1μg的K562细胞的总RNA以对照组1μg/μl的总RNA以1:9的比例进行稀释至1:108，以引物A、B行一步法与两步法RT-PCR，取PCR产物，再以引物C、D行2次PCR检测。
1.3观察指标
对比两种检测方法的灵敏度。
1.4统计学处理
将所得数据录入SPSS22.0软件包，计数资料以X2检验，以例数百分比形式表达，计量资料以t检验，以X±S的形式表示，当P<0.05时，差异具有统计学意义。
2结果
K562细胞的总RNA经引物A、B行RT-PCR之后，出现374产物，一步法RT-PCR检出至稀释度1:105，表明反应能够检测出10pg的K562的总RNA中BCR-ABL融合基因，两步法RT-PCR能够检测出稀释度1:103,表明反应能够检测出1000pg的K562细胞的总RNA中BCR-ABL融合基因。以引物C、D对两种RT-PCR的产物分别行2次PCR之后，均产生200bp产物，一步法RT-PCR可检出稀释度为1:107,即可检出0.1pg的K562细胞的总RNA中BCR-ABL融合基因。二步法RT-PCR可检出稀释度为1:106, 即可检出1pg的K562细胞的总RNA中BCR-ABL融合基因。
3讨论
MRD监测为发现白血病复发的重要手段，以巢式PCR进行BCR-ABL融合基因检测是确定患者MRD的一个重要方法。RT-PCR引物使得PCR特异性较高，2次PCR可进一步提高检测特异性。一步法RT-PCR可将RT反应同PCR处于一个体系，不必像两步法RT-PCR那样加入随机引物，在逆转录反应之后，能够生成高浓度cDNA链，进而提高反应特异性。除此之外，还可充分利用体系内dNTP。
综上所述，对骨髓移植后CML微小残留病采用一步法RT-PCR巢式检查法具有操作简便、灵敏度高等优点，值得临床应用推广。
参考文献：
[1]霍菲菲，刘欣，孙自敏，等.实时荧光定量聚合酶链反应动态检测慢性粒细胞白血病治疗后微小残留病的研究[J].白血病淋巴瘤，2012,21（4）：199-202
[2]赵晶晶，王颖，张文伟，等.使用Taqman技术监测慢性粒细胞白血病患者微小残留病灶[J].分子诊断与治疗杂志，2014,6（4）：239-240
论文作者:于洁, 王晓毅
论文发表刊物:《医师在线》2017年5月下第10期
论文发表时间:2017/7/7
标签：步法论文; 引物论文; 检出论文; 骨髓移植论文; 细胞论文; 产物论文; 微小论文; 《医师在线》2017年5月下第10期论文;